銀杏內(nèi)酯B對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用?

柴麗娜 杜 蕊 張艷艷 孫瑩瑩 梁衛(wèi)章 欒紹華 關(guān)連穎 任 亮 劉津軍

（1.河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001；2.河北省冀中能源峰峰集團(tuán)總醫(yī)院，河北邯鄲 056200）

心臟缺血再灌注損傷是急性心肌梗死溶栓后及多種心臟手術(shù)術(shù)后常見(jiàn)并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者預(yù)后，是臨床上亟待解決的難題。銀杏內(nèi)酯B是我國(guó)傳統(tǒng)中藥銀杏葉的主要活性成分之一，既往研究發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B具有抗氧化、抗炎以及抑制細(xì)胞凋亡等多種藥理學(xué)作用［1-3］，但關(guān)于銀杏內(nèi)酯B對(duì)心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的文獻(xiàn)報(bào)道尚不多見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)采用Langendorff灌流系統(tǒng)，建立大鼠離體心臟缺血再灌注損傷模型，以維拉帕米為陽(yáng)性對(duì)照藥物，研究銀杏內(nèi)酯B對(duì)離體心臟的保護(hù)作用并探討其可能的機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)雄性SD大鼠（8周齡，220～260 g）購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（冀）2013-1-003。飼養(yǎng)環(huán)境：23～25℃、相對(duì)濕度55%～60%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試藥與儀器 銀杏內(nèi)酯B購(gòu)自美國(guó)Sigma公司（批號(hào)：33570）；維拉帕米注射液購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司（批號(hào)：43170116）；TTC購(gòu)自美國(guó)Sigma公司（批號(hào)：M2128）；HE試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所（批號(hào)：161029）；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：170101018、161209011、170117008）；SOD、CAT、MDA、Na+-ATP、Ca2+-ATP試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所（批號(hào)：161207、161124、160916、170118、160910）；K-H 液 ：用 NaCl 20.67 g、NaHCO36.27g、KCl 1.05 g、KH2PO40.48 g、Glu?cose 5.99 g、MgSO4·7H2O 0.87 g、CaCl20.85 g溶解于1 L蒸餾水，調(diào)節(jié)pH=7.40（自制）。主要儀器：Langen?dorff離體心臟灌流系統(tǒng)（美國(guó)Radnoti公司）；Medlab/8C生物信號(hào)采集系統(tǒng)（南京美易科技有限公司）；BI-2000醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海圣科儀器設(shè)備有限公司）；生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）。

1.3 分組與造模 將100只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、模型組、銀杏內(nèi)酯B（15、30、60 mg/kg）組和維拉帕米組（陽(yáng)性藥物對(duì)照組），各20只。手術(shù)前2 h，銀杏內(nèi)酯B各劑量組和維拉帕米組分別腹腔注射相應(yīng)藥物，正常對(duì)照組和模型組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液。參照郭麗麗等報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法制備大鼠離體心臟缺血再灌注模型：腹腔注射20%烏拉坦麻醉后，迅速開(kāi)胸，切斷主動(dòng)脈后取出心臟，置預(yù)冷（4℃）K-H液中，分離主動(dòng)脈，釆用Langendorff法逆灌含氧K-H液（充以95% O2+5% CO2），切開(kāi)左心耳并由此置入帶測(cè)壓導(dǎo)管的球囊，測(cè)壓導(dǎo)管連接生物信號(hào)采集系統(tǒng)［4］。正常對(duì)照組持續(xù)以7 mL/min恒速平衡灌注K-H液（37℃）110 min，模型組、銀杏內(nèi)酯B各劑量組和維拉帕米組依次行7 mL/min恒速平衡灌注K-H液（37℃）20 min、停灌30 min后恢復(fù)灌注60 min，然后取材行各指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）心肌酶（AST、LDH、CKMB）活性檢測(cè)。分別取各組大鼠心臟冠脈流出液，采用生化分析法檢測(cè)心肌酶AST、LDH、CK-MB活性。2）TTC染色法測(cè)定心臟組織梗死面積。每組隨機(jī)選取6只大鼠離體心臟，-20℃凍存20 min，置于2% TTC溶液恒溫（37℃）、避光孵育15 min，紅色為正常組織、灰白色為梗死區(qū)，通過(guò)醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算梗死面積百分率。3）HE染色法觀察心臟組織病變。每組另隨機(jī)取6只大鼠離體心臟，置4%多聚甲醛溶液固定72 h，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片和脫蠟水化處理后，按照染色試劑盒操作步驟行HE染色，然后通過(guò)倒置光學(xué)顯微鏡觀察心臟組織病變。4）血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。通過(guò)連接測(cè)壓導(dǎo)管的生物信號(hào)采集系統(tǒng)記錄各組大鼠離體心臟組織心率（HR）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室收縮壓（LVSP）、左室收縮壓最大上升速率（+dP/dtmax）、左室舒張壓最大下降速率（-dP/dtmin）。5）心臟組織抗氧化酶活性檢測(cè)。取各組剩余的8只大鼠離體心臟組織，于4℃環(huán)境剪碎，加入適量冷裂解液后研磨勻漿，制備10%組織勻漿液，3500 r/min離心10 min取上清液，按照各檢測(cè)試劑盒操作方法，通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)心臟組織中抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性，丙二醛（MDA）含量以及Na+-ATP、Ca2+-ATP活性。

