高頻相移壓電石英凝血檢測系統(tǒng)

扶梅 司士輝＊ 馮浪霞 張潤

中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長沙 410083

0 引言

血液凝固[1]是由一系列不同凝血因子參與的免疫反應(yīng)過程，正常情況下的血液凝固能夠防止人體意外出血，而異常的血液凝固可能會(huì)伴隨中風(fēng)、血友病、新型冠狀肺炎等一系列危害人體生命健康的疾病[2-3]。臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)也通常根據(jù)病人血液凝固特性來篩選出一系列遺傳性疾病，如肝臟類、血栓性疾病等[4]。因此，凝血特性的檢驗(yàn)在一系列疾病防控中顯得尤為重要。臨床凝血特性的檢驗(yàn)設(shè)備有半自動(dòng)血凝儀和全自動(dòng)血凝儀[5]。半自動(dòng)血凝儀操作簡便、價(jià)格便宜，但檢測速度慢、精度低；全自動(dòng)血凝儀通道多、速度快、測量精度好，但價(jià)格昂貴、對操作人員素質(zhì)要求高。隨著國家醫(yī)療條件的不斷進(jìn)步，上述大型、復(fù)雜的血凝儀已不能滿足社區(qū)、家庭、現(xiàn)場急救等應(yīng)用場景下的需求，因而急需一種操作方便、成本低、應(yīng)用穩(wěn)定、結(jié)果可靠的實(shí)時(shí)在線檢驗(yàn)（point of care testing，POCT）設(shè)備來實(shí)現(xiàn)凝血監(jiān)測。當(dāng)前，實(shí)驗(yàn)室正在開發(fā)研究的小型便攜POCT凝血設(shè)備主要有：分光光度儀、石英晶體傳感器、磁彈性傳感器、表面等離子體共振儀等[6-9]。其中，石英晶體傳感器被證明是一種非常有用的血凝檢驗(yàn)儀器。傳統(tǒng)的石英晶體傳感器已被用于測定纖維蛋白原濃度[10]、凝血因子活性[11]和凝血時(shí)間[12-13]，具有實(shí)時(shí)輸出、無標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，但重復(fù)性和穩(wěn)定性不好。為了克服傳統(tǒng)石英晶體傳感器凝血監(jiān)測的缺陷，本文開發(fā)了一款高頻相移壓電石英傳感系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用高頻33 MHz壓電石英晶體研制而成，基于固定頻率相位響應(yīng)的信號表征方式，成功地實(shí)現(xiàn)了對凝血時(shí)間的實(shí)時(shí)在線檢測。

1 系統(tǒng)原理

傳統(tǒng)壓電石英晶體傳感器一般用傳感器的頻率來表征，頻率的變化需要連續(xù)掃頻來確定，而頻率掃描需要有最少的步長，每步長都需要時(shí)間，這使得連續(xù)數(shù)據(jù)采集擬合之間存在過渡時(shí)間。過渡時(shí)間越長，數(shù)據(jù)采集速度越慢，頻率的變化速度就越慢，將導(dǎo)致系統(tǒng)無法達(dá)到預(yù)期的測量精度，同時(shí)也影響了系統(tǒng)的穩(wěn)定性。本文使用固定頻率驅(qū)動(dòng)器[14]，在一組固定振幅和恒定頻率的位置被動(dòng)激勵(lì)傳感器，每次都由相同的重復(fù)過程觸發(fā)，省略了頻率掃描步驟，加快了數(shù)據(jù)采集速度。同時(shí)，采用相位測量的信號表征方式與頻率響應(yīng)相比，相位響應(yīng)不易停振，性能穩(wěn)定，靈敏度更高?；诠潭l率的相位響應(yīng)與負(fù)載質(zhì)量的關(guān)系[15]如下：

式中，Δφ表示相移，φ表示相位；Δmc=ρchc為表面涂層質(zhì)量變化，hc為涂層的厚度；ml為接觸液體的質(zhì)量，Δm1=ρ1δ1/2為表面溶液質(zhì)量變化，δ1=(2η1/ωρ1)1/2為波在液體中的穿透深度，ω為信號角頻率；mq=πηq/2vq為石英晶體的質(zhì)量，vq=(C66/ρq)1/2為波在石英晶體中的傳播速度，C66為石英晶體的壓電彈性常數(shù)，η和ρ為物質(zhì)的粘度和密度。由上式可知，相移與石英晶體表面接觸物質(zhì)的量有關(guān)，相位信號隨著質(zhì)量的變化而變化，可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)測量。

2 系統(tǒng)設(shè)計(jì)

