楊樹轉(zhuǎn)錄因子PsnNAC030基因功能1)

王雪怡 張雪梅 程紫涵 劉霖 姜廷波 劉煥臻

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

植物在生長過程中經(jīng)常遭受鹽堿、干旱、極端溫度等各種非生物脅迫的影響，導(dǎo)致植物發(fā)育矮小、作物產(chǎn)量降低，甚至造成死亡，嚴(yán)重影響農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境[1-3]。土壤鹽漬化是荒漠化和土地退化的主要類型之一，高鹽環(huán)境已成為我國乃至全世界最主要也是影響范圍最廣泛的環(huán)境脅迫因子[4-5]。過量的鹽分可以通過滲透脅迫、離子毒害等途徑改變植物的細(xì)胞膜透性和營養(yǎng)狀況，減少植物對營養(yǎng)元素的吸收并造成植物生理代謝的紊亂，影響植物的生長、發(fā)育和再生[5]。由于全球氣候變暖，加快地面水分蒸發(fā)，導(dǎo)致世界上很多地區(qū)水供應(yīng)減少，而缺水(干旱)也成為限制植物生長發(fā)育的主要影響因子之一。干旱環(huán)境往往會抑制芽生長和新葉萌生、促進(jìn)老葉衰老等[6-10]，與極端溫度相似，也會通過蛋白質(zhì)變性、產(chǎn)生活性氧以及細(xì)胞膜不穩(wěn)定等方式來破壞細(xì)胞成分，對植物生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響[11-16]。因此，當(dāng)植物處于逆境下迅速激活保護(hù)機(jī)制來維持其自身細(xì)胞穩(wěn)定是非常重要的。

植物內(nèi)存在一系列轉(zhuǎn)錄因子，比如NAC、WRKY、AP2/ERF、bZIP、MYB等轉(zhuǎn)錄因子家族基因[17]，當(dāng)植物處于逆境脅迫環(huán)境時，轉(zhuǎn)錄因子基因能夠應(yīng)答環(huán)境脅迫或受環(huán)境脅迫因子誘導(dǎo)表達(dá)，通過基因啟動子中的順勢作用元件調(diào)控下游功能基因的表達(dá)，從而調(diào)控其生長發(fā)育以及對環(huán)境脅迫的適應(yīng)能力[18-19]。其中，NAC是植物所特有的且具有多種生物功能的轉(zhuǎn)錄因子，目前在毛果楊(Populustrichocarpa)和胡楊(P.euphratica)中分別發(fā)現(xiàn)170和145個NAC轉(zhuǎn)錄因子基因，在其他植物如擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum)等也都相繼發(fā)現(xiàn)NAC轉(zhuǎn)錄因子[20]。NAC轉(zhuǎn)錄因子基因不僅參與植物生長[21]、胚胎發(fā)育[22]、花形態(tài)發(fā)生[23]、葉片細(xì)胞程序性死亡[24]、側(cè)根形成[25]、細(xì)胞分裂[26]和細(xì)胞壁發(fā)育[27]等植物生長發(fā)育過程，還在逆境脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。如Movahedi等[28]發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)CarNAC3轉(zhuǎn)基因楊樹(P.deltoides×P.euramericanacv‘Nanlin895’)中，脯氨酸和光合色素水平增加，并且相對于野生型其耐鹽性顯著增強(qiáng)；水稻SNAC1基因主要在氣孔的保衛(wèi)細(xì)胞中被誘導(dǎo)表達(dá)，干旱脅迫時促進(jìn)氣孔關(guān)閉，可以提高水稻的抗旱性[29]；通過表達(dá)小麥TaNAC2基因可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱、鹽、冷凍脅迫的耐受性[30]。

小黑楊主要分布在我國東北、西北、華北等地區(qū)，具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力及抗鹽堿、抗旱、抗寒等優(yōu)良特性，是速生豐產(chǎn)的好樹種；同時也是我國重要的造林、綠化樹種以及林木基因工程和生理功能研究的模式植物[31-33]。本研究從小黑楊中克隆出PsnNAC030基因，分析其在不同脅迫條件下的表達(dá)模式，為明確其在楊樹中抗逆脅迫機(jī)制和生物功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