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌酶活性比較 見(jiàn)表1。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠離體心臟冠脈流出液心肌酶AST、LDH、CK-MB活性顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B 30、60 mg/kg組和維拉帕米組冠脈流出液AST、LDH、CK-MB活性顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

表1 各組大鼠離體心臟冠脈流出液心肌酶活性比較（U/L±s）

表1 各組大鼠離體心臟冠脈流出液心肌酶活性比較（U/L±s）

與正常對(duì)照組比較，??P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。下同。

組別正常對(duì)照組模型組銀杏內(nèi)酯B 15 mg/kg組銀杏內(nèi)酯B 30 mg/kg組銀杏內(nèi)酯B 60 mg/kg組維拉帕米組n 20 20 20 20 20 20 AST 9.75±2.08 64.03±14.90**53.97±14.31 27.40±5.86△△15.77±4.21△△39.85±14.06△LDH 8.62±2.58 91.87±14.95**73.70±13.94△48.31±11.63△△26.29±8.22△△54.11±13.24△△CK-MB 679.64±75.23 1789.25±271.80**1514.17±208.16 1091.64±185.11△985.08±171.29△△1079.58±187.37△

2.2 各組心肌組織梗死面積百分率比較 見(jiàn)表2。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠離體心肌組織梗死面積百分率顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B 30、60 mg/kg組和維拉帕米組心肌組織梗死百分率顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

表2 各組大鼠離體心臟梗死面積比較（%±s）

表2 各組大鼠離體心臟梗死面積比較（%±s）

組別正常對(duì)照組模型組銀杏內(nèi)酯B 15 mg/kg組銀杏內(nèi)酯B 30 mg/kg組銀杏內(nèi)酯B 60 mg/kg組維拉帕米組n 6 6 6 6 6 6梗死百分率0.00±0.00 41.97±5.02**38.39±5.40 31.75±5.27△22.96±4.19△△30.98±4.86△

2.3 各組心臟組織病變觀察結(jié)果 見(jiàn)圖1。正常對(duì)照組大鼠離體心臟組織細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)異常；模型組心臟組織呈現(xiàn)肌原纖維斷裂、間隙增寬、排列紊亂，細(xì)胞空泡變性、細(xì)胞質(zhì)著色不均、胞核深染等病變；較模型組，銀杏內(nèi)酯B 15、30、60 mg/kg組和維拉帕米2.5 mg/kg組離體心臟組織病變呈現(xiàn)不同程度改善，其中以60 mg/kg組效果較為顯著。

圖1 各組大鼠離體心臟組織形態(tài)（HE染色，200倍）

2.4 各組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較 見(jiàn)表3。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠離體心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)（HR、LVSP、+dP/dtmax、-dP/dtmin）顯著下降而LVEDP顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B 30、60 mg/kg組和維拉帕米2.5 mg/kg組HR、LVDP、+dP/dtmax、-dP/dtmin顯著升高且LVEDP顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