2.1 系統(tǒng)的搭建

高頻相移壓電石英傳感系統(tǒng)主要由上位機(jī)控制器、Arduino Due微控制器、信號發(fā)生器、信號調(diào)理模塊、相敏檢波器、傳感元件等6部分器件組成，如圖1所示。該系統(tǒng)由3層電路板通過排針組裝而成，最上層為信號控制模板，Arduino Due微控制器連接上位機(jī)控制器，利用LabVIEW程序控制系統(tǒng)運(yùn)行；中間層為信號調(diào)理模板，采用低通濾波器、信號放大器和信號衰減器等對信號進(jìn)行調(diào)理和優(yōu)化；下層板為信號產(chǎn)生和采集模板，包括信號發(fā)生器、相敏檢波器和傳感元件等。信號發(fā)生器是該系統(tǒng)的重要部件，其以石英晶體作為參考時(shí)鐘源，基于直接數(shù)字頻率合成（DDS）技術(shù)，采用AD9910芯片實(shí)現(xiàn)正弦波激勵(lì)和信號合成。相敏檢波器的功能是將信號進(jìn)行采集、鑒別、調(diào)制，輸送至Arduino Due微控制器進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，最終由LED液晶顯示屏實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯示。壓電石英晶體是該系統(tǒng)的傳感元件，可用于監(jiān)測系統(tǒng)的信息變化。PID控溫器的作用是在測試時(shí)對系統(tǒng)進(jìn)行精確控溫，保持凝血因子的活性。

2.2 一次性血凝檢測片的設(shè)計(jì)

石英晶體作為傳感器的核心元件，其結(jié)構(gòu)對傳感器的性能具有重要的作用。近年來，為了提高儀器的靈敏度，科研工作者們開展了眾多對高頻石英晶體傳感器的研究[16-17]。實(shí)驗(yàn)表明，提高基頻能夠提高儀器的響應(yīng)靈敏度，但是提高基頻必須減小石英晶片的厚度，而石英晶片越薄，機(jī)械性能越差，加工和封裝工藝越復(fù)雜。為了滿足日常生活中對高頻器件的要求，通常在電路中采用倍頻技術(shù)和泛音晶體[18]。本文使用33 MHz壓電石英晶體，采用第三泛音模式（99 MHz）驅(qū)動(dòng)，以實(shí)現(xiàn)高頻100 MHz的目的。與基頻100 MHz石英晶體相比，33 MHz石英晶體晶片尺寸更大，操作更方便，成本更低。

本文利用33 MHz薄片式鍍銀石英晶體作為傳感元件，自制了一次性微型檢測片，如圖2所示。根據(jù)石英晶體的直徑，用打孔器將薄膠片打出相應(yīng)大小的孔洞，將石英晶體薄片粘貼在鑲嵌有銅電極的塑料片上。與傳統(tǒng)檢測池[19]相比，該檢測片小巧便攜、安裝方便，有利于更好地實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)現(xiàn)場檢測。

由于石英晶體表面電極是疏水性的，凝血因子不能完全吸附在其表面，反應(yīng)時(shí)血液不與石英晶體充分接觸，因而檢測到的響應(yīng)不完全。為了解決這一問題，需要對石英晶體進(jìn)行表面改性[20]。聚苯乙烯是一種價(jià)格便宜、性能穩(wěn)定的高分子聚合物，即使在較高的涂層厚度下也不會(huì)產(chǎn)生明顯的阻尼而影響傳感器性能，且修飾過程方便、快速，修飾后的表面均勻、光滑，可以通過物理吸附結(jié)合抗原、抗體。因此，本文采用聚苯乙烯的氯仿溶液[21]修飾石英晶體，將凝血試劑以干粉狀態(tài)固定在壓電石英晶體表面，組成一次性血凝檢測片。

3 凝血實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析

3.1 液血時(shí)間的測定

將壓電石英晶體經(jīng)乙醇、蒸餾水、磷酸緩沖鹽溶液反復(fù)清洗干凈，氮?dú)獯蹈?。將控溫器和未修飾的檢測片組裝好連入傳感系統(tǒng)中，開機(jī)預(yù)熱5分鐘，記錄初始響應(yīng)信號。取一定量聚苯乙烯粉末溶于氯仿溶液，配制成1 g/L聚苯乙烯的氯仿溶液。取5 μL聚苯乙烯的氯仿溶液均勻滴加到石英晶體表面，用紫外燈照射10分鐘，待氯仿?lián)]發(fā)完，形成一層光滑的涂層，待基線穩(wěn)定，記錄涂層的響應(yīng)信號。用移液槍分別取20 μL凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）標(biāo)準(zhǔn)試劑、凝血酶原時(shí)間（Prothrombin time，PT）標(biāo)準(zhǔn)試劑和活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）標(biāo)準(zhǔn)試劑，均勻噴涂在表面改性后的石英晶體表面，冷卻干燥，依次組裝成不同類型的一次性血凝檢測片，記錄凝血試劑干粉的響應(yīng)信號。用移液槍移取10 μL血漿加入到血凝檢測片，與凝血標(biāo)準(zhǔn)試劑充分反應(yīng)，記錄響應(yīng)信號與響應(yīng)時(shí)間，計(jì)算凝血時(shí)間，重復(fù)30次，與標(biāo)準(zhǔn)凝血時(shí)間進(jìn)行對比，計(jì)算誤差。