以生長狀態(tài)良好的小黑楊組培苗為試驗材料，生長條件為14 h光/10 h暗、(24±1)℃、相對濕度60%～70%。采集完全舒展的葉片提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后作為模板用于PsnNAC030基因的克隆。

將組培時間為一個月且長勢一致的小黑楊組培苗洗凈培養(yǎng)基后清水培養(yǎng)30 d左右，長出新的根、莖、葉后，分成5組，分別用于NaCl、干旱、高溫、低溫、ABA脅迫處理，其中NaCl脅迫：用150 mmol/L NaCl溶液處理小黑楊幼苗；干旱脅迫：無水處理小黑楊幼苗；高溫脅迫：在培養(yǎng)箱37 ℃處理小黑楊幼苗；低溫脅迫：在培養(yǎng)箱4 ℃處理小黑楊幼苗；ABA脅迫：用50 μmol/L ABA處理小黑楊幼苗。在上述處理0、3、6、12、24和48 h時，對小黑楊幼苗的葉片、莖、根組織分別進(jìn)行取樣。NaCl、干旱、ABA脅迫處理培養(yǎng)條件為14 h光/10 h暗、24 ℃、相對濕度60%；高溫、低溫脅迫處理培養(yǎng)條件為14 h光/10 h暗、37 ℃和4 ℃、相對濕度60%。所有處理及每個時間點(diǎn)均包含3個生物重復(fù)。

1.1 楊樹轉(zhuǎn)錄因子PsnNAC030基因的克隆

根據(jù)Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)在線軟件獲取毛果楊(P.trichocarpa)轉(zhuǎn)錄因子基因(Potri.002G081000.1)的CDS序列，以該序列為參照設(shè)計長為24 bp的引物NAC030F1(5’-ATGACGGCGGCAACATTAGAGTTA-3’)和NAC030R1(5’-TCAAAACGGCTTCTGCAGGTGCAT-3’)，以小黑楊cDNA為模板，按照預(yù)變性95 ℃，3 min；變性95 ℃，30 s；退火52 ℃，30 s；延伸72 ℃，1 min，34輪循環(huán)；再延伸72 ℃，10 min的PCR反應(yīng)程序擴(kuò)增PsnNAC030基因。

1.2 楊樹轉(zhuǎn)錄因子PsnNAC030基因的生物信息學(xué)

獲取長度正確的PsnNAC030基因條帶，并且膠回收送至擎科生物公司測序，利用NCBI數(shù)據(jù)庫Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)將測序所得序列與毛果楊Potri.002G081000.1的CDS序列和氨基酸序列進(jìn)行比對，將比對率高的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

利用ExPASy在線軟件提供的Protparam軟件(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)對PsnNAC030基因的分子量、等電點(diǎn)等相關(guān)理化性質(zhì)進(jìn)行分析，并用ExPASy提供的Protscale(https://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale)預(yù)測PsnNAC030基因疏水性；根據(jù)TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/cgi-bin/webface2.fcgi?jobid=5D47A7600000337DC54C5365&wait=20)對PsnNAC030基因的跨膜區(qū)進(jìn)行分析；通過在線軟件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)分析PsnNAC030蛋白的二級結(jié)構(gòu)，并用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive/YgkGJD/models/)預(yù)測PsnNAC030蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

利用Structure(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測PsnNAC030蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，然后根據(jù)BlastP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp)獲取與PsnNAC030氨基酸序列同源性較高的不同物種，利用ClustalW軟件進(jìn)行多序列比對，并用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 PsnNAC030-GFP融合表達(dá)載體的構(gòu)建及亞細(xì)胞定位

將條帶正確的PsnNAC030基因膠回收產(chǎn)物作為模板，以NAC030F3(5’-GGGTCGACTGACTAGTATGACGGCGGCAACATTAGAGT-3’)和NAC030R3(5’-TGCTCACCATACTAGTAAACGGCTTCTGCAGGTGCA-3’)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(下劃線處均為加入的酶切位點(diǎn)SpeI)，然后用1%瓊脂糖凝膠跑膠檢測并膠回收。將GFP質(zhì)粒經(jīng)過SpeI酶切線性化后膠回收，向微型離心管內(nèi)分別加入1 μL GFP線性化產(chǎn)物、4 μLPsnNAC030基因膠回收產(chǎn)物和5 μL Infusion酶，置于水浴鍋50 ℃內(nèi)連接20 min，然后迅速冰浴5 min，接著將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TOP10。從載體上設(shè)計引物pBI121F和pBI121R，通過PCR擴(kuò)增檢測單克隆菌落，將條帶正確且測序正確的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，次日進(jìn)行質(zhì)粒提取，形成包含PsnNAC030-GFP融合蛋白的植物重組表達(dá)載體。