表3 各組大鼠離體心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)（±s）

表3 各組大鼠離體心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)（±s）

注：1 mmHg≈0.133 kPa。

組別正常對(duì)照組模型組銀杏內(nèi)酯B 15 mg/kg組銀杏內(nèi)酯B 30 mg/kg組銀杏內(nèi)酯B 60 mg/kg組維拉帕米組LVSP（mmHg）86.86±9.80 61.14±9.57**63.76±9.81 72.05±9.59△78.68±10.24△△74.31±10.19△n 20 20 20 20 20 20 HR（次/min）276.85±27.41 243.08±23.79**251.03±23.68 261.15±24.31△267.69±26.08△264.98±24.10△LVEDP（mmHg）7.32±2.28 35.26±9.39**26.10±6.18 21.42±5.27△16.75±4.60△△18.65±5.03△+dP/dtmax（mmHg/s）2398.26±324.41 956.87±195.94**1045.90±213.61 1469.06±234.30△1761.83±275.17△△1692.86±219.76△△-dP/dtmin（mmHg/s）1923.85±275.70 781.90±194.16**897.42±202.76 1141.72±229.28△1493.05±243.71△△1415.98±220.15△△

2.5 各組抗氧化酶（SOD、CAT）活性及MDA含量比較見(jiàn)表4。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠離體心臟組織SOD、CAT顯著降低且MDA含量顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B 30、60 mg/kg組和維拉帕米組SOD、CAT活性顯著升高（P<0.05或P<0.01），MDA含量顯著降低（P<0.01）。

表4 各組大鼠離體心臟組織SOD、CAT活性及MDA含量比較（±s）

表4 各組大鼠離體心臟組織SOD、CAT活性及MDA含量比較（±s）

組別正常對(duì)照組模型組銀杏內(nèi)酯B 15 mg/kg組銀杏內(nèi)酯B 30 mg/kg組銀杏內(nèi)酯B 60 mg/kg組維拉帕米組n 8 8 8 8 8 8 SOD（U/mg）67.93±5.08 37.40±3.99**41.27±4.65 48.83±5.11△57.89±5.64△△49.05±5.31△CAT（U/mg）37.51±4.72 16.38±3.43**20.30±3.75 24.12±3.40△31.05±4.38△21.97±4.26 MDA（nmol/mg）3.71±0.69 9.76±1.68**8.22±1.52 6.49±1.41△△5.53±0.99△△6.78±1.20△△

2.6 各組Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活力比較 見(jiàn)表5。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠離體心臟組織Na+-ATP、Ca2+-ATPase活力顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯B 30、60 mg/kg組和維拉帕米組Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活力顯著升高（P<0.05或P<0.01）。

表5 各組大鼠離體心臟Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活力比較［μmoL/（mg·h）±s］

表5 各組大鼠離體心臟Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活力比較［μmoL/（mg·h）±s］

組別正常對(duì)照組模型組銀杏內(nèi)酯B 15 mg/kg組銀杏內(nèi)酯B 30 mg/kg組銀杏內(nèi)酯B 60 mg/kg組維拉帕米組n888888 Na+-ATPase 1.68±0.76 0.75±0.19**0.84±0.28 1.50±0.37△1.93±0.65△△1.91±0.72△△Ca2+-ATPase 1.49±0.41 0.65±0.22**0.97±0.36 1.33±0.40△△1.79±0.42△△1.84±0.41△△

3 討 論

隨著高血壓病、高脂血癥等患病人群的擴(kuò)大，冠心病以及由其所引發(fā)的急性心肌梗死發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重危害著人類的生命健康。目前，臨床上冠狀動(dòng)脈再通、恢復(fù)血流再灌注是治療缺血性心臟病的首選方案，但缺血再灌注損傷并發(fā)癥嚴(yán)重影響患者預(yù)后。近年來(lái)，郭志祥等研究發(fā)現(xiàn)血流動(dòng)力學(xué)改變、氧化應(yīng)激損傷以及ATPase活性降低是心肌缺血再灌注損傷主要病理機(jī)制［5-6］，這也為研發(fā)能夠有效降低缺血再灌注損傷的新型藥物提供了思路。

