腸道微生物群落研究進展及合成微生物群落面臨的挑戰(zhàn)

胡 政 周 茜 張蒙蒙 肖敏鳳

1(中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院 合成生物學(xué)研究所 中國科學(xué)院定量工程生物學(xué)重點實驗室 深圳 518055)

2(中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

3(深圳華大生命科學(xué)研究院 深圳 518083)

4(深圳市未知病原體應(yīng)急檢測重點實驗室 深圳 518083)

1 引 言

人類腸道微生物群落由大量復(fù)雜的微生物組成，受到宿主的出生方式、生活方式和遺傳等因素影響[1-4]。腸道微生物群落在機體免疫[5]、腸道內(nèi)分泌[6]、藥物作用和代謝[7]、宿主疾病(如炎癥性腸炎[8-9]、腫瘤[10-13]、自閉癥[14]、肥胖[1,15-16]和糖尿病[17-19])等方面都具有重要作用，是疾病治療的理想靶點。然而，腸道菌群的種類及數(shù)量繁多且絕大多數(shù)腸道微生物都不能在體外培養(yǎng)，因此腸道微生物組在治療中的研究及應(yīng)用仍不成熟。盡管糞菌移植(Fecal Microbiota Transplantation，F(xiàn)MT)已經(jīng)成為一種恢復(fù)正常腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的方法，但近年來的一些臨床研究表明， FMT存在細菌播散感染的風(fēng)險[20-21]。因此，需要采用更加可控的方式進行腸道微生物群落的調(diào)控。

目前已經(jīng)通過基因組測序平臺對腸道微生物群落進行了大量研究，但微生物表型及其在微生物群落中的作用尚不能完全通過測序數(shù)據(jù)進行準(zhǔn)確預(yù)測。例如，2018 年的一項研究表明，僅基于基因組學(xué)和生長需求的文獻信息，75% 腸道細菌種類代謝模型未能預(yù)測同一細菌種類在不同培養(yǎng)基中的生長情況[22]。近年來，培養(yǎng)組學(xué)的迅速發(fā)展使得可培養(yǎng)腸道微生物種類顯著增加，然而這也僅僅占腸道微生物種類中極小的一部分[23]。解決這一問題的關(guān)鍵是引入工程化思維，結(jié)合基因組序列分析和培養(yǎng)組學(xué)的實驗方法，嚴(yán)格控制實驗系統(tǒng)中的變量，厘清微生物在腸道中的功能及其相互作用關(guān)系，從而為腸道微生物群落研究及應(yīng)用掃清障礙。

合成微生物群落是一類微生物組成已知且復(fù)雜性降低的系統(tǒng)，可以通過實驗干預(yù)和數(shù)學(xué)建模，實現(xiàn)對復(fù)雜的人類腸道微生物組的理解。宏基因組分析可促進對腸道菌群組成自上而下的觀察[24]，而自下而上的方法可以幫助理解這些復(fù)雜的微生物群落是如何形成、相互作用和影響宿主健康的[25-26]。采用合成生物學(xué)的方法能加深對腸道微生物群落功能的理解。本文綜述了腸道微生物群落的研究方法、影響微生物群落穩(wěn)定性的因素、合成腸道微生物群落領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)，以期更好地利用合成微生物群落促進人類健康。

2 腸道微生物群落的研究方法

目前，合成微生物群落有自上而下和自下而上兩種構(gòu)建方法(圖 1)。其中，自上而下的方法主要涉及宏基因組學(xué)研究，其重點在于了解腸道菌群組成，以及環(huán)境擾動下菌群組成變化；自下而上方法的重點在于理解不同微生物群落是如何形成、交流和影響其宿主健康的。