通過基因槍瞬時轉(zhuǎn)化法[31]將陽性對照GFP質(zhì)粒和融合表達(dá)蛋白PsnNAC030-GFP分別轉(zhuǎn)化入洋蔥表皮，置于黑暗條件下共培養(yǎng)48 h，之后在激光共聚焦顯微鏡(LSM 700，Zeiss，Germany)下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。

1.4 pGBKT7-NAC030融合表達(dá)蛋白的獲得及自激活活性

以PsnNAC030基因膠回收產(chǎn)物作為模板，設(shè)計引物NAC030F4(5’-CATATGATGACGGCGGCAACATTAGAGT-3’，下劃線處為酶切位點(diǎn)NdeI)和NAC030R4(5’-GTCGACTCAAAACGGCTTCTGCAGGTGC-3’，下劃線處為酶切位點(diǎn)SalI)進(jìn)行PCR擴(kuò)增并膠回收，向膠回收產(chǎn)物和pGBKT7質(zhì)粒中分別加入NdeI和SalI限制性核酸內(nèi)切酶，雙酶切后進(jìn)行膠回收，另取PCR管加入4 μL基因膠回收產(chǎn)物、1 μL pGBKT7線性化產(chǎn)物和5 μL T4連接酶過夜連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將獲取的陽性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，命名為pGBKT7-NAC030。根據(jù)CloneTech酵母雙雜試劑盒提供的方法，將陰性對照pGBKT7質(zhì)粒，陽性對照pGBKT7-53-pGADT7以及融合表達(dá)蛋白pGBKT7-NAC030質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入酵母菌株Y2Hgold，并分別涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-His/X-a-Gal培養(yǎng)基上進(jìn)行驗證。

1.5 PsnNAC030基因表達(dá)的qRT-PCR

為了探究PsnNAC030基因經(jīng)過NaCl、干旱、高低溫、ABA脅迫誘導(dǎo)后在小黑楊各個組織中的相對表達(dá)量，提取處理后小黑楊各組織樣品的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA用于實(shí)時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)分析。

根據(jù)定量引物設(shè)計原則，在PsnNAC030基因的非保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計引物NAC030F2(5’-GGCTGGATGATTGGGTAC-3’)和NAC030R2(5’-CCGTCGGATTCGCTTTCT-3’)進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)程序為：95.0 ℃ 30 s，95.0 ℃ 5 s，60.0 ℃,34 s，95.0 ℃ 15 s，60.0 ℃ 1 min，95.0 ℃ 15 s，置于定量PCR儀7500 Real Time PCR System中。根據(jù)2-ΔΔCt法[31]分析數(shù)據(jù)，計算目的基因PsnNAC030的相對表達(dá)水平。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010統(tǒng)計數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。采用Excel 2010 Student’s T-Test進(jìn)行差異顯著性方差分析，在0.01和0.05水平下檢驗各組之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹轉(zhuǎn)錄因子PsnNAC030基因的克隆與生物信息學(xué)

通過PCR擴(kuò)增從小黑楊組織中克隆出長度為876 bp的PsnNAC030基因cDNA片段(圖1)，該基因編碼291個氨基酸。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫Blast核苷酸和氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，小黑楊PsnNAC030基因的核苷酸序列和氨基酸序列與毛果楊Potri.002G081000.1基因的同源比對率分別達(dá)到98.97%和98.63%。

