平喘顆粒對(duì)哮喘大鼠氣道重塑及TGF-β1/Smads信號(hào)通路的影響?

李 星 李竹英 王麗潔△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040）

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘）是由多種炎癥細(xì)胞及細(xì)胞組分相互作用的慢性氣道異質(zhì)性疾病，發(fā)病過(guò)程中受到炎性介質(zhì)的不斷刺激而觸發(fā)氣道壁損傷和氣道結(jié)構(gòu)變化，從而導(dǎo)致氣道重塑。因此，延緩氣道重塑的進(jìn)展已經(jīng)成為目前防治哮喘的一個(gè)重要方向。平喘顆粒是國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)劉建秋教授傳承前輩思想并結(jié)合多年臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)所創(chuàng)立，劉教授認(rèn)為哮喘慢性持續(xù)期的病機(jī)根本為“陽(yáng)虛痰盛”，故以“溫陽(yáng)益氣，化痰平喘”為核心思想組方平喘顆粒用于哮喘慢性持續(xù)期的臨床治療。前期研究發(fā)現(xiàn)［1-3］，平喘顆?？梢酝ㄟ^(guò)抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成、干預(yù)上皮細(xì)胞自噬與凋亡改善哮喘氣道重塑。TGF-β1/Smads信號(hào)通路與哮喘關(guān)系密切，可通過(guò)調(diào)節(jié)多種相關(guān)蛋白和細(xì)胞因子，影響氣道平滑肌的增殖和膠原沉積等方式參與氣道重塑的發(fā)生發(fā)展［4-5］。本研究通過(guò)觀察平喘顆粒對(duì)哮喘大鼠TGF-β 1/Smads信號(hào)通路的影響，探討平喘顆粒在改善氣道重塑方面更廣泛的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠40只，體質(zhì)量（180±20）g，許可證號(hào)：SCXK（吉）-2011-0007，購(gòu)于延邊大學(xué)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 平喘顆粒，組成：淫羊藿200 g，太子參150 g，黃芪 150 g，五味子150 g，知母100 g，炙麻黃100 g，款冬花（炙）150 g，地龍100 g，罌粟殼40 g。藥材加水煎煮2次，每2小時(shí)過(guò)濾1次，醇沉濃縮成相對(duì)密度為1.20～1.25（60 ℃）的稠膏［6］，加入蔗糖、糊精適量，混勻，制成顆粒，干燥，制成1 000 g（由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制備，批號(hào)：20180723）。按前期研究的最佳質(zhì)量濃度（1.08 g/mL）含藥溶液灌胃，根據(jù)人體與動(dòng)物的每千克體質(zhì)量折算系數(shù)計(jì)算，給藥劑量為5 mL/kg。

1.3 試劑與儀器 卵蛋白（OVA）（上海生工生物技術(shù)有限公司，A003056-0100）；Masson染色試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，BP-DL021）；Anti-TGF beta 1 antibody［EPR21143］（英國(guó) abcam，ab215715）；Smad2/3（D7G7）XP? Rabbit mAb（美國(guó)CST，8685S）；內(nèi)參抗體β-actin（santa cruz，sc-47778）；PVDF膜（上海谷研生物技術(shù)有限公司，GOY-C3192）；PMSF（北京伊塔生物技術(shù)有限公司，YT1705）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（英國(guó)abcam，ab102536）；Western及IP細(xì)胞裂解液（上海梵態(tài)生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)T-LG1227）。RM2235石蠟切片機(jī)，德國(guó)Leica；Lx81研究級(jí)倒置熒光顯微鏡，日本Olymps公司；-30℃恒冷低溫切片機(jī)CM69001，德國(guó)Leica；OLABO水平搖床，濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司；165-8001型電泳儀，美國(guó)Bio-Rad；DYCZ-40D轉(zhuǎn)移槽，北京六一儀器廠。

1.4 分組與造模 將40只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、哮喘組、平喘顆粒組，地塞米松組，每組10只。根據(jù)文獻(xiàn)［7］方法，應(yīng)用OVA致敏液［10 mg OVA+100 mg Al（OH）3］制備慢性哮喘大鼠模型，腹腔注射10% OVA致敏液1 mL（分別于第0、12天），之后每天改用5% OVA致敏液激發(fā)30 min，持續(xù)5 d，然后隔1 d激發(fā)1次，持續(xù)6周?？瞻讓?duì)照組給予生理鹽水代替OVA激發(fā)。