圖1 腸道微生物群落的研究方法Fig. 1 Methods for the study of intestinal microbial community

2.1 自上而下——利用宏組學(xué)研究微生物群落組成及功能

傳統(tǒng)微生物群落研究通常采用自上而下的方法，通過改變腸道或生物反應(yīng)器的生理生化性質(zhì)來獲得具有特定功能的微生物群落。隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展、測序費用降低而通量擴大，可以利用高通量測序的方法對腸道微生物群落進行研究。其中，16S rRNA 擴增子測序是最經(jīng)典的腸道菌群鑒定方法[27-28]。目前已經(jīng)有研究采用 16S rRNA絕對定量測序?qū)ξ⑸锶郝溥M行定量研究[28-29]。然而，這種方法僅限于“屬”水平的分辨率，且不能揭示人類腸道微生物組的功能作用。目前應(yīng)用最普遍的是采用宏基因組學(xué)方法對腸道環(huán)境中所有微生物的 DNA 進行測序。這種方式避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的缺陷，顯著提高了發(fā)現(xiàn)新微生物的能力，并能夠?qū)ι持形⑸锶郝涞慕M成、分布及其動態(tài)變化進行全面研究。大多數(shù)微生物數(shù)據(jù)都是通過糞便樣本的宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組研究收集的，而針對合成微生物組的宏蛋白質(zhì)組學(xué)的研究相對較少。在模擬人類合成腸道微生物群落時，宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以增加功能、分類和生物量維度。Liao 等[30]開發(fā)了一個 iMetaLab 平臺并將其用于分析宏蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，使用體外微生物培養(yǎng)進行宏蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)分析。宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組、宏蛋白質(zhì)組和宏代謝組學(xué)等的出現(xiàn)給腸道微生物群落研究帶來了新的變革，基于整合宏組學(xué)數(shù)據(jù)分析和合成微生物組模型已經(jīng)成為新的趨勢，使我們可以更全面地了解腸道微生物群落組成及其功能，更容易地控制微生物組培養(yǎng)過程中的時空變量，更好地優(yōu)化合成微生物群落以治療特定疾病，加快合成微生物群落的應(yīng)用進程。

2.2 自下而上——利用分離的微生物構(gòu)建合成微生物群落

采用合成生物學(xué)的思維自下而上地分離糞便樣本中的微生物以重建微生物群落，是一種了解腸道微生物群落的有效方式。這種方式具備以下優(yōu)勢：(1)合成微生物群落中的細菌組成已知、可控且具有較好的重復(fù)性；(2)由于沒有病毒和病原體，分離培養(yǎng)的微生物群落比糞便更穩(wěn)定、更安全；(3)可以根據(jù)菌株對環(huán)境的敏感性來選擇菌株，這進一步增大了合成微生物群落的成功率。通過將關(guān)鍵物種組合為穩(wěn)定的微生物群落，并與患者的微生物群落進行比較，能有效幫助設(shè)計合成平衡的人體腸道微生物群落。Petrof 等[31]設(shè)計了一個由 33 種細菌組成的合成微生物群落，發(fā)現(xiàn)這種合成的微生物群落能夠治療耐抗生素的艱難梭菌結(jié)腸炎。

3 自下而上合成微生物群落的方法

3.1 利用營養(yǎng)互補關(guān)系合成微生物群落

腸道微生物與其他生物及其環(huán)境進行復(fù)雜的相互作用，其中大多數(shù)微生物是營養(yǎng)缺陷型，其生長依賴外部營養(yǎng)物質(zhì)，包括氨基酸和維生素的交換[32]。因此，構(gòu)建營養(yǎng)互補的微生物群落從而模擬微生物的互利共生關(guān)系是一種構(gòu)建合成微生物群落的有效方式。一個典型的例子是 Mee 等[33]構(gòu)建的一個由氨基酸營養(yǎng)缺陷型的大腸桿菌菌株組成的交叉喂養(yǎng)群落。他們從大腸桿菌 MG1655 菌株中獲得了 14 個衍生營養(yǎng)缺陷型菌株，對每個菌株都敲除一個必需氨基酸的基因后，菌株兩兩共培養(yǎng)表現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用。400 代后，通過共享精氨酸、賴氨酸、蛋氨酸和蘇氨酸而建立強相互作用，從而獲得最快生長的配對營養(yǎng)缺陷型菌株占據(jù)了群落中的主導(dǎo)地位。類似地，在釀酒酵母和大腸桿菌等微生物中也構(gòu)建了利用氨基酸營養(yǎng)缺陷型菌株的營養(yǎng)互補關(guān)系合成微生物群落[34-35]。