M為DL2000;1為PsnNAC030基因條帶。

對小黑楊PsnNAC030基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析表明，PsnNAC030蛋白的氨基酸分子質(zhì)量為33 270.73，分子式為C1496H2291N401O439S11，共包含4 638個原子，理論等電點(diǎn)(pI)為6.40，不穩(wěn)定系數(shù)(II)計算值達(dá)到52.03(II>40不穩(wěn)定，II<40穩(wěn)定)，脂肪系數(shù)(AI)為68.73，總平均親水性(GRAVY)是-0.666(GRAVY>0疏水性蛋白，GRAVY<0親水性蛋白)，因而該蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白。另外，通過TMHMM Server v.2.0分析表明小黑楊PsnNAC030蛋白是非跨膜蛋白，不含跨膜區(qū)域。對該蛋白序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，該蛋白包含19.59%的α螺旋、12.37%延伸鏈(Extended strand)、4.12%的β轉(zhuǎn)角和63.92%的不規(guī)則螺旋。該蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖2所示，由4個α螺旋(α1、α2、α3和α4)和多個β折疊相互纏繞并通過多個循環(huán)連接形成具有一定規(guī)律的二聚體三維空間結(jié)構(gòu)。

圖2 SWISS-MODEL同源建模預(yù)測PsnNAC030蛋白的三級結(jié)構(gòu)

系統(tǒng)進(jìn)化樹和同源序列比對表明小黑楊PsnNAC030蛋白在第9到第132個氨基酸之間有一個高度保守的NAM(No apical meristem，非頂端分生組織)結(jié)構(gòu)域(如圖3A)。該結(jié)構(gòu)域由124個氨基酸組成，與毛果楊PtrNAC030(Potri.002G081000.1)、PtrNAC034(Potri.005G180200.1)和胡楊XP_011027492.1高度同源，同源比對率分別為98.63%、87.37%和97.59%(圖3B和3C)。

A.PsnNAC030蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測；B.PsnNAC030同源蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析；C.同源序列比對，黑方框內(nèi)為高度保守結(jié)構(gòu)域NAM。

2.2 楊樹PsnNAC030蛋白的亞細(xì)胞定位

如圖4A所示，將35S::GFP質(zhì)粒用SpeI酶切線性化后在2 000 bp以上有一條清晰的條帶，小黑楊PsnNAC030基因以NAC030GFP-F和NAC030GFP-R為引物擴(kuò)增后獲得兩端加入SpeI酶切位點(diǎn)且不含終止密碼子的PsnNAC030片段，經(jīng)過注入同源重組連接并轉(zhuǎn)入TOP10大腸桿菌，挑取單菌落以pBI121F和pBI121R為引物進(jìn)行PCR檢測，將片段長度為2 200 bp左右的單菌落(圖4B)擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒用于基因槍瞬時轉(zhuǎn)化。

如圖5所示，經(jīng)過基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化洋蔥下表皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，陽性對照35S::GFP在細(xì)胞內(nèi)全表達(dá)，即在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜等均有綠色熒光出現(xiàn)，而融合表達(dá)蛋白PsnNAC030-GFP僅在細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)明亮的綠色熒光，證明PsnNAC030蛋白定位在細(xì)胞核中。

A.35S::GFP質(zhì)粒單酶切與PsnNAC030擴(kuò)增，M為DL2000；1為35S::GFP經(jīng)過SpeI酶切后的條帶；2為PsnNAC030經(jīng)過NAC030GFP-F和NAC030GFP-R擴(kuò)增后的條帶；B.PsnNAC030-GFP融合表達(dá)載體的檢測。

A、D為暗場觀察；B、E為明場觀察；C、F為明暗場綜合圖；比例尺=20 μm。

2.3 楊樹PsnNAC030蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性

為了驗證小黑楊PsnNAC030蛋白是否具有自激活活性，將PsnNAC030連接到pGBKT7載體的GAL4 DNA結(jié)合域，并轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2Hgold。如圖6所示，所有轉(zhuǎn)化子均能在SD/-Trp缺陷培養(yǎng)基上生長，但在SD/-Trp/-His二缺培養(yǎng)基上只有陽性對照與pGBKT7-NAC030能正常生長且在SD/-Trp/-His/X-a-Gal培養(yǎng)基上變藍(lán)，結(jié)果表明小黑楊PsnNAC030蛋白具有自激活活性。

圖6 小黑楊PsnNAC030蛋白的自激活驗證

2.4 楊樹轉(zhuǎn)錄因子PsnNAC030基因的時空表達(dá)

