茶樹油對(duì)LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺炎的作用及其機(jī)制

陳志，張逸，路欽越，郭佳禾，梁艷，張明怡星，楊章平

茶樹油對(duì)LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺炎的作用及其機(jī)制

陳志，張逸，路欽越，郭佳禾，梁艷，張明怡星，楊章平

揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009

【】奶牛乳腺炎一直是奶牛養(yǎng)殖業(yè)和奶制品行業(yè)最大的挑戰(zhàn)之一，制約著奶業(yè)的健康發(fā)展。有效進(jìn)行奶牛乳腺炎的防治，可以為奶牛的健康、生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)乳制品提供良好保障。探究茶樹油對(duì)LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺炎作用效果，探索茶樹油替代抗生素治療奶牛乳腺炎的可行性，為茶樹油治療奶牛乳腺炎提供參考。在牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)中分別添加50、100、200、500、1 000μg·mL-1的LPS進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。通過CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡、實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)量以及ELISA檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)量等方法檢測(cè)乳腺上皮細(xì)胞的相關(guān)指標(biāo)。研究構(gòu)建了LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺炎模型。在200μg·mL-1LPS誘導(dǎo)12h的奶牛乳腺炎細(xì)胞模型中分別添加0.0002%、0.0004%、0.0006%、0.0008%、0.001%、0.002%、0.004%、0.006%、0.008%、0.01%的茶樹油進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示100μg·mL-1的LPS攻毒情況下，細(xì)胞已開始出現(xiàn)不同程度的活性下降情況。進(jìn)一步使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示在誘導(dǎo)12h的情況下，100μg·mL-1的LPS并未出現(xiàn)大量的細(xì)胞凋亡，而200μg·mL-1的LPS誘導(dǎo)情況下約有46%左右的細(xì)胞出現(xiàn)了早期凋亡和晚期凋亡。以上結(jié)果表明：試驗(yàn)中，200μg·mL-1LPS誘導(dǎo)12h為構(gòu)建奶牛乳腺炎模型的最佳條件。添加茶樹油濃度為0.0004%、0.0006%、0.0008%時(shí)細(xì)胞的凋亡比例會(huì)有所下降，其中添加茶樹油濃度為0.0006%的這一組保護(hù)效果最為明顯，其活細(xì)胞比例71.95％，早期凋亡細(xì)胞比例22.15％，晚期凋亡細(xì)胞比例5.11％，與未添加茶樹油的乳腺炎模型組活細(xì)胞相比提高了約22%。之后對(duì)有保護(hù)效果的3組進(jìn)行qPCR檢測(cè)細(xì)胞因子與凋亡因子表達(dá)量，結(jié)果顯示隨著加入茶樹油的濃度上升，TNF-α表達(dá)量下調(diào)的較多，IL-6的表達(dá)量下調(diào)的較少（＜0．01），STAT1的表達(dá)量在加入0.0004%濃度茶樹油時(shí)有輕微的上調(diào)，在0.0006%和0.0008%濃度時(shí)表達(dá)量略微下調(diào)，其中添加0.0006%濃度茶樹油表達(dá)量最低（＜0.05）。進(jìn)一步使用ELISA法檢測(cè)炎癥蛋白和凋亡蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示3組濃度的茶樹油添加組均極顯著降低了NF-κB、MAPK和Caspase-3的表達(dá)量，其中，0.0006%濃度茶樹油組較其余濃度組的炎癥反應(yīng)蛋白的表達(dá)量最低，約為空白對(duì)照組的50%（＜0.05），而這3組的凋亡反應(yīng)相關(guān)蛋白表達(dá)量則幾乎持平，約為空白對(duì)照組的55%（＜0.05）。茶樹油對(duì)于奶牛乳腺炎有一定的拮抗作用，可以降低細(xì)胞凋亡比例，提高正常細(xì)胞的存活比例，并下調(diào)炎癥因子與凋亡因子以及相應(yīng)蛋白的表達(dá)量。