3.2 利用群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控微生物群落

群體感應(yīng)(Quorum Sensing，QS)是細菌通過分泌和感受自誘導(dǎo)劑響應(yīng)環(huán)境變化的一種分子通訊的形式，利用信號分子增強微生物之間的群體感應(yīng)行為來優(yōu)化微生物群落結(jié)構(gòu)與組成有助于增強群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。但目前對群體感應(yīng)如何影響微生物群落的組成和功能仍不十分明確。細菌之間可通過群體感應(yīng)信號分子，如革蘭氏陰性菌用于種內(nèi)交流的高絲氨酸內(nèi)酯(Acyl-HSL)、革蘭氏陽性菌用于種內(nèi)交流的寡肽類分子(AI-P)以及不同種屬微生物之間可被多種細胞識別的 AI-2信號分子等進行交流[36]。在合成微生物群落中，可以通過改造群體感應(yīng)系統(tǒng)來調(diào)控微生物群落組成。Stephens 等[37]設(shè)計了一種在兩個大腸桿菌菌株中起作用的細菌群體感應(yīng)系統(tǒng)，通過細胞間的信號傳導(dǎo)來決定微生物群落內(nèi)細菌亞群的生長速度。第一種菌株感應(yīng)小分子信號 AI-2，產(chǎn)生自誘導(dǎo)因子 AI-1；第二種大腸桿菌菌株由前一種菌株產(chǎn)生的 AI-1 信號控制糖運輸?shù)鞍?HPr 的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)菌株在共培養(yǎng)中的生長速度，從而通過 AI-1和 AI-2 之間的制衡調(diào)節(jié)群落的構(gòu)成。Hong 等[38]基于細菌生物膜的共生關(guān)系，構(gòu)建了兩株交替形成不同菌膜的枯草芽孢桿菌。在E. coli中構(gòu)建的LasR QS 回路不但可以特異性識別銅綠假單胞菌產(chǎn)生的信號分子，且能利用該信號分子調(diào)控自身基因的表達，通過表達和分泌抗菌肽 Microcin S和核酸酶 DNase I 降解成熟的生物膜基質(zhì)并殺死包裹其中的細菌[39]。

3.3 利用噬菌體改造微生物群落

研究發(fā)現(xiàn)，人類腸道宏基因組測序讀長中約5%～6% 來自噬菌體[40]。腸道微生物、噬菌體與宿主之間具有動態(tài)相互作用[41]。Ma 等[42]利用人體腸道微生物大數(shù)據(jù)鑒定了大量的腸道噬菌體，這些噬菌體攜帶的功能基因與細菌在腸道中的生存適應(yīng)性相關(guān)。與廣譜性抗生素相比，噬菌體感染宿主細菌具有較高的專一性，因此利用噬菌體攜帶小分子藥物或 CRISPR 元件可能是精準(zhǔn)地消除微生物群落中的特定菌株或編輯微生物群落中特定基因的有效方式[42-43]。Song 等[44]開發(fā)了一種識別活性噬菌體的工具，有助于構(gòu)建工程化噬菌體并用于改造微生物群落。Hsu 等[45]使用限菌小鼠模型研究了噬菌體對腸道細菌群落的動態(tài)影響，發(fā)現(xiàn)噬菌體捕食不僅直接影響對噬菌體敏感的細菌，還通過細菌間的相互作用對其他細菌產(chǎn)生級聯(lián)效應(yīng)。此外，代謝組學(xué)分析顯示，噬菌體捕食引起的菌群變化對腸道代謝組產(chǎn)生了直接的影響。這些工作表明，利用噬菌體特異性感染并殺死細菌的特性改造噬菌體來實現(xiàn)調(diào)節(jié)和改造腸道菌群不失為一種具有前景的微生物群落調(diào)控方法，在哺乳動物疾病治療方面具有潛在的應(yīng)用價值。