利用qRT-PCR對楊樹轉(zhuǎn)錄因子PsnNAC030基因在150 mmol/L NaCl、干旱、37 ℃、4 ℃、50 μmol/L ABA脅迫條件下時空表達(dá)模式進(jìn)行分析。以脅迫處理0 h時該基因表達(dá)量為基準(zhǔn)，來分析不同脅迫下不同組織和不同時間點(diǎn)該基因的相對表達(dá)量。

結(jié)果表明，經(jīng)150 mmol/L NaCl溶液處理后PsnNAC030基因在葉莖根各組織中的相對表達(dá)量均呈現(xiàn)出上調(diào)趨勢，且在脅迫處理24 h后達(dá)到最大，表達(dá)量分別為8.701、7.436、5.557倍，之后其相對表達(dá)量水平有所下降；與莖根相比，該基因在葉中上調(diào)表達(dá)最為顯著，其次是莖、根(表1)。

表1 鹽脅迫下小黑楊PsnNAC030基因的相對表達(dá)量

經(jīng)干旱處理后PsnNAC030基因在葉和根中的相對表達(dá)量均呈先上調(diào)后下調(diào)的趨勢，且在脅迫處理12、24 h后達(dá)到最大，其相對表達(dá)量分別為31.643、23.657倍；在莖中呈先下調(diào)后上調(diào)再下調(diào)的趨勢，且在脅迫3 h時出現(xiàn)第一個峰值，為42.986倍，脅迫12 h達(dá)到另一個峰值，為17.802倍；該基因在莖中表達(dá)量與根和葉中相比較顯著，其次是葉、根(表2)。

表2 干旱脅迫下小黑楊PsnNAC030基因的相對表達(dá)量

經(jīng)37 ℃高溫處理后PsnNAC030基因在葉中呈上調(diào)表達(dá)趨勢，在脅迫12 h達(dá)到最大，其表達(dá)量為4.792倍；在莖中脅迫處理時間對該基因表達(dá)影響不顯著；在根中呈下調(diào)表達(dá)趨勢，且在脅迫3 h達(dá)到最大值，表達(dá)量為7.214倍，在脅迫12 h達(dá)到最低值，表達(dá)量僅為0.713倍；與莖根相比，該基因在葉中表達(dá)最顯著(表3)。

表3 高溫脅迫下小黑楊PsnNAC030基因的相對表達(dá)量

經(jīng)4 ℃低溫處理后PsnNAC030基因在葉、莖、根中均呈上調(diào)表達(dá)趨勢；該基因主要在莖中表達(dá)，且在脅迫12 h時達(dá)到最大，高達(dá)245.687倍；其次是在根中表達(dá)，在脅迫6 h達(dá)到最大，表達(dá)量為84.276倍，最后是在葉中表達(dá)，在脅迫12 h達(dá)到最大，表達(dá)量為2.948倍，之后其表達(dá)水平均有所下降(表4)。

表4 低溫脅迫下小黑楊PsnNAC030基因的相對表達(dá)量

經(jīng)50 μmol/L ABA溶液處理后PsnNAC030基因在葉和莖中呈上調(diào)表達(dá)趨勢，均在處理6 h時出現(xiàn)最大值，表達(dá)量分別為5.822、1.846倍；在根中呈先下調(diào)后上調(diào)趨勢，在處理3 h時出現(xiàn)最大值，表達(dá)量為6.424倍；與該基因在莖和根中的表達(dá)量相比，在葉片中的誘導(dǎo)表達(dá)較為顯著(表5)。

表5 ABA脅迫下小黑楊PsnNAC030基因的相對表達(dá)量

以上結(jié)果表明PsnNAC030基因?qū)Ω啕}、干旱、高溫(37 ℃)、低溫(4 ℃)、ABA脅迫具有顯著的應(yīng)答反應(yīng)；該基因相對的表達(dá)水平具有組織特異性，表現(xiàn)為150 mmol/L NaCl、高溫(37 ℃)、50 μmol/L ABA脅迫下在葉中表達(dá)量最高，干旱、低溫(4 ℃)脅迫下在莖中表達(dá)量最高。

3 結(jié)論與討論

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子基因家族之一，廣泛存在于各種各樣的陸生植物中，包括NAM、ATAF和CUC 3個亞家族[34]。該家族基因含有高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、核定位信號位點(diǎn)和高度分散的C末端結(jié)構(gòu)域[35-36]。小黑楊PsnNAC030基因編碼區(qū)876 bp，屬于NAC轉(zhuǎn)錄因子基因家族，編碼291個氨基酸，N端具有高度保守的NAM結(jié)構(gòu)域。

