基于海馬區(qū)BDNF的變化研究電針調(diào)控外源性NSCs治療PSCI的作用及機制

陳吉祥 張瑾 張順喜 王世雄 任靜 李國燕 陳俊輝

廣州市第一人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科 510180

卒中后認(rèn)知障礙（post-stroke cognitive impairment，PSCI）是指腦卒中后6個月內(nèi)出現(xiàn)達到認(rèn)知障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)的一系列綜合征［1］。國內(nèi)外相關(guān)研究顯示，腦卒中后47.30%～80.97%患者發(fā)生PSCI［2-3］。PSCI不僅影響腦卒中患者對外界環(huán)境的感知和適應(yīng)能力，同時嚴(yán)重阻礙患者運動、語言、吞咽等各方面功能的恢復(fù)，成為制約腦卒中患者全面康復(fù)的關(guān)鍵因素［4］。目前，PSCI常用治療方法主要包括藥物療法以及認(rèn)知康復(fù)訓(xùn)練，雖然這些方法具有一定療效，但總體而言療效較有限，且對于重癥患者療效不佳［5-6］。近年，神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）移植有望成為改善PSCI、治療腦卒中的新技術(shù)［7］。但是，NSCs移植存在細(xì)胞存活率低，向損傷部位遷移和分化不足的問題，如何調(diào)控NSCs并闡明其作用機制對NSCs移植改善PSCI、治療腦卒中具有重要科學(xué)意義［8］。前期研究表明，電針可促進大腦中動脈閉塞模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠海馬區(qū)內(nèi)源性NSCs的增殖和分化改善PSCI［9］，表明電針具有調(diào)節(jié)內(nèi)源性NSCs作用，那么，電針是否能通過調(diào)節(jié)外源性NSCs向認(rèn)知相關(guān)腦區(qū)遷移和分化治療PSCI？此外，微環(huán)境對NSCs的存活、遷移和分化至關(guān)重要［10］，而我們前期研究也表明，電針具有調(diào)節(jié)NSCs微環(huán)境中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）作用［11］，那么電針是否基于調(diào)節(jié)BDNF從而調(diào)控外源性NSCs的遷移和分化？本研究擬通過認(rèn)知評估和蛋白檢測技術(shù)等初步探討該科學(xué)問題，以期為改善PSCI、促進腦卒中患者全面康復(fù)提供電針+NSCs移植這一新的治療技術(shù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器BDNF抗體（Abcam）；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）免疫組化試劑盒（福州邁新生物科技有限公司）；β-肌動蛋白（β-actin）抗體以及辣根過氧化物酶二抗（Cell Signaling Technology，USA）；Morris水迷宮（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）；Image-lab圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）。

1.2 實驗動物及分組雄性健康成年無特殊病原體（SPF）級SD大鼠，由上海斯萊克實驗動物責(zé)任有限公司提供，體質(zhì)量（230±20）g，6～8周齡，實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。參照此前發(fā)表文章中所采用的改良Zea Longa方法［12］，制備左側(cè)MCAO：大鼠稱重后，用10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔麻醉，仰臥位固定、消毒、備皮，切開頸部正中皮膚，充分暴露并鈍性分離左側(cè)頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈。在頸內(nèi)、外動脈分叉處結(jié)扎頸外動脈，在近心端結(jié)扎頸總動脈。用動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，然后在頸總動脈結(jié)扎處遠端約3 mm處剪一小口，將備好的線栓經(jīng)切口導(dǎo)入18～22 mm，撤去頸內(nèi)動脈血管夾，緩慢推動栓線至大腦前動脈近端。固定栓線，縫合傷口，待缺血2 h后回抽栓線至頸總動脈分叉處，形成缺血再灌注模型。動物蘇醒后觀察其體態(tài)及行為，按Zea Longa評分標(biāo)準(zhǔn)評價動物的行為變化以判斷MCAO是否成功。具體評分標(biāo)準(zhǔn)為：無神經(jīng)功能缺失癥狀為0分；提尾倒懸時不能完全伸展右側(cè)前爪為1分；行走時向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈（向右側(cè)轉(zhuǎn)圈）為2分；行走時向右側(cè)傾倒為3分；不能自發(fā)行走，意識喪失評分為4分。評分為1～3分納入實驗，剔除0分、4分。共成功制備24只MCAO。將大鼠配對分為3組：模型組（8只）、NSCs移植組（8只）、電針+NSCs移植組（8只）；由于造模后部分大鼠死亡，最終各組取6只大鼠進行數(shù)據(jù)分析。