4 影響腸道微生物群落穩(wěn)定性的因素

4.1 微生物之間的相互作用影響群落穩(wěn)定性

微生物群落的穩(wěn)定性十分重要，復(fù)雜群落內(nèi)微生物的相互作用一直是菌群研究的瓶頸之一。微生物的種間互作關(guān)系可以是正向也可以是負向的，即協(xié)同或拮抗[46]。通常情況下，群落相比單一物種具有更好的穩(wěn)定性和抗干擾能力。例如，Palleja 等[47]對健康成年人腸道微生物群落的研究發(fā)現(xiàn)，盡管抗生素處理初期出現(xiàn)了群落組成的改變，如腸桿菌和其他病原菌(糞腸球菌和核梭桿菌)的大量繁殖，以及雙歧桿菌和丁酸生產(chǎn)量的減少，但健康人的腸道菌群對短期廣譜抗生素干預(yù)有一定抵抗性，一段時間后群落組成逐漸恢復(fù)到接近原來的水平。然而，腸道中微生物相互作用如何影響群落的穩(wěn)定性尚不十分清楚。自然條件下的多細胞體系常常形成錯綜復(fù)雜的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)[32,46]。傳統(tǒng)觀點認為，在穩(wěn)態(tài)條件下，競爭單一限制性底物的物種不能共存，這樣的競爭關(guān)系組成的微生物群落穩(wěn)定性較低[48]。Coyte等[49]通過動力學(xué)分析表明，合作關(guān)系導(dǎo)致了物種與正反饋回路耦合，增強了微生物成員的依賴性，從而降低了群落的穩(wěn)定性。而競爭有助于提高微生物群落的穩(wěn)定性，即高物種豐度的微生物群落主要通過競爭關(guān)系抑制合作引起的正反饋回路，從而提高群落的穩(wěn)定性。Allesina 和 Tang[50]研究表明，復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性是由物種間相互作用的類型(捕食、競爭、互惠)和這些相互作用的強度決定的。應(yīng)充分考慮不同菌株間的相互作用關(guān)系，以構(gòu)建具有較高穩(wěn)定性的合成微生物群落。

4.2 微生物群落對宿主腸道免疫耐受是其成功定殖的關(guān)鍵

據(jù)估計，人類微生物群落中含有多達 1014個細菌細胞，是體內(nèi)存在的人類細胞數(shù)量的 10倍，腸腔成為人體和外來微生物直接接觸的最大區(qū)域[51-52]。由于營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)上皮細胞吸收，所以腸道表面必須保持一定的通透性，但同時，腸道作為免疫系統(tǒng)的一道重要防線，健康的腸道必須具備阻擋病原體的能力。因此，微生物群落需要在腸道內(nèi)成功生存并定殖才能發(fā)揮作用。微生物在腸道內(nèi)成功定殖主要有以下兩方面原因。

(1)腸道固有結(jié)構(gòu)層面，宿主腸道物理結(jié)構(gòu)(如腸絨毛)誘導(dǎo)腸道微生物區(qū)隔化。健康宿主腸道黏液屏障由高糖基化黏液蛋白 2(Mucin 2，MUC2)包圍形成。腸道黏膜的存在使得腸道免疫系統(tǒng)能夠?qū)Υ罅坎粩嘧兓臒o害微生物建立免疫耐受，同時保持免疫反應(yīng)，以抵御致病菌或共生菌入侵無菌身體環(huán)境[53-54]。此外，MUC2 也通過抑制腸道樹突狀細胞向炎性狀態(tài)轉(zhuǎn)變，從而限制了腸道抗原的免疫原性[55-56]。黏膜單層上皮細胞將腸腔與下層組織物理分隔，限制了上皮細胞屏障的通透性。因此，從物理結(jié)構(gòu)上保障了微生物群落在腸道內(nèi)的生存能力。

