基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討溫膽湯治療哮喘作用機制?

楊 陽 張 迪 王 佳 黃程程 王有鵬

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150001）

哮喘是兒童最常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其特征是慢性氣道炎癥、可逆性氣道阻塞、氣道重塑、黏液分泌增加和氣道高反應(yīng)性［1］。哮喘發(fā)作的常見誘因包括病毒感染、暴露于過敏原和（或）污染物、吸煙、突然的溫度變化、壓力和運動等［2-3］。目前，全球約有3.34億人和10%的兒童受到影響，構(gòu)成了嚴重的全球健康問題［4-6］。近年哮喘的發(fā)病率不斷上升，預(yù)計2025年可達4億［7-8］。中醫(yī)中藥治療兒童疾病優(yōu)勢近年來受到重視，很多學(xué)者也開始深入研究經(jīng)典方劑治療哮喘的作用機制，不但可以更好地治療疾病，還為醫(yī)學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)。

溫膽湯最早記載于南北朝時期醫(yī)家姚僧垣的《集驗方》［9-10］，不同醫(yī)家對其方義闡釋不同，主要包括清熱化痰、解郁化痰、達膽和胃、和胃降膽以及分消走泄等功效?，F(xiàn)代醫(yī)家對溫膽湯的應(yīng)用非常廣泛，尤其在治療兒童疾病中應(yīng)用越來越多，對過敏性疾病的防治效果頗佳，已有臨床觀察證實溫膽湯加減可以治療兒童哮喘。有關(guān)實驗對溫膽湯中的成分進行測定，發(fā)現(xiàn)其中有部分成分可以用于治療哮喘［11］。筆者通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對溫膽湯主要成分治療哮喘進行探討，通過構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，獲得溫膽湯治療哮喘可能的作用機制，為后續(xù)實驗研究提供理論依據(jù)。

1 研究方法

1.1 獲取溫膽湯中主要中藥有效成分及藥物靶點使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）篩選溫膽湯中主要藥物的活性化合物，分別輸入“半夏”“陳皮”“茯苓”“枳實”，篩選標準為：口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug like，DL）≥0.18。

1.2 檢索哮喘靶點基因 分別在Gene Cards（https：//www.geneca-rds.org/）和在線人類孟德爾遺傳（OMIM，https：//omim.org/）中輸入“asthma”進行檢索，并將兩個表格進行整合。

1.3 溫膽湯藥物活性成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將“1.1”獲得的溫膽湯主要藥物的活性成分及核心靶點相關(guān)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，繪制溫膽湯活性成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)。使用STRING平臺（https：//string-db.org/）可以構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO分析 使用R語言軟件對溫膽湯主要藥物與哮喘的共作靶點進行數(shù)據(jù)的處理，并得到GO分析的條形圖、氣泡圖。使用Perl將轉(zhuǎn)換的ID變成原始基因靶點。

1.5 KEGG通路富集分析及KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將獲得的ID轉(zhuǎn)換文本文件，運行R語言得到KEGG通路富集分析的條形圖、氣泡圖及文本文件。使用perl對獲得的KEGG文本文件進行操作，輸入Cytoscape 3.6.1軟件，繪制溫膽湯與哮喘直接的KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié) 果

2.1 溫膽湯主要藥物的活性成分 經(jīng)過TCMSP篩選后得到溫膽湯主要藥物的有效活性成分52個，其中半夏13個，陳皮5個，茯苓15個，枳實22個，陳皮、枳實共有3個，整合后可獲取藥物有效活性成分作用靶點603個。

2.2 潛在靶點信息 通過Gene Cards獲得哮喘的靶點基因5 974個，通過OMIM獲得哮喘靶點基因36個，將已經(jīng)獲得的溫膽湯中活性成分作用的靶點基因取交集，可獲得兩者的共同靶點有131個。