迄今為止在多種植物中已克隆并鑒定出上百種NAC家族基因，其中大多數(shù)NAC基因定位于細(xì)胞核，如毛果楊PtATAF1-1基因[37]、蒙古沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)AmNAC2基因[38]、水稻OsNAC300基因等[39]。研究發(fā)現(xiàn)PsnNAC030蛋白表現(xiàn)為不穩(wěn)定的親水性蛋白，通過基因槍瞬時轉(zhuǎn)化試驗表明該蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，與大多數(shù)NAC基因定位結(jié)果一致。此外，大多數(shù)NAC基因可以編碼翻譯出具有轉(zhuǎn)錄激活活性的蛋白質(zhì)，是因為大多數(shù)NAC轉(zhuǎn)錄因子具有N端含有保守結(jié)構(gòu)域、C末端含有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域以及存在蘇氨酸、谷氨酸、絲氨酸、脯氨酸和多種酸性殘基多次重復(fù)出現(xiàn)現(xiàn)象等特征，使其在植物激活方面具有重大功能[40-41]。例如：PsnNAC030基因在擬南芥中的同源基因ATAF1[42-43]、水稻OsNAC5和SNAC1/OsNAC9基因等[44-45]。PsnNAC030基因N端具有高度保守結(jié)構(gòu)域且擁有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，同時結(jié)合亞細(xì)胞定位結(jié)果，可以說明PsnNAC030蛋白具有激活下游基因轉(zhuǎn)錄的功能，并可能參與到相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中。

植物NAC轉(zhuǎn)錄因子參與多種非生物脅迫反應(yīng)。例如：柑橘(Citrusreticulata)NAC83基因在高鹽、干旱、低溫和ABA脅迫條件下均有差異性表達(dá)[46]；海欖雌(Avicenniamarina)AmNAC1基因在鹽、干旱、低溫和水楊酸處理的反應(yīng)中存在不同的響應(yīng)，在煙草(Nicotianatabacum)中過量表達(dá)該基因提高了其對鹽、干旱的耐受性，且在酵母中異源表達(dá)該基因提高了其在鹽堿、高低溫環(huán)境中的存活率[47]；過量表達(dá)楊樹PtrNAC006、PtrNAC007和PtrNAC120基因均表現(xiàn)出抗干旱能力，且在轉(zhuǎn)基因株系的木質(zhì)部中具有較高的水勢進(jìn)而增加楊樹在干旱條件下的存活率[48]；此外，在我們之前的研究中發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)楊樹NAC13基因后，鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因株系的株高、根長和鮮重等形態(tài)指標(biāo)以及SOD、POD、脯氨酸含量等生理指標(biāo)均顯著提高，而反義表達(dá)NAC13基因后則呈現(xiàn)出相反的結(jié)果[49]。研究表明PsnNAC030基因與擬南芥中ATAF1同源性最高，ATAF1基因在擬南芥中的過表達(dá)導(dǎo)致植物對鹽、ABA、干旱等多種非生物脅迫的敏感性增強(qiáng)，對提高植物的抗逆性具有重要作用[42-50]。本研究中小黑楊PsnNAC030可被高鹽、干旱、高低溫和ABA脅迫顯著誘導(dǎo)表達(dá)，且呈現(xiàn)出誘導(dǎo)初期表達(dá)驟升、隨后下降或相對穩(wěn)定的趨勢，表明該基因可能參與對環(huán)境驟變瞬間響應(yīng)或長期適應(yīng)的過程。

綜上所述，可以推斷出PsnNAC030基因可能在植物應(yīng)對多種非生物脅迫時具有重要的潛在功能，也為研究該基因的抗性機(jī)制與功能提供了理論依據(jù)。此外，研究過表達(dá)該基因的轉(zhuǎn)基因植物，將對PsnNAC030基因是否在多重非生物脅迫耐受中具有調(diào)控作用以及怎樣調(diào)控有更加深入的認(rèn)識，同時也為培育出能夠在逆境(鹽堿地、荒漠等)環(huán)境下生存的優(yōu)良樹種做出貢獻(xiàn)。