(2)生物層面，腸道共生細菌的存在可以幫助抵御外來微生物的入侵。許多常見的腸道菌群物種，如乳酸菌和雙歧桿菌可通過產(chǎn)生抗菌肽避免腸道感染外源微生物[57]。共生細菌也通過支持上皮屏障，協(xié)助傷口愈合，招募中性粒細胞和白細胞等方式調(diào)控免疫系統(tǒng)。在一些研究中，共生細菌 DNA 通過調(diào)節(jié)不同類型 T 細胞的水平，幫助宿主對潛在的病原體作出反應(yīng)，甚至阻止腫瘤的發(fā)生[58]。微生物代謝物，如芳烴受體 AHR 的配體吲哚-3-醛，能刺激 ILC3，從而誘導(dǎo) IL-22的產(chǎn)生。其中，IL-22 上調(diào)腺苷一磷酸(AMP)的表達，來提高腸道對病原菌的定殖抗性[59]。研究表明，無菌小鼠腸道固有層中產(chǎn)生 IgA 的漿細胞和 CD4＋T 細胞水平急劇下降，黏液層變薄且組成異常，防御素表達受損。與微生物群落完整的小鼠相比，無菌小鼠腸道相關(guān)淋巴組織(Peyer’s Patches，腸系膜淋巴結(jié))更小，包含的免疫細胞數(shù)量和種類更少。因此，無菌小鼠更容易受到細菌感染，某些疾病的癥狀也可能更嚴(yán)重[57,60-61]。利用這一點，通常采用抗生素處理減少腸道細菌，從而提高合成微生物群落在腸道內(nèi)的定殖水平。

4.3 微生物群落的空間分布影響其環(huán)境適應(yīng)能力

腸道微生物表現(xiàn)出不同的黏附特性和生長速率，這可能導(dǎo)致腸道微生物群落成員的空間分布差異[62-63]。基于微生物在黏液層或管腔中的定位而產(chǎn)生的差異復(fù)制可能進一步放大因不同黏附情況形成的差異[64-65]?？臻g結(jié)構(gòu)對建立和維持腸道微生物群落成員與宿主之間關(guān)系的信號和代謝交換有較大的影響。然而，關(guān)于腸道微生物群落空間分布的信息有限。Mark Welch 等[66]從人類糞便中分離出 15 種微生物，組成合成生態(tài)系統(tǒng)用于研究腸道微生物群落空間分布。然而，微生物并未呈現(xiàn)出典型的位置特異性分布，只是在一些位置中的細菌組成比例有所差異，如腸內(nèi)壁被黏液包裹的上皮細胞以及中央富含食物和黏液的腸腔中。這些位置的微生物種群與整體組成有所不同，即不同細菌的相對比例可能會發(fā)生波動，但整體上細菌分布并沒有明顯差異。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，MaPS-seq 得以實現(xiàn)腸道細菌生物地理圖譜的繪制，揭示群落功能的相互作用。小鼠腸道不同區(qū)域內(nèi)，微生物分布不均，但在小尺度(7 μm 左右)范圍內(nèi)部分細菌呈現(xiàn)一定的相關(guān)性[67]。高豐度擬桿菌門(Bacteroidales)類群的物種通常含有多種碳水化合物活性酶[68]，且能通過協(xié)同代謝互養(yǎng)共生，促進細菌空間共生[69]。而共生群落在應(yīng)對不同環(huán)境時表現(xiàn)出的種群空間協(xié)作行為，有利于提高其環(huán)境適應(yīng)性[70]。Coyte 等[49]的模型表明，空間結(jié)構(gòu)的引入在不減弱細菌相互作用的前提下提高了其群落穩(wěn)定性，因此，腸道微生物可能會通過空間上的分區(qū)更好地發(fā)揮功能來適應(yīng)環(huán)境。

5 優(yōu)化合成腸道微生物群落面臨的挑戰(zhàn)

5.1 確定核心微生物及其代謝功能

目前，主要通過以下幾個指標(biāo)來評價合成腸道生態(tài)系統(tǒng)的有效性：核心腸道微生物的相對豐度、反映微生物豐富度和均勻度的微生物多樣性指數(shù)、短鏈脂肪酸等主要腸道代謝產(chǎn)物的含量和比例等[51]。然而，人類腸道菌群的微生物種類及數(shù)量極為豐富，難以確定核心腸道微生物及其代謝功能。由于代謝相互作用的強弱與空間相對位置有關(guān)，在物種選擇上有必要考慮物種空間位置及其代謝功能進行綜合判斷。群落的復(fù)雜性也是需要考慮的一個重要因素。其中，低復(fù)雜性的群落具有更高的可重復(fù)性和操作性，但有可能缺少自然群落中的關(guān)鍵物種或功能物種。高復(fù)雜性的群落在維持群落的多樣性上更具優(yōu)勢，但這也意味著可操作性降低，需要對群落成分比例進行更精細的設(shè)定。此外，疾病類型、治療方法、患者性別、年齡和飲食習(xí)慣等因素都會造成腸道菌群的改變[8,13,71-74]，因此需要整合這些因素進行微生物群落組成分析，以建立個性化的合成腸道生態(tài)系統(tǒng)。