2.3 溫膽湯主要藥物中活性成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò) 應(yīng)用Cytoscape 3.6.1軟件，繪制溫膽湯主要藥物活性成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)（如圖1），三角形代表靶點，橢圓形代表活性成分，其中藍色代表半夏，綠色代表陳皮，紫色代表茯苓，黃色代表枳實，紅色代表多味藥共同含有。連線越密集的節(jié)點越重要。將獲得的131個靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2，并運用R語言提取PPI網(wǎng)絡(luò)中度值中心性較高的前30位的核心基因，見圖3。

圖1 溫膽湯主要藥物中活性成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)

圖2 溫膽湯與哮喘靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 PPI的核心基因

2.4 GO富集分析 分析經(jīng)R語言運行后總共得到135個功能，獲取其中前20個的GO功能富集的條形圖和氣泡圖（見圖4、圖5）：富集越是顯著顏色越偏紅色，富集越少顏色越偏藍色；橫坐標表示富集數(shù)目。

圖4 溫膽湯治療哮喘候選靶點的GO富集條形圖

圖5 溫膽湯治療哮喘候選靶點的GO富集氣泡圖

2.5 KEGG通路富集分析及KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用R語言軟件對獲得的131個靶點基因進行KEGG通路富集分析，運行后得到30條通路。繪制顯著性前20的通路的條形圖和氣泡圖（見圖6、圖7）：橫坐標表示靶點數(shù)，左邊表示通路名稱，通路上靶點數(shù)越多顏色越偏紅色，靶點數(shù)越少顏色越偏藍色。通過對富集前20的KEGG通路與基因之間的網(wǎng)絡(luò)圖（見圖8）：三角形代表通路，橢圓形代表基因，線代表相互鏈接，圖形越大代表相互關(guān)聯(lián)數(shù)量越多。

圖6 溫膽湯-哮喘潛在靶點KEGG通路條形圖

圖7 溫膽湯-哮喘潛在靶點KEGG通路氣泡圖

圖8 溫膽湯治療哮喘的KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

3 討 論

哮喘可歸為中醫(yī)學(xué)的“哮證”“喘證”等范疇。在《素問·陰陽別論》中“陰爭于內(nèi)，陽擾于外，魄汗未藏，四逆而起，起則熏肺，使人喘鳴”，對哮喘的病因和癥狀進行描述。后世《金匱要略》“咳而上氣，喉中水雞聲”，進一步對癥狀及治療進行記載。近現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者對哮喘的認識更深入，對病因病機的不斷完善，治療上面的選方用藥更系統(tǒng)化、多樣化、全面化。通過溫膽湯加味治療哮喘的臨床觀察可以看出，其治療哮喘具有一定的療效，但是對于機制的研究尚未廣泛開展。

通過對溫膽湯中的有效成分進行分析，部分化合物已經(jīng)證實具有治療哮喘的作用，尤其是一些與基因關(guān)聯(lián)較多的活性成分，比如木樨草素、β-谷甾醇、柚皮素、豆甾醇等。木樨草素具有抑制哮喘氣道重塑及抑制哮喘氣道炎癥的作用［12］。β-谷甾醇具有抑菌抗炎的作用，多個治療哮喘的藥物都含有此成分［13-14］。柚皮素具有止咳化痰平喘的作用［15］。豆甾醇對哮喘氣道炎癥具有調(diào)節(jié)作用［16］。