銀杏葉是我國(guó)傳統(tǒng)中藥品種，《本草綱目》和《中藥志》中均有記載，其性味甘苦澀平，具有益心斂肺、化濕止瀉之功效?，F(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，萜內(nèi)酯類化合物為銀杏葉的主要有效成分，包括銀杏內(nèi)酯（Ginkgolide）A、B、C、M和白果內(nèi)酯，其中活性最強(qiáng)的即為銀杏內(nèi)酯B，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種生物學(xué)活性。本實(shí)驗(yàn)釆用Langendorff離體心臟灌流技術(shù)，模擬心肌缺血再灌注損傷模型，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)銀杏內(nèi)酯B預(yù)處理能夠有效降低離體心臟冠脈流出液AST、LDH、CK-MB活性、降低心肌組織梗死面積、抑制心肌組織病變，表明銀杏內(nèi)酯B能夠減輕心肌組織細(xì)胞損傷、改善心功能，提示銀杏內(nèi)酯B對(duì)離體心臟缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。

血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)正常是保證心臟功能的基礎(chǔ)，其中HR、LVEDP、LVSP、+dP/dtmax、-dP/dtmin是衡量血流動(dòng)力學(xué)的重要指標(biāo)；其中，HR能夠反應(yīng)心臟的整體功能，LVEDP能夠反映舒張期左室內(nèi)壓變化，LVSP反映收縮期左室內(nèi)壓變化，LVEDP和LVSP能夠體現(xiàn)心肌順應(yīng)性；+dp/dtmax反映心肌收縮程度、-dp/dtmax反映心肌舒張功能，二者是評(píng)價(jià)心肌收縮性能和舒張性能的敏感指標(biāo)［7-8］。心肌缺血/再灌注可降低心肌舒縮功能，表現(xiàn)為心排血量減少及±dp/dtmax指標(biāo)降低［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)銀杏內(nèi)酯B預(yù)處理能夠有效提高離體心臟HR、LVDP、+dP/dtmax、-dP/dtmin并降低LVEDP，提示銀杏內(nèi)酯B具有改善離體心臟缺血再灌注損傷后血流動(dòng)力學(xué)的藥理學(xué)作用。

氧化應(yīng)激損傷是心臟組織缺血再灌注損傷的重要病理機(jī)制之一［10］，體內(nèi)氧自由基代謝失衡是氧化應(yīng)激損傷的病理基礎(chǔ)，SOD、CAT是體內(nèi)清除氧自由基的關(guān)鍵還原酶［11-12］，MDA為脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)終產(chǎn)物，因此SOD、CAT活性和MDA含量能夠間接反應(yīng)心肌組織損傷的程度［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)銀杏內(nèi)酯B預(yù)處理能夠有效改善抗氧化酶（SOD、CAT）活性并降低MDA含量，提示銀杏內(nèi)酯B具有抑制離體心臟缺血再灌注后氧化應(yīng)激損傷的作用。

心肌缺血再灌注將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+濃度升高，促進(jìn)Na+-Ca2+交換而導(dǎo)致大量Ca2+內(nèi)流而致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載［14］，進(jìn)而引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷而致細(xì)胞死亡，是心臟組織缺血再灌注損傷的另一重要病理機(jī)制［15-17］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)銀杏內(nèi)酯B預(yù)處理能夠有效提高Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活性，從而有效緩解細(xì)胞內(nèi)Na+、Ca2+超載，這可能是銀杏內(nèi)酯B對(duì)離體心臟缺血再灌注損傷能夠起到一定保護(hù)作用的機(jī)制之一。

總之，銀杏內(nèi)酯B能夠減輕心肌組織細(xì)胞損傷、改善心功能，提示銀杏內(nèi)酯B對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用，可能與其能夠改善血流動(dòng)力學(xué)、抑制氧化應(yīng)激損傷以及改善Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活性有關(guān)。