5.2 選擇合適的培養(yǎng)系統(tǒng)分離腸道微生物

選擇適合微生物群落中各種細菌生長的培養(yǎng)基是十分必要的。迄今為止，大多數(shù)腸道微生物群落都是在化學(xué)成分未知的復(fù)雜培養(yǎng)基中培養(yǎng)，而在特定或最小培養(yǎng)基中只有少數(shù)微生物能生長，這不利于腸道微生物的分離和培養(yǎng)。腸道中大多數(shù)微生物的分離需要采用厭氧培養(yǎng)。由于厭氧培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基，如 GAM 厭氧培養(yǎng)基(Gifu Anaerobic Medium)、BHI 培養(yǎng)基(Brain-Heart Infusion Broth)、強化梭菌培養(yǎng)基、胰蛋白酶大豆培養(yǎng)基等具有特殊性，培養(yǎng)基的選擇極大地限制了微生物群落的構(gòu)建[75]。近年來，培養(yǎng)組學(xué)方法使得多種以前不能培養(yǎng)的微生物得以成功培養(yǎng)和鑒定，在此過程中培養(yǎng)系統(tǒng)的改進起著至關(guān)重要的作用[23,75-78]。Magnusdottir 等[79]結(jié)合了大數(shù)據(jù)和人工智能的方式構(gòu)建了一個包含 773 個不同腸道微生物的計算機模型 AGORA(Assembly of Gut Organisms Through Reconstruction and Analysis)來模擬微生物代謝過程，分析各菌株對其他微生物及宿主代謝的影響，針對擬培養(yǎng)的特定的腸道微生物群落優(yōu)化培養(yǎng)基組成。另外，Yang 等[80]采用基于質(zhì)譜的靶向代謝組學(xué)方法研究了無機鹽、膽鹽、短鏈脂肪酸和黏蛋白等 4 種培養(yǎng)基成分對體外培養(yǎng)的腸道微生物群落的調(diào)控作用，結(jié)果表明，在體外培養(yǎng)過程中應(yīng)補充相應(yīng)成分以模擬腸道環(huán)境。

5.3 選擇合適的研究模型

確定合成微生物群落的培養(yǎng)條件后，需要采用模擬腸道環(huán)境的不同體外模型對合成微生物群落的功能進行測試與評估。利用簡單的腸道生物反應(yīng)器系統(tǒng)(如微量孔板系統(tǒng))能有效地研究益生菌和藥物與腸道微生物群落的簡單相互作用[81]。連續(xù)生物反應(yīng)器系統(tǒng)(如多級結(jié)腸模型)能調(diào)控物質(zhì)的流入和流出，能幫助理解營養(yǎng)物質(zhì)、pH 及其他條件對腸道微生物群落的長期影響，有助于設(shè)計合成腸道微生物群落[82-83]。

早期研究中所用到的生物反應(yīng)器與實際腸道環(huán)境有較大差異，因此，近年來一些研究采用生物反應(yīng)器與模擬消化系統(tǒng)相結(jié)合來更好地模擬腸道生理生化環(huán)境，包括消化酶和膽鹽的添加、pH 和停留時間的改變以及模擬人類腸道的蠕動運動等。然而，這類生物反應(yīng)器系統(tǒng)均未考慮宿主上皮系統(tǒng)的影響。近年來，HuMiX 平臺和腸芯片等體外腸道模型增加了宿主黏液層和人類細胞系，以更好地模擬宿主-微生物相互作用，因而得到了腸道微生物群落研究者的青睞[84-87]。然而，現(xiàn)有的腸道模型仍需要進一步發(fā)展。