通過對溫膽湯與哮喘的PPI網(wǎng)絡(luò)分析，核心基因為Akt1、MAPK3、IL-6、VEGFA、FOS、JUN、MAPK1等。查閱文獻可知，AKT1的磷酸化變化可能在治療哮喘的療效中起重要作用［17］。MAPK3與MAPK1在MAPK信號通路中具有重要的作用，與調(diào)控氣管平滑肌細胞炎癥基因表達的重要信號酶相關(guān)［18］，MAPK信號通路與溫膽湯治療哮喘也具有相關(guān)性。IL-6近年被證實是哮喘的易感基因［19-20］。VEGFA在哮喘發(fā)病中起作用，如嗜酸性炎癥、杯狀細胞化生、氣道重塑以及氣道高反應(yīng)性，被認為是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵介質(zhì)之一［21］。FOS與JUN等基因都參與了哮喘的氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)等，從而使哮喘誘發(fā)或嚴重［22］。已有文獻證明，溫膽湯對某些疾病的患者或?qū)嶒瀯游镅逯械难装Y因子IL-6、VEGFA等有調(diào)節(jié)作用，可調(diào)節(jié)組織中FOS及JUN等基因的表達。目前關(guān)于溫膽湯治療哮喘的動物實驗研究較少，分析獲得的基因?qū)⑹呛笃趯嶒灥闹饕芯繉ο蟆?/p>

GO富集分析顯示GO功能富集后富集數(shù)目較多的有泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性、磷酸酶結(jié)合等。真核生物中泛素樣蛋白連接酶在許多細胞功能中起著核心作用，但目前針對其與哮喘的研究較少。磷酸酶是許多細胞信號傳遞的關(guān)鍵，可以激活信號通路，使其表現(xiàn)功能?？赏茰y溫膽湯通過參與多途徑治療哮喘，尤其是在細胞免疫等方面。淋巴細胞的失衡是哮喘發(fā)病機制的主要原因之一，免疫細胞參與哮喘的發(fā)病、發(fā)生、發(fā)展及治療。合理選擇中藥復(fù)方可以更好地通過細胞免疫等方面改善哮喘癥狀，不但使中藥治療疾病效果更佳，還可以通過實驗數(shù)據(jù)使中醫(yī)藥更具有說服力和應(yīng)用空間。

KEGG富集通路分析顯示溫膽湯治療哮喘主要通路有PI3K-Akt信號通路、內(nèi)分泌抵抗、細胞凋亡、cAMP信號通路等通路為主；KEGG通路與基因之間的網(wǎng)絡(luò)圖中關(guān)聯(lián)數(shù)量較多的基因主要有MAPK3、MAPK1、Akt1等。其中，最新研究表明，通過靶向PI3K/Akt整合素軸的氣道上皮修復(fù)是治療兒童喘息和哮喘的新途徑［23］。哮喘發(fā)生主要的因素是氣道炎癥與氣道重塑及氣道高反應(yīng)等，PI3K-Akt通路不但可以減輕氣道炎癥，還可以抑制氣道重塑，從而改善哮喘癥狀。氣道細胞凋亡的積聚可能是導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性的重要因素。凋亡細胞能否及時清除與哮喘的發(fā)生和病程有關(guān)［24］。研究發(fā)現(xiàn)，cAMP信號通路在多系統(tǒng)及細胞代謝等方面發(fā)揮著重要作用，其中某些基因的異常表達與哮喘病理生理的變化過程具有重要關(guān)聯(lián)［25］。還有文獻表明，該通路可能是肺腸同治哮喘的物質(zhì)基礎(chǔ)之一［26］。

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對溫膽湯治療哮喘進展分析，推測其可能是通過多成分、多靶點、多通路的相互關(guān)系進行作用，可進一步針對其影響氣道重塑、信號傳導(dǎo)和免疫代謝等方面進行實驗證實。溫膽湯治療哮喘的作用機制PI3K-Akt、cAMP等信號通路可能有關(guān)，作用于MAPK3、MAPK1、Akt1等相關(guān)受體。目前關(guān)于其中的機制研究較少，盡管以上結(jié)論是通過查閱數(shù)據(jù)庫所得，仍可為科研實驗提供了新思路。本次獲得信號通路可能就是溫膽湯治療哮喘的主要通路，后期可通過實驗對通路及相關(guān)因子進行驗證，以期為中醫(yī)藥的發(fā)展提供更好的基礎(chǔ)理論依據(jù)，為中醫(yī)藥的蓬勃發(fā)展做貢獻。