茶樹油；奶牛；LPS；乳腺炎；作用機(jī)制

0 引言

【研究意義】乳腺是合成乳汁的主要場(chǎng)所，隨著人們營養(yǎng)觀念的轉(zhuǎn)變，乳品已成為消費(fèi)需求的主流[1]。奶牛乳腺炎影響奶牛的健康，制約奶牛業(yè)的發(fā)展，近期有研究顯示，奶牛疾病抗性越強(qiáng)，如奶牛乳房炎和部分繁殖疾病，則長壽性表現(xiàn)越好[2]。因此，奶牛的健康養(yǎng)殖和抗病營養(yǎng)是提高我國奶牛養(yǎng)殖水平、改善奶品質(zhì)和增強(qiáng)市場(chǎng)競(jìng)爭力的新型支撐技術(shù)[3]。大部分奶牛乳腺炎由病原菌導(dǎo)致，可用抗生素進(jìn)行治療。但隨著耐藥性問題日益突出，如何有效防治奶牛乳腺炎，尋找新的抗菌物質(zhì)，成為當(dāng)前奶牛養(yǎng)殖業(yè)研究熱點(diǎn)。【前人研究進(jìn)展】奶牛乳腺炎是指由于各種物理、化學(xué)、病原菌等因素引起的乳房炎癥，導(dǎo)致奶牛乳腺組織發(fā)生病理學(xué)變化，進(jìn)而導(dǎo)致所分泌乳汁發(fā)生理化性質(zhì)和細(xì)菌學(xué)變化[4]。引起奶牛乳腺炎的病因很復(fù)雜，但最主要的還是由病原微生物引起，常見的病原菌有20多種[5]，其中以金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和大腸桿菌為主，如李蕊等[6]研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)型乳腺炎影響了奶牛脂肪酸的合成過程，降低了脂肪酸各組分的絕對(duì)含量；吳富鑫等[7]也對(duì)無乳鏈球菌在乳腺中的感染和傳播的過程進(jìn)行了討論。LPS是大腸桿菌等革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分之一，是導(dǎo)致乳腺炎發(fā)病的主要致病因素。國內(nèi)外研究已經(jīng)在多種動(dòng)物上成功構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的乳腺炎模型[8-9]，在大腸桿菌導(dǎo)致的奶牛乳腺炎上，LPS所引起的急性臨床指標(biāo)與乳汁中酶活性和急性期蛋白密切相關(guān)[10]。奶牛乳腺炎會(huì)導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量大幅下降，奶品質(zhì)降低，同時(shí)導(dǎo)致奶牛乳腺的傷害。防治奶牛乳腺炎意義非凡，對(duì)于奶牛乳腺炎的治療主要還是使用抗生素，但大部分牛場(chǎng)基本都是在不明確病原菌及抗生素耐藥性的情況下濫用抗生素，導(dǎo)致病原菌的耐藥及藥物殘留[11]，進(jìn)而降低了治療效果。尋找有效的抗生素替代品進(jìn)行奶牛乳腺炎的防治成為一項(xiàng)具有重要意義的研究項(xiàng)目。茶樹油（tea tree oil，TTO）是指取自于桃金娘科（Myrtaceae）白千層（Melaleuca L.）的數(shù)種植物的精油，其中最主要的一種為互葉白千層（M.alternifola），故又稱為互葉白千層油。茶樹油是許多非處方保健品和化妝品的常用成分，隨著天然藥物的蓬勃發(fā)展，越來越多的人使用含有茶樹油的產(chǎn)品[12]。茶樹油抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)，故被用于治療由真菌、細(xì)菌或病毒引起的相關(guān)疾病，如陳昕等[13]研究發(fā)現(xiàn)茶樹油提取物粉對(duì)大鼠免疫功能有較明顯的增強(qiáng)作用，其有望開發(fā)成為一種可緩解全球“抗菌藥物危機(jī)”的天然抗菌劑[14]。【本研究切入點(diǎn)】隨著抗生素濫用所導(dǎo)致的耐藥性問題，尋找新型有效抗菌物質(zhì)迫在眉睫。本研究旨在探究茶樹油對(duì)LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺炎的作用及其機(jī)制，探索茶樹油替代抗生素治療奶牛乳腺炎的可行性，為茶樹油治療奶牛乳腺炎提供參考。【擬解決的關(guān)鍵問題】構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺炎模型以及茶樹油對(duì)該乳腺炎模型的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所有的試驗(yàn)于2017年12月至2019年7月在揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院進(jìn)行。