盡管這些反映宿主效應(yīng)的體外模型可以在一定程度上研究多種代謝活性腸道微生物群落的作用，但最終其代謝產(chǎn)物和微生物群落的組成可能與人類腸道微生物不同。因此，有必要在動物模型(如秀麗隱桿線蟲和小鼠)中評價合成微生物群落的有效性。一些體內(nèi)腸道微生物群落研究只使用了小鼠，但某些不可忽視的宿主特異性差異仍然存在于小鼠和人之間，包括免疫差異、轉(zhuǎn)運時間及腸道結(jié)構(gòu)等因素?，F(xiàn)有的活體研究在直接預(yù)測合成微生物群落的作用方面也有局限性。因此，腸道微生物群落及宿主的相互關(guān)系需要通過合成腸道生態(tài)系統(tǒng)和活體動物模型相結(jié)合開展研究。

5.4 選擇合適的數(shù)學(xué)模型

數(shù)學(xué)建模在理解腸道微生物群落動態(tài)和行為方面具有重要價值。通過宏組學(xué)可以獲得腸道微生物群落的動態(tài)變化，結(jié)合數(shù)學(xué)模型又為理解群落動力學(xué)的機制和基本原理提供新的方向。由于腸道微生物群落組成極其復(fù)雜，因此，需要對群落結(jié)構(gòu)進行簡化，以進行數(shù)學(xué)模型開發(fā)和校正，校正后的模型可以進一步通過實驗進行測試。不斷改進的數(shù)學(xué)模型和實驗驗證可以更好地理解人類腸道微生物群落中的相互作用。

腸道微生物群落中常采用基于微分方程的動力學(xué)模型進行群落動態(tài)研究，如廣義的 Lotka-Volterra 模型(GLV)。GLV 模型利用個體種群的內(nèi)在增長率和微生物種群間相互作用調(diào)節(jié)的增長率來解釋群落動態(tài)，由于模型假設(shè)的參數(shù)比其他模型要少，因此該模型便于結(jié)合實驗進行驗證[88-89]。已有研究表明，腸道細菌可能有助于控制調(diào)節(jié)性 T 細胞(Regulatory T Cells，Treg)的數(shù)量。特定的細菌組合可以刺激這些 Treg 細胞，并可能抑制炎癥。通過調(diào)節(jié)腸道中不同種類的微生物可能為治療潰瘍性結(jié)腸炎等疾病提供一種新方法。然而，逐一測試腸道微生物群落的組成極具挑戰(zhàn)性。因此，Stein 等[89]利用擴展的GLV 模型探究感染和炎癥性疾病(包括艱難梭菌定殖和炎癥性腸病)背景下微生物組的時序動力學(xué)并預(yù)測其穩(wěn)定性。

隨著高通量測序、多組學(xué)聯(lián)合分析的發(fā)展，各種數(shù)學(xué)建模和實驗的綜合方法已被應(yīng)用于不同分辨率、時間和空間尺度的腸道微生物群落，包括基因、個體和種群。構(gòu)建基因組尺度代謝模型(Genome-Scale Metabolic Models，GEMs)描述微生物群落的代謝途徑能更好地利用組學(xué)數(shù)據(jù)進行綜合分析。GEMs 建模方法通常是基于高通量組學(xué)數(shù)據(jù)和已知的生化反應(yīng)數(shù)據(jù)庫，從而構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò)。其中，代謝流平衡分析(Flux Balance Analysis，F(xiàn)BA)采用數(shù)學(xué)方法對代謝網(wǎng)絡(luò)里的代謝流進行擬合分析，是目前微生物群落代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)及代謝模擬最常用的方法之一。FBA 分析主要用于描述穩(wěn)態(tài)下(即群落代謝物的產(chǎn)生與消耗平衡)的系統(tǒng)特性，采用胞內(nèi)代謝物達到平衡后的數(shù)據(jù)計算不同支路代謝流的分布情況，定量預(yù)測細胞內(nèi)的反應(yīng)通量、代謝物的消耗與產(chǎn)生速率以及細胞生長速率，從而獲得特定條件下細胞代謝的全景。Cole 等[90]通過空間擴散模型耦合多個動態(tài) FBA 模型的方式提出空間動態(tài)通量平衡分析(3-Dimensional Dynamic Flux-Balance Analysis，3DdFBA)，模擬細菌與其他細菌的代謝產(chǎn)物交換，預(yù)測了大腸桿菌菌落的生長特征，并識別出醋酸鹽和乳酸鹽的交叉喂養(yǎng)情況。Chan等[91]在 FBA 模型的基礎(chǔ)上給群落所有成員施加了恒定的平均增長率以確保群落的共存和穩(wěn)定。在沒有這種限制的情況下，生長速度更快的微生物最終將取代群落中的其他微生物。