1.3 干預(yù)措施模型組只給予同等條件下飼養(yǎng)以及抓取固定，不給予其他治療。NSCs移植組以及電針+NSCs移植組在造模術(shù)后第2天行NSCs移植治療，其中NSCs移植組在NSCs移植后予同等條件下飼養(yǎng)以及抓取固定，電針+NSCs移植組在NSCs移植組基礎(chǔ)上聯(lián)合行電針治療。電針參考《實驗針灸學(xué)》［13］取大鼠百會穴，使用華佗牌30號0.5寸毫針，G6805電針儀，電壓峰值6 V，以針體輕輕抖動為度，疏密波，頻率1～20 Hz，20 min/次，1次/d，共電針治療7 d。參考相關(guān)文獻報道方法行NSCs分離、培養(yǎng)和移植［14］：取新生3 d的SD大鼠用于提取NSCs，將其喂養(yǎng)14 d后，10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射進行麻醉，無菌條件下處死后取鼠腦，解剖顯微鏡下剝除腦膜、腦血管后，得到大腦海馬組織，置于Hank’s液漂洗剪碎，機械吹打后形成細(xì)胞懸液。16 000 r/min，離心半徑7.2 cm，離心5 min棄上清液，選取沉淀物繼續(xù)吹打形成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×109/L后，將其接種于25 ml無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)。滴入含20 μg/L的表皮生長因子+20 μg/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子+2% B27 DMEM/F12培養(yǎng)基后，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2下培養(yǎng)，每3 d換液1次，至第10天細(xì)胞開始傳代。選取傳代后細(xì)胞接種于已涂5%多聚賴氨酸蓋玻片培養(yǎng)板上，待細(xì)胞貼壁置于磷酸鹽緩沖液洗5 min，免疫細(xì)胞化學(xué)法（ABC法）染色測定，將1：100濃度巢蛋白（nestin）抗體溶液測得陽性細(xì)胞作為NSCs。移植組大鼠造模成功后第2天進行NSCs移植，常規(guī)麻醉仰臥固定于手術(shù)臺，選擇腦立體定位儀對大鼠左側(cè)腦室進行定位，坐標(biāo)零點為前囟（Bregma）點，AP＝0.0 mm，ML＝2.0 mm，DV＝4.5 mm。微量注射器0.15 μl/s注入10 μl的NSCs，細(xì)胞濃度為2×1010/L，注射結(jié)束后留針20 min后拔出，電針+NSCs移植組選擇相同方法移植。

1.4 Morris水迷宮實驗參照我們此前發(fā)表文章中所采用的方法［12］，各組大鼠在造模手術(shù)后4～8 d進行Morris水迷宮實驗：其中術(shù)后4～7 d連續(xù)4 d進行定位航行實驗，觀察其逃避潛伏期和游泳路徑，評估大鼠的學(xué)習(xí)能力，4次/d，術(shù)后第8天進行空間探索實驗，觀察規(guī)定時間內(nèi)大鼠穿越平臺的次數(shù)，評估大鼠的空間記憶能力。具體實驗包括：（1）定位航行實驗。將大鼠按順時針方向依次由第一象限、第二象限、第三象限、第四象限入水點順序面向池壁放入水中。記錄90 s內(nèi)尋找平臺的時間（逃避潛伏期）。如果大鼠在90 s內(nèi)找到平臺，并停留3 s以上，記錄90 s內(nèi)實際逃避潛伏期；如果在90 s內(nèi)未找到平臺，由實驗者將其引上平臺并停留10 s，逃避潛伏期記錄為90 s。（2）空間探索實驗。定位航行實驗全部結(jié)束后，次日進行空間探索實驗。撤去平臺，然后選第一象限與定位航行實驗相同的入水點將大鼠面向池壁放入水中，分別記錄90 s內(nèi)大鼠穿越原平臺相應(yīng)位置的次數(shù)。Morris水迷宮監(jiān)測全過程通過安裝在Morris水迷宮上方的攝像機傳入電腦并記錄和儲存，再運用行為軌跡跟蹤系統(tǒng)軟件進行分析和數(shù)據(jù)處理。