1.1.1 細(xì)胞株 Mac-T細(xì)胞（乳腺上皮細(xì)胞）由揚(yáng)州大學(xué)教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑 茶樹油購于上海源葉公司；脂多糖（Lipopolysaccharide，055:B5）購于 Sigma公司；胎牛血清（FBS）、DMEM/F12培養(yǎng)基購于 Gibco公司；CCK-8試劑盒購于日本同仁公司；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒購于美國BD公司；實(shí)時(shí)熒光試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于南京諾唯贊公司，牛核因子κB（NF-κB）、絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）、胱天蛋白酶-3（Caspase-3）ELISA 檢測(cè)試劑盒購于上海僑社公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng) Mac-T細(xì)胞（乳腺上皮細(xì)胞）使用DMEM/F12培養(yǎng)基，完全培養(yǎng)基成分比例為90% DMEM/F12培養(yǎng)基和10%胎牛血清，37℃培養(yǎng)，CO2濃度為5%，每隔48h更換培養(yǎng)基。用 0.25%胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況。

1.2.2 LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺炎模型的構(gòu)建

1.2.2.1 CCK-8法檢測(cè)LPS誘導(dǎo)下的細(xì)胞增殖活性 將Mac-細(xì)胞的密度調(diào)整為1×104個(gè)/mL接種96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，分別加入含LPS50、100、200、500、1 000 μg·mL-1的培養(yǎng)基（不含血清），同時(shí)設(shè)立不加LPS的對(duì)照組和無細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，分別培養(yǎng)4、8、12和24h后，根據(jù)CCK-8試劑盒操作步驟檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。

1.2.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LPS誘導(dǎo)下的細(xì)胞凋亡率 將Mac-細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，選擇在細(xì)胞增殖試驗(yàn)中適宜的LPS濃度和培養(yǎng)時(shí)長進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)立不加LPS的空白對(duì)照組，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，用PBS清洗并收集細(xì)胞，用Buffer調(diào)整細(xì)胞濃度1×106/100 μL/test；加5 μL Annexin V-FITC 和5μL PI，室溫避光20 min；加400 μL Buffer上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。最終依據(jù)細(xì)胞增殖活性試驗(yàn)和凋亡試驗(yàn)確定構(gòu)建奶牛乳腺炎模型的最適LPS濃度和作用時(shí)間。

1.2.3 茶樹油對(duì)LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺炎模型的影響

1.2.3.1 茶樹油的溶解與配置 茶樹油由于其易溶于有機(jī)溶劑，難溶于水的性質(zhì)，在培養(yǎng)基中溶解茶樹油需要添加一定的增溶劑。研究發(fā)現(xiàn)，選取體積分?jǐn)?shù)為1%的DMSO對(duì)細(xì)胞形態(tài)無明顯影響，且對(duì)于茶樹油的溶解具有良好的效果[15]。本實(shí)驗(yàn)將茶樹油溶于DMEM培養(yǎng)基時(shí)，加入1%濃度的DMSO作為增溶劑，配置出0.1%的茶樹油溶液的母液，使用時(shí)稀釋為不同濃度進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)茶樹油對(duì)乳腺炎模型的凋亡率的影響 試驗(yàn)開始之前，將茶樹油溶液的母液稀釋成0.0002%—0.01%。試驗(yàn)開始后將Mac-T細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，加入最適濃度的LPS與不同濃度茶樹油溶液進(jìn)行混合培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置設(shè)立不加茶樹油只加LPS的對(duì)照組和不加茶樹油和LPS只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照組。培養(yǎng)最適時(shí)間后，加入Annexin V-FITC 和PI之后上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，初步確定具有保護(hù)作用的適宜茶樹油濃度范圍。

1.2.3.3 qPCR檢測(cè)茶樹油對(duì)乳腺炎模型炎癥因子與凋亡因子表達(dá)量的影響 收集適宜濃度范圍內(nèi)的茶樹油與LPS混合培養(yǎng)最適時(shí)間的細(xì)胞，用 TRIZOL法[16]提取總 RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用實(shí)時(shí)熒光試劑盒進(jìn)行基因的qPCR檢測(cè)。各基因表達(dá)比較采用β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCt法分析PCR數(shù)據(jù)。引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 基因的qPCR引物序列

1.2.3.4 ELISA法檢測(cè)茶樹油對(duì)乳腺炎模型炎癥蛋白和凋亡蛋白表達(dá)量的影響 收集適宜濃度范圍內(nèi)的茶樹油與LPS混合培養(yǎng)最適時(shí)間的細(xì)胞，PBS清洗后，加入RIPA裂解液進(jìn)行裂解，根據(jù)ELISA 檢測(cè)試劑盒操作步驟進(jìn)行炎癥相關(guān)的牛核因子κB（NF-κB）、絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）和凋亡相關(guān)的胱天蛋白酶-3（Caspase-3）的檢測(cè)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用 Excel軟件整理數(shù)據(jù)，應(yīng)用 Graph Pad Prism 5.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（one－way ANOVA 或 two－tailed Studen’s t test），其中＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測(cè)LPS誘導(dǎo)下細(xì)胞增殖活性