近年來，機器學(xué)習(xí)和深度學(xué)習(xí)算法在腸道菌群數(shù)據(jù)挖掘方面取得了較大的進展：基于組學(xué)數(shù)據(jù)的建?？梢灶A(yù)測多菌株群落的交叉喂養(yǎng)和競爭機制，根據(jù)微生物代謝產(chǎn)物(如丁酸鹽和功能性胞外多糖等)設(shè)計最佳微生物群落[79,92]。有研究團隊利用機器學(xué)習(xí)從多組學(xué)數(shù)據(jù)中識別噬菌體并挖掘噬菌體與細菌宿主的關(guān)系，為利用噬菌體改造微生物群落奠定了基礎(chǔ)[44,93-97]。然而，盡管利用機器學(xué)習(xí)算法進行腸道菌群數(shù)據(jù)分析具有很好的應(yīng)用前景，但不可否認的是其仍存在以下不足：(1)缺乏對機器學(xué)習(xí)算法的設(shè)計及特異性優(yōu)化；(2)機器學(xué)習(xí)通常需要大量的訓(xùn)練數(shù)據(jù)，若訓(xùn)練數(shù)據(jù)集的規(guī)模不夠大則容易導(dǎo)致構(gòu)建的模型不具有普適性；(3)腸道菌群的數(shù)據(jù)影響因素較多，導(dǎo)致數(shù)據(jù)可能不具有足夠的特征性，難以獲得性能良好的訓(xùn)練模型[98]。機器學(xué)習(xí)和深度學(xué)習(xí)算法作為腸道微生物群落數(shù)據(jù)分析及合成微生物群落構(gòu)建的工具仍需要進一步優(yōu)化(圖 2)。

圖2 合成腸道微生物群落面臨的挑戰(zhàn)Fig. 2 Challenges in synthesizing the gut microbiome

綜上，選擇合適的數(shù)學(xué)模型有助于更好地分析腸道微生物群落數(shù)據(jù)、理解微生物群落中的相互作用并優(yōu)化腸道微生物群落的組成。

6 總結(jié)與展望

自上而下的宏組學(xué)研究方法及自下而上的合成生物學(xué)技術(shù)手段在腸道微生物群落研究中均發(fā)揮著獨特的作用，具有較大的應(yīng)用潛力，但仍有較多問題亟待解決。例如，需要優(yōu)化宏組學(xué)大數(shù)據(jù)分析方法，獲得更準(zhǔn)確的微生物代謝及相互作用等信息；需要確定在不同類型腸道疾病治療中，什么情況下合成微生物群落較單菌更具有優(yōu)勢；微生物群落的物種數(shù)量是否存在最優(yōu)解；如何優(yōu)化細胞通信基因回路、改進微生物與宿主代謝互作網(wǎng)絡(luò)提高合成微生物群落各組分在腸道中承擔(dān)復(fù)雜任務(wù)、發(fā)揮特定功能的能力[99]；如何通過揭示控制腸道微生物自身及其與宿主的相互作用規(guī)律幫助我們理性設(shè)計腸道微生物群落，從而幫助改善人體健康；隨著測序技術(shù)的進一步發(fā)展，如何整合繁雜的宏組學(xué)數(shù)據(jù)進一步優(yōu)化微生物群落用于疾病監(jiān)測與治療。未來應(yīng)深化宏組學(xué)、合成生物學(xué)與其他學(xué)科的交叉，充分利用宏組學(xué)的大數(shù)據(jù)特征及合成生物學(xué)的定量、工程化等優(yōu)勢，進一步開展對天然微生物群落相互作用機制的研究，最終設(shè)計一套普適性強、穩(wěn)定性高、精確可控的合成微生物群落構(gòu)建方法，以應(yīng)用于人類健康事業(yè)。