1.5 給藥方法 平喘顆粒組：給予5mL/kg平喘顆粒藥液灌胃，于第2次致敏后第4天開(kāi)始進(jìn)行，激發(fā)階段則每次激發(fā)前1 h給藥。地塞米松組：給予0.45 mg/kg地塞米松藥液灌胃，給藥時(shí)間同平喘顆粒組?？瞻讓?duì)照組、哮喘組給予5 mL/kg的生理鹽水灌胃，時(shí)間同平喘顆粒組。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 各組大鼠末次激發(fā)24 h后處死，開(kāi)胸取固定的肺組織行石蠟包埋、切片，采用Masson染色，光鏡下觀察肺組織的病理學(xué)改變。采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)（Image-Pro Plus Version 6.0）分析病理圖像，測(cè)定支氣管基底膜周徑（Pbm）、氣道平滑肌面積（WAm）、支氣管內(nèi)壁面積（WAi），并以 Pbm 對(duì)各項(xiàng)面積指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以此反映氣道病理變化。

1.7 Western blotting檢測(cè) 各組取-70℃凍存的大鼠右肺前葉及中葉部分組織，切成非常細(xì)小的碎片，經(jīng)蛋白質(zhì)抽提、裂解、離心，提取大鼠肺組織總蛋白，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，按BCA蛋白試劑盒說(shuō)明操作以檢測(cè)蛋白濃度，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)濾光片進(jìn)行讀數(shù)，記錄數(shù)據(jù)。然后凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行封閉及抗體孵育，孵育二抗后繼續(xù)洗滌、顯色，最后用Gel-Pro-Analyzer軟件對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織病理觀察結(jié)果 見(jiàn)圖1?？瞻讓?duì)照組大鼠支氣管管腔光滑，氣管壁及平滑肌無(wú)增厚。哮喘組大鼠氣道管腔明顯變窄，氣管壁和氣道平滑肌厚度增加，氣道周?chē)梢?jiàn)較多的藍(lán)色膠原纖維組織。平喘顆粒組上述病理結(jié)構(gòu)改變明顯減輕，但與正常組仍有差距，氣道周?chē)乃{(lán)色膠原纖維組織減少。地塞米松組上述病理結(jié)構(gòu)改變和膠原沉積均明顯減輕。

圖1 各組大鼠肺組織病理觀察（Masson染色，200倍）

2.2 各組大鼠WAm/Pbm、WAi/Pbm比較 見(jiàn)表1。與空白對(duì)照組比較，哮喘組大鼠氣道平滑肌厚度、氣管內(nèi)壁厚度明顯增加（P<0.05）。給予平喘顆粒和地塞米松治療后大鼠氣道平滑肌厚度、氣管內(nèi)壁厚度明顯降低（P<0.05），平喘顆粒組和地塞米松組WAm/Pbm、WAi/Pbm比較無(wú)顯著差異（P>0.05）。

表1 各組大鼠WAm/Pbm、WAi/Pbm比較（μm2/μm±s）

表1 各組大鼠WAm/Pbm、WAi/Pbm比較（μm2/μm±s）

注：與空白對(duì)照組比較，?P<0.05；與哮喘組比較，★P<0.05。下同。

組別空白對(duì)照組哮喘組平喘顆粒組地塞米松組n 10 10 10 10 WAm/Pbm 7.77±0.31 17.22±0.59*9.28±0.39*★9.15±1.06*★WAi/Pbm 27.16±1.50 42.04±3.29*31.05±1.23*★30.59±1.56*★

2.3 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2、Smad3表達(dá)的比較 見(jiàn)圖2、表2。與空白對(duì)照組比較，哮喘組大鼠肺組織中TGF-β1、Smad2和Smad3的表達(dá)水平明顯增高（P<0.05）。給予平喘顆粒和地塞米松治療后，大鼠肺組織中TGF-β1、Smad2和Smad3的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），平喘顆粒組和地塞米松組TGF-β 1、Smad2和Smad3的表達(dá)水平比較無(wú)顯著差異（P>0.05）。

表2 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2和Smad3表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2和Smad3表達(dá)水平比較（±s）