由表1可知，在100 μg·mL-1的LPS攻毒情況下，細(xì)胞已開始出現(xiàn)不同程度的活性下降情況，由于500和1 000 μg·mL-1LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞活性太低，所以選擇100或200 μg·mL-1LPS培養(yǎng)12 h作為下一步凋亡試驗(yàn)的對(duì)象。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)LPS誘導(dǎo)下細(xì)胞凋亡

使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)1% DMSO 和0.01% TTO 對(duì)細(xì)胞的作用，圖1顯示與對(duì)照組相比較，1%的DMSO和0.01%的TTO 對(duì)細(xì)胞并沒有傷害。另一方面，由圖2可知，A組在沒有添加LPS攻毒作用下，僅出現(xiàn)了5%左右早期凋亡和晚期凋亡，B組在添加了100 μg·mL-1LPS攻毒作用下，整體圖像發(fā)生右移，出現(xiàn)了約8%的早期凋亡和晚期凋亡，但是凋亡效果還不是特別明顯，C組在添加了200μg·mL-1LPS，整體圖像已出現(xiàn)明顯分群，約有50%左右的細(xì)胞出現(xiàn)了早期凋亡和晚期凋亡，適宜作為后續(xù)試驗(yàn)的乳腺炎模型。

表2 不同濃度LPS誘導(dǎo)細(xì)胞增殖活性

A：空白組；B：1% DMSO組；C：0.01% TTO組 A: Blank group; B: DMSO group; C: 0.01% TTO group

圖2 LPS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡結(jié)果

2.3 茶樹油對(duì)乳腺炎模型的凋亡率的影響

由圖3可知，A組空白對(duì)照表示沒有經(jīng)過任何處理的正常生長的乳腺上皮細(xì)胞凋亡的情況，活細(xì)胞比例為92.88%，早期凋亡細(xì)胞比例3.32%，晚期凋亡比例3.37%。B組經(jīng)過200μg·mL-1LPS處理的乳腺上皮細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，活細(xì)胞比例為50.66％，早期凋亡細(xì)胞比例45.70%，晚期凋亡比例3.42%。C組至L組分別添加不同濃度的TTO后，D、E和F組取得保護(hù)效果，其中E組保護(hù)效果最為明顯，其活細(xì)胞比例71.95%，早期凋亡細(xì)胞比例22.15%，晚期凋亡比例5.11%，與B組活細(xì)胞相比提高了約22%。

2.4 茶樹油對(duì)乳腺炎模型炎癥因子和凋亡因子的影響

TNF-α和IL-6是與炎癥反應(yīng)有關(guān)的炎癥因子，STAT1與凋亡反應(yīng)相關(guān)的凋亡因子。由圖4可知，在加入200 μg·mL-1LPS后，與空白組相比，TNF-α和IL-6都達(dá)到了15倍以上的表達(dá)量，STAT1的表達(dá)量也達(dá)到了將近6倍：在分別加入0.0004%、0.0006%和0.0008% TTO后，與LPS組相比，隨著加入的TTO濃度的上升，TNF-α和IL-6基本呈現(xiàn)一個(gè)表達(dá)量下降的趨勢(shì)，其中TNF-α表達(dá)量的下降幅度更加大，IL-6的表達(dá)量則表現(xiàn)為差異極顯著，STAT1的表達(dá)量在加入0.0004%TTO濃度時(shí)有輕微的上調(diào)，在0.0006%和0.0008%TTO濃度時(shí)表達(dá)量均低于LPS組，其中0.0006%TTO濃度時(shí)表達(dá)量最低。

2.5 茶樹油對(duì)乳腺炎模型炎癥蛋白和凋亡蛋白表達(dá)量的影響

NF-κB與MAPK均是與炎癥相關(guān)的蛋白，Caspase-3是與凋亡反應(yīng)相關(guān)的蛋白。試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，在加入200μg·mL-1LPS后，與空白組相比，LPS組極顯著提高了NF-κB、MAPK和Caspase-3的表達(dá)量；在加入有效濃度TTO后，與LPS組相比，3組TTO試驗(yàn)組均極顯著降低了NF-κB、MAPK和Caspase-3的表達(dá)量。