3.2 結(jié)果分析

高頻相移壓電石英傳感系統(tǒng)具有優(yōu)越的質(zhì)量敏感特性，能夠?qū)ζ浔砻娴馁|(zhì)量變化產(chǎn)生響應(yīng)，圖3反映了凝血檢測過程中系統(tǒng)的響應(yīng)信號變化。凝血檢測主要分為2個(gè)過程，分別為血凝檢測片的制備和血液凝固時(shí)間的測定。

圖3中，響應(yīng)信號的變化規(guī)律如實(shí)地反映了凝血檢測的全過程，符合公式（1）中相移信號與表面負(fù)載質(zhì)量的響應(yīng)規(guī)律。聚苯乙烯的修飾和凝血因子的固定增加了表面涂層質(zhì)量，系統(tǒng)的響應(yīng)信號隨著涂層質(zhì)量的增加而下降，直至穩(wěn)定。血液凝固過程中，以凝血酶時(shí)間（TT）的測定為例，加入血漿，啟動(dòng)凝血反應(yīng)，凝血酶標(biāo)準(zhǔn)試劑將血漿中可溶性纖維蛋白原裂解成可溶性纖維蛋白，同時(shí)可溶性纖維蛋白聚合形成不溶性的纖維蛋白。該過程中，體系的粘度逐漸增加，系統(tǒng)的響應(yīng)信號快速下降，圖中，A點(diǎn)表示凝血反應(yīng)的開始，對應(yīng)時(shí)間為t1；B點(diǎn)表示纖維蛋白的生成，對應(yīng)時(shí)間為t2。隨后，生成的纖維蛋白凝聚體附著在石英晶體表面，體系粘度逐漸減少，晶體表面負(fù)載質(zhì)量逐漸增加，因而響應(yīng)信號下降速率開始減緩。隨著纖維蛋白凝聚體的完全吸附，系統(tǒng)的響應(yīng)信號達(dá)到穩(wěn)定，C點(diǎn)表示反應(yīng)結(jié)束，對應(yīng)時(shí)間為t3。t1和t3的值可直接讀出。

為了測量凝血時(shí)間，對圖3中血液凝固過程的響應(yīng)信號差隨響應(yīng)時(shí)間作圖，將得到的凝血反應(yīng)曲線分別進(jìn)行一階和二階微分，得到圖4。圖中，t2對應(yīng)一階導(dǎo)數(shù)最大值點(diǎn)和二階導(dǎo)數(shù)左右符號相反的點(diǎn)，因此，根據(jù)微分曲線的特殊性可以求得凝血時(shí)間，TT=t2-t1=(256-240)s=16 s。重復(fù)測量30次，得到圖5所示的凝血酶時(shí)間。

表1 血漿凝血時(shí)間的測定

與臨床標(biāo)準(zhǔn)凝血時(shí)間相比，該系統(tǒng)的測量誤差低于10%，可認(rèn)為該系統(tǒng)的測量結(jié)果準(zhǔn)確性好，能實(shí)際應(yīng)用于血漿凝血時(shí)間的測定。

4 結(jié)論

本研究開發(fā)了一種高頻相移壓電石英凝血檢測系統(tǒng)，制備了一次性血凝檢測片，基于凝血試劑的干法修飾和微分?jǐn)?shù)據(jù)處理方式，成功地實(shí)現(xiàn)了對血漿凝血時(shí)間的實(shí)時(shí)在線檢測。與傳統(tǒng)壓電石英晶體傳感器相比，使用高頻33 MHz石英晶體作為傳感元件，采用固定頻率相位響應(yīng)的信號表征系統(tǒng)，增強(qiáng)了系統(tǒng)靈敏度，提高了系統(tǒng)穩(wěn)定性，同時(shí)顯著降低了數(shù)據(jù)采集擬合時(shí)間，提高了時(shí)間分辨率。

未來，我們希望在此基礎(chǔ)上開發(fā)出一款便攜式、無標(biāo)簽的血凝檢測儀，用于快速、準(zhǔn)確地檢測人類指尖血，為社區(qū)、家庭、現(xiàn)場急救等應(yīng)用場景下的實(shí)時(shí)在線血凝檢測創(chuàng)造條件。