組別空白對(duì)照組哮喘組平喘顆粒組地塞米松組n 10 10 10 10 TGF-β1 0.072±0.002 0.728±0.003*0.102±0.005*★0.099±0.006*★Smad2 0.080±0.004 0.665±0.003*0.283±0.006*★0.279±0.009*★Smad3 0.075±0.005 0.560±0.004*0.212±0.007*★0.208±0.002*★

圖2 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表達(dá)

3 討 論

氣道重塑是由于氣道內(nèi)慢性炎癥病變持續(xù)刺激致氣道損傷與組織增生而造成的氣道結(jié)構(gòu)異常改變，不僅導(dǎo)致患者呼吸困難，日久會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷肺功能，成為哮喘難以根治的主要原因［8-9］。TGF-β1被認(rèn)為是氣道重塑的重要中介［10-11］，通過(guò)促進(jìn)氣道纖維化和平滑肌增生肥大、誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、積聚膠原產(chǎn)生和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）等形式發(fā)揮作用［12-14］。哮喘發(fā)病時(shí)，肺和氣道內(nèi)多種炎性細(xì)胞可以釋放出大量的TGF-β1，TGF-β1介導(dǎo)下游的Smad蛋白發(fā)生磷酸化，通過(guò)自分泌和旁分泌途徑激活Smad2/3通路，Smad2、Smad3磷酸化后促進(jìn)α-SMA的表達(dá)，加重氣道重塑［15］。研究顯示，抑制Smad3磷酸化可以延緩上皮細(xì)胞EMT過(guò)程，調(diào)控ECM動(dòng)態(tài)平衡，從而改善氣道重塑［16］。

平喘顆粒是黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院自制的中藥制劑，全方由9味中藥組成。方中麻黃溫通宣肺平喘，淫羊藿入腎經(jīng)振奮陽(yáng)氣，二者為君，陽(yáng)氣通達(dá)，肺臟宣散之氣得以肅降，腎臟氣化功能得以恢復(fù)。五味子入肺腎二經(jīng)，斂肺止咳。太子參補(bǔ)脾肺氣陰兼化痰止咳，黃芪補(bǔ)脾升陽(yáng)，二者一陰一陽(yáng)，相須為用?？疃ㄐ沃箍?，地龍瀉熱平喘，以上5味共為臣藥。罌粟殼酸澀收斂，可斂肺氣以止咳，同時(shí)防止君藥辛散耗氣，為佐藥。知母甘寒養(yǎng)陰，潤(rùn)肺止咳，可降肺之氣逆，引諸藥歸經(jīng)，為使藥。方中藥物配伍升降有序，陰陽(yáng)同補(bǔ)，收散并用，補(bǔ)益臟氣、溫化痰濕、宣暢氣機(jī)，共奏溫陽(yáng)益氣，化痰平喘之功。研究顯示，平喘顆粒中的多種化學(xué)成分如淫羊藿苷、麻黃堿、黃芪多糖、黃芪甲苷、款冬花總倍半萜等均可以起到改善哮喘氣道重塑的作用［17-21］。

本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用OVA致敏液制備慢性哮喘大鼠模型，哮喘組大鼠可見(jiàn)氣道管腔變窄，氣管壁和氣道平滑肌厚度增加，氣道周?chē)^多的藍(lán)色膠原纖維組織等病理改變，WAm/Pbm、WAi/Pbm均明顯增高，表明哮喘模型制備成功，哮喘組大鼠存在氣道重塑。研究結(jié)果顯示，與哮喘組相比，平喘顆粒組和地塞米松組大鼠氣道病理結(jié)構(gòu)改變和膠原沉積均明顯減輕，WAm/Pbm、WAi/Pbm明顯下降（P<0.05），且肺組織中TGF-β1、Smad2和Smad3的表達(dá)水平明顯下降（P<0.05）。綜上所述，平喘顆粒可以減輕哮喘大鼠氣道重塑的病理改變，其機(jī)制可能與調(diào)控TGF-β1/Smads信號(hào)通路有關(guān)。哮喘是一種包含多種病理因素的復(fù)雜疾病，本文雖然探討了平喘顆粒在氣道重塑方面的相關(guān)機(jī)制，但在哮喘作用機(jī)制方面仍有許多值得研究的領(lǐng)域，如氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、免疫應(yīng)答、氧化應(yīng)激等，這些重要的作用機(jī)制以及平喘顆粒與其的關(guān)系還需要在未來(lái)更加深入的探索。