3 討論

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌（G-）細(xì)胞外膜上一種大分子結(jié)構(gòu)成分，細(xì)菌死亡溶解或用人工方法破壞細(xì)菌細(xì)胞后才釋放出來。其毒性成分主要為類脂質(zhì)A，能夠引起哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致促炎因子的釋放[17]，王林楓等[18]證實(shí)LPS可顯著影響奶山羊肝臟的營養(yǎng)代謝。用LPS誘導(dǎo)奶牛乳腺炎模型可以很好的復(fù)制奶牛乳腺炎發(fā)病的整個(gè)過程[19]。本試驗(yàn)在構(gòu)建乳腺炎模型時(shí)，在50μg·mL-1LPS刺激下，細(xì)胞的增殖活性有了一定的增強(qiáng)，在100 μg·mL-1以上時(shí)則表現(xiàn)為活性減弱。這個(gè)結(jié)果與前人研究相一致，表明LPS具有雙重作用，低濃度LPS的刺激可以提高機(jī)體免疫系統(tǒng)的活性，增強(qiáng)原有細(xì)胞的增殖活性[20]，而高濃度的LPS則會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而致使細(xì)胞凋亡[21]。

圖3 不同濃度TTO對(duì)乳腺炎模型凋亡率的影響

與空白對(duì)照組比較，#表示差異顯著( P＜0.05) ，##表示差異顯著( P＜0.05); 與 LPS 組比較，*表示差異顯著( P＜0.05)，** 表示差異極顯著( P＜0.01)。下同

茶樹油對(duì)于大腸桿菌細(xì)菌及其內(nèi)毒素具有良好的抑制作用，GUSTAFSON等[22]研究發(fā)現(xiàn)茶樹油對(duì)大腸桿菌指數(shù)期和穩(wěn)定期細(xì)胞的自溶有促進(jìn)作用。王懿等[23]在小鼠上證明茶樹油對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥具有顯著抑制效果。據(jù)此猜測(cè)，茶樹油在奶牛乳腺炎中也會(huì)起到積極的作用。本試驗(yàn)中，通過流式細(xì)胞儀結(jié)果圖可直觀發(fā)現(xiàn)加入適宜濃度的茶樹油后，受到LPS侵染后正常存活細(xì)胞的比例明顯上升，早期凋亡和晚期凋亡以及死細(xì)胞的比例下降。細(xì)胞對(duì)感染作出的免疫反應(yīng)主要表現(xiàn)為細(xì)胞因子大量釋放[24]，LPS誘發(fā)乳腺急性炎癥時(shí)，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生TNF-α和IL-6等促炎細(xì)胞因子[25]，也會(huì)產(chǎn)生STAT1等促凋亡因子[26]。TNF-α是感染初期的主要細(xì)胞因子，與大腸桿菌型乳腺炎內(nèi)毒素休克有著密不可分的關(guān)系[27]，并且對(duì)中性粒細(xì)胞具有趨化作用。IL-6是一個(gè)多效性的細(xì)胞因子，能夠介導(dǎo)許多免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)[28]。本試驗(yàn)表明，加入適宜濃度茶樹油可以明顯抑制LPS誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá)，其中對(duì)TNF-α的抑制效果更好。STAT1能夠促凋亡、抑制細(xì)胞生長、分化，在抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[29]?？梢园l(fā)現(xiàn)，適宜濃度茶樹油能夠一定程度抑制STAT1的表達(dá)。

前人研究發(fā)現(xiàn)，炎性細(xì)胞因子主要是通過NF- κB[30]與MAPK[31]信號(hào)通路活化產(chǎn)生，而促凋亡因子主要通過Caspase-3[32]通路活化產(chǎn)生。為了進(jìn)一步探究茶樹油素抑制炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生與促凋亡因子產(chǎn)生的機(jī)制，本試驗(yàn)檢測(cè)了茶樹油對(duì)NF-κB、MAPK和Caspase-3這3個(gè)蛋白表達(dá)量的情況。根據(jù)雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）發(fā)現(xiàn)，受到LPS侵染的乳腺上皮細(xì)胞的NF-κB、MAPK和Caspase-3表達(dá)量較高，在添加適宜濃度的茶樹油后，NF-κB、MAPK和Caspase-3的表達(dá)量均顯著下降。以上結(jié)果可以表明，適宜濃度茶樹油可以在炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)抑制NF-κB、MAPK和Caspase-3的產(chǎn)生，阻止、和過量表達(dá)，從而對(duì)LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺炎起到保護(hù)作用。故此推測(cè)茶樹油在機(jī)體內(nèi)可以抑制NF-κB、MAPK和Caspase-3信號(hào)通路的活化，從而對(duì)奶牛乳腺炎起到保護(hù)作用。