1.5 實驗取材及蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測取左側(cè)海馬組織置于液氮罐中速凍，再置于-80℃冰箱保存。1 ml裂解緩沖液和10 μl苯甲基磺酰氟（PMSF）儲存液裂解100 mg左側(cè)海馬組織，充分研磨后離心，吸取上清。二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定法測定蛋白濃度。樣品蛋白變性后，取50 μg樣品蛋白經(jīng)12%十二烷基硫磺胺-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜后，用封閉液封閉2 h，分別用BDNF、β-actin一抗（1∶1 000）孵育，4℃過夜，TBST洗膜后，用辣根過氧化物標(biāo)記的二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h。將PVDF膜放圖像掃描儀上，避光配置顯色液并覆蓋PVDF膜，Image-lab圖像分析系統(tǒng)分析處理。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 18.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)均滿足方差齊性（P＞0.05），兩兩比較采用LSD法；以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮實驗評估學(xué)習(xí)記憶功能的結(jié)果與模型組相比，NSCs移植組大鼠逃避潛伏期時間縮短，表明NSCs移植組大鼠的學(xué)習(xí)能力較模型組大鼠提高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與NSCs移植組及模型組相比，電針+NSCs移植組大鼠逃避潛伏期時間縮短，表明電針+NSCs移植組大鼠較NSCs移植組大鼠學(xué)習(xí)能力更佳，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與模型組相比，NSCs移植組大鼠跨越平臺次數(shù)增加，表明NSCs移植組大鼠的記憶能力較模型組大鼠提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與NSCs移植組及模型組相比，電針+NSCs移植組大鼠跨越平臺次數(shù)增加，表明電針+NSCs移植組大鼠較NSCs移植組大鼠記憶能力更好，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 大腦中動脈閉塞模型大鼠逃避潛伏期及跨越平臺次數(shù)比較（）

表1 大腦中動脈閉塞模型大鼠逃避潛伏期及跨越平臺次數(shù)比較（）

注：模型組大鼠給予基礎(chǔ)飼養(yǎng)以及同等條件抓取固定，NSCs移植組采用NSCs移植治療，電針+NSCs移植組在NSCs移植基礎(chǔ)上行電針百會穴治療；NSCs為神經(jīng)干細(xì)胞；與模型組相比，aP＜0.05，bP＜0.01；與NSCs移植組及模型組相比，cP＜0.05

逃避潛伏期（s）穿越平臺次數(shù)（次）0.98±0.32 1.76±0.46b 2.28±0.35c組別模型組NSCs移植組電針+NSCs移植組只數(shù)第4天80.26±6.57 69.89±9.18a 58.56±8.64c 6 6 6第5天72.43±9.30 53.67±8.54a 50.66±9.20c第6天66.85±8.79 44.53±7.45b 39.43±7.39c第7天58.54±7.21 36.67±8.43b 29.76±6.32c

2.2 Western blot檢測大鼠海馬區(qū)BDNF蛋白表達的結(jié)果NSCs移植組大鼠海馬區(qū)BDNF蛋白表達量為（0.92±0.22），與模型組（0.86±0.25）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；電針+NSCs移植組大鼠海馬區(qū)BDNF蛋白表達量為（1.45±0.35），明顯高于NSCs移植組（0.92±0.22）、模型組（0.86±0.25），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；表明電針+NSCs移植可增加大鼠海馬區(qū)BDNF表達。見圖1。

圖1 大腦中動脈閉塞模型大鼠大腦海馬區(qū)BDNF蛋白表達印記

3 討 論

NSCs是一種具有自我更新和分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞能力的細(xì)胞，主要發(fā)現(xiàn)于成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特定區(qū)域如海馬齒狀回室管膜下區(qū)（SGZ）和側(cè)腦室顆粒下區(qū)（SVZ）［15］。相關(guān)研究已明確NSCs對細(xì)胞分化、免疫調(diào)節(jié)、炎癥和內(nèi)源性修復(fù)過程（例如血管生成和神經(jīng)發(fā)生）的影響［16-18］。進一步，研究人員利用NSCs移植改善卒中模型鼠的缺損功能，發(fā)現(xiàn)NSCs移植后大鼠的運動功能、學(xué)習(xí)記憶能力有一定的提高，并探索了不同移植方式、移植位點對移植效果影響的問題［19-20］。在這些前期實驗的基礎(chǔ)上，2016年《柳葉刀》發(fā)表了1篇首次應(yīng)用NSCs移植治療腦卒中的1期臨床研究文章，該研究采用手術(shù)方式將NSCs移植到11例腦梗死患者大腦病灶周邊區(qū)域，結(jié)果表明NSCs移植沒有誘發(fā)任何不良事件，且患者的神經(jīng)功能得到改善，研究結(jié)果支持進一步應(yīng)用NSCs移植治療腦卒中［21］。我們在該實驗中亦證實，與模型組大鼠相比，NSCs移植組大鼠在Morris水迷宮實驗中逃避潛伏期時間縮短，表明NSCs移植組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力有所提高。綜合相關(guān)研究結(jié)果表明，NSCs移植有望成為改善PSCI、治療腦卒中的新技術(shù)。

但是，NSCs移植存在細(xì)胞存活率低，向損傷部位遷移和分化不足的問題。如將NSCs移植至腦梗死中心區(qū)，2周后幾乎沒有NSCs存活，將NSCs移植至腦梗死區(qū)周邊區(qū)域時，其存活率僅為30%，且存在遷移和分化不足問題。這些因素限制了該技術(shù)的臨床應(yīng)用，因此，早期有研究指出如何促進NSCs移植細(xì)胞的存活、增殖、遷移和定向分化成為NSCs移植的關(guān)鍵［7-8］。

目前，NSCs的調(diào)控主要有2種思路，一種是增加NSCs自身的存活及增殖分化能力，主要通過基因修飾及藥物預(yù)處理等，這樣可以促進移植的NSCs在缺血、缺氧環(huán)境下的存活率［22］。另一種是改善腦缺血后的NSCs生存微環(huán)境（ME）［23］。所謂ME，在結(jié)構(gòu)上，包括微血管、血管周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、神經(jīng)前體細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等，在功能上，包含這些細(xì)胞或成分所分泌的各種因子及與神經(jīng)干/前體細(xì)胞之間的相互交融與作用［24］。腦缺血后，局部ME遭到破壞，如血腦屏障損害、微血管通透性改變、結(jié)構(gòu)紊亂、基底膜降解及多因子表達異常等，限制了NSCs存活、增殖、遷移和分化［7］。前一種思路類似于改善NSCs的“種子”思路，后一種思路類似于改善NSCs的“土壤”。目前對2種思路均進行了大量有益的探索，但離突破性的進展尚遠。我們的這項研究表明，電針可能具備改善NSCs的“土壤”作用。

電針是一種結(jié)合我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中經(jīng)絡(luò)學(xué)說和現(xiàn)代生物電理論的臨床應(yīng)用技術(shù)，既可以調(diào)節(jié)經(jīng)氣，疏通氣血，又是一種脈沖電場，故具有針刺和電場的雙重作用，目前已廣泛應(yīng)用于臨床治療腦血管疾病和科學(xué)研究。此前，我們通過激光共聚焦技術(shù)發(fā)現(xiàn)，電針能夠促進MCAO大鼠海馬區(qū)內(nèi)源性NSCs的增殖和分化［9］。海馬區(qū)與靈長類動物和嚙齒類動物的學(xué)習(xí)和記憶功能密切相關(guān)，常被用來作為探究正常、病理情況模型研究，包括對學(xué)習(xí)記憶障礙的研究。腦缺血后會出現(xiàn)相應(yīng)腦部萎縮、皮質(zhì)變薄、神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生病理性變化，當(dāng)這些情況發(fā)生在海馬等與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的腦區(qū)時，便會出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙［25］。因此，我們此前的這項研究表明，電針可作為一種干細(xì)胞調(diào)控技術(shù)，通過誘導(dǎo)海馬區(qū)內(nèi)源性NSCs的增殖和分化從而改善認(rèn)知功能。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)，與NSCs移植組及模型組相比，電針+NSCs移植組大鼠逃避潛伏期時間縮短，表明電針可進一步增強NSCs移植治療PSCI的效果。此外，我們在該研究中發(fā)現(xiàn)，與NSCs移植組及模型組相比，電針+NSCs移植組大鼠海馬區(qū)BDNF蛋白表達顯著增多。由于BDNF是NSCs微環(huán)境中促進NSCs增殖和分化的關(guān)鍵因子，它通過與NSCs的酪氨酸受體激酶B（TrkB）結(jié)合促進NSCs增殖和分化。因此我們認(rèn)為，電針可能基于調(diào)節(jié)海馬區(qū)BDNF的表達調(diào)控外源性NSCs從而改善PSCI。

但是，限于本實驗為初步實驗，機制研究尚不深入，一方面并未對移植的NSCs進行標(biāo)記示蹤及進一步的增殖分化分析，尚不能回答電針調(diào)控移植的NSCs增殖分化程度以及遷移路徑；另一方面，如前所述，NSCs的移植成功依賴于良好的干細(xì)胞生存微環(huán)境，這些微環(huán)境包括各種細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的結(jié)構(gòu)以及相關(guān)細(xì)胞因子。本實驗初步發(fā)現(xiàn)電針促進大鼠海馬區(qū)微環(huán)境中BDNF表達，但是對于電針是否對NSCs微環(huán)境其他因子以及相關(guān)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響尚不清楚。

綜上，結(jié)合相關(guān)研究及本實驗結(jié)果，我們認(rèn)為電針可能調(diào)節(jié)海馬區(qū)BDNF的表達調(diào)控外源性NSCs從而改善PSCI。但限于初步探索，本實驗的機制研究尚不深入。下一步，我們將采取NSCs示蹤技術(shù)以及免疫熒光技術(shù)深入探討電針如何調(diào)控移植的NSCs遷移以及增殖分化治療PSCI，并全面評估電針對NSCs微環(huán)境因子以及結(jié)構(gòu)的影響，并確定兩者的關(guān)系，從而為治療PSCI、促進腦卒中患者全面康復(fù)提供新的治療技術(shù)和理論支持。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。