4 結(jié)論

茶樹油能夠在LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺炎模型中抑制炎癥因子、凋亡因子以及相應(yīng)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡率，對(duì)LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺炎的具有一定的作用。本試驗(yàn)中0.0004%—0.0008%茶樹油效果最佳。

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Effect and Mechanism of Tea Tree Oil on LPS Induced Mastitis in Dairy Cows

CHEN Zhi, ZHANG Yi, LU QinYue, GUO JiaHe, LIANG Yan, ZHANG MingYiXing, YANG ZhangPing

College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu

【】Cow mastitis has been one of the biggest challenges in dairy farming and dairy products industry, which restricts the healthy development of dairy industry. Effective prevention and treatment of cow mastitis can provide a good guarantee for the health of cows and the production of high-quality dairy products. This experiment explored the effects of tea tree oil on LPS-induced mastitis in dairy cows, and explored the feasibility of using tea tree oil instead of antibiotics to treat mastitis in dairy cows. This experiment provides a reference for the treatment of dairy cow mastitis with tea tree oil. 【】The cells in good condition, were selected, which were added 50, 100, 200, 500, and 1 000 μg·mL-1LPS respectively in the culture of these cells to detect the relevant indicators. The tea tree oil and LPS were added to the model for co-culture. The model of dairy cow mastitis induced LPS was established by the CCK-8 method, flow cytometry, real-time fluorescence quantification and ELISA assay. Antagonistic effect of tea tree oil on LPS in dairy cow mastitis cell model: 0.0002%, 0.0004%, 0.0006%, 0.0008%, 0.001%, 0.002%, 0.004%, 0.006%, 0.008% and 0.01% tea tree oil were added to the dairy cow mastitis cell model induced by 200 μg·mL-1LPS for 12 hours to detect the related indexes. 【】CCK-8 method was used to detect the cell proliferation activity. The results showed that under the condition of 100 μg·mL-1LPS poisoning, the activity of the cells began to decline in varying degrees. There was not a large number of apoptosis in 100 μg·mL-1LPS after 12 hours of induction, while about 46% of the cells showed early and late apoptosis in 200 μg·mL-1LPS. 200 μg·mL-1LPS induced for 12 hours was the best condition for the establishment of mastitis model. The results also showed that when tea tree oil concentration was 0.0004%, 0.0006% and 0.0008%, the apoptosis rate of the cells decreased. Among them, when tea tree oil concentration was 0.0006%, the protection effect was the most obvious. The proportion of living cells was 71.95%, the proportion of early apoptotic cells was 22.15%, and the proportion of late apoptotic cells was 5.11%; compared with the living cells, the proportion of the mastitis model group of tree oil increased by about 22%. After that, the expression of cytokines and apoptotic factors were detected by qPCR in the three groups with protective effect. With the increase of the concentration of tea tree oil, the expression of TNF-α was down regulated more, the expression of IL-6 was down regulated less (< 0.01), and the expression of STAT1 was up regulated slightly when 0.0004% tea tree oil was added, while down regulated slightly when 0.0006% and 0.0008% tea tree oil were added, and the expression of tea tree oil with 0.0006% concentration was the lowest (< 0.05). The expression of NF-κB, MAPK and caspase-3 was significantly reduced in the three groups of tea tree oil adding concentration. Among them, the expression of inflammatory response protein in 0.0006% tea tree oil group was the lowest, about 50% of that in the blank control group. The protein expression was almost the same, about 55% of the blank control group (< 0.05).【】Tea tree oil had a certain antagonistic effect on LPS within the appropriate concentration range, which could reduce the proportion of apoptosis, improve the survival proportion of normal cells, and down regulate the expression of inflammatory factors, apoptosis factors and corresponding proteins.

tea tree oil; cow; LPS; mastitis; effect mechanism

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.017

2019-11-04；

2021-04-26

國家自然科學(xué)基金(31872324，31802035)、江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新基金(CX(17)1005)、江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（奶牛）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(JATS [2018]300)

陳志，E-mail：zhichen@yzu.edu.cn。通信作者楊章平，E-mail：yzp@yzu.edu.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）