新疆馬鈴薯甲蟲對(duì)噻蟲嗪的抗性監(jiān)測(cè)及其細(xì)胞色素P450基因表達(dá)分析

石鑫，李莎，王志敏，付開赟，付文君，姜衛(wèi)華

新疆馬鈴薯甲蟲對(duì)噻蟲嗪的抗性監(jiān)測(cè)及其細(xì)胞色素P450基因表達(dá)分析

石鑫1，李莎1，王志敏1，付開赟2，付文君3，姜衛(wèi)華1

1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095；2新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091；3新疆伊犁州農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，新疆伊寧 835000

【】以世界性害蟲馬鈴薯甲蟲（）為研究對(duì)象，篩選其參與噻蟲嗪解毒的細(xì)胞色素P450主效基因。于2018、2019年利用點(diǎn)滴法監(jiān)測(cè)新疆察布查爾縣、伊寧縣、塔城市、烏魯木齊市和吉木薩爾縣11個(gè)馬鈴薯甲蟲田間種群對(duì)噻蟲嗪的抗性水平，并測(cè)定分析噻蟲嗪LD50處理72h后成蟲中3種主要解毒酶細(xì)胞色素P450酶（P450）、谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶（GST）和酯酶（EST）的活性變化。利用Illumina HiSeqTM2500高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得抗性和敏感種群之間的差異表達(dá)基因（DEG），運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)驗(yàn)證3個(gè)P450基因并分析6個(gè)P450基因（、、和）在不同種群及噻蟲嗪處理后的表達(dá)情況?？剐员O(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，2018年的YN1、URMQ1、TC和QPQL1以及2019年的YN2和JMS種群成蟲對(duì)噻蟲嗪抗性倍數(shù)（RR）分別達(dá)到5.99、8.81、10.86和20.33倍和11.82、14.05倍，為低至中水平抗性。解毒酶活性測(cè)定結(jié)果表明，2個(gè)敏感種群URMQ2、URMQ3以及2個(gè)抗性種群YN2、JMS成蟲分別經(jīng)噻蟲嗪LD50處理72 h后其P450活性均顯著增加，分別為對(duì)照的1.76、2.75、1.91和1.66倍。另外，URMQ3種群的GST（CDNB和DCNB為底物）及URMQ2、YN2種群的EST活性顯著升高，分別為對(duì)照的1.19、2.10倍和1.35、1.91倍。轉(zhuǎn)錄組分析表明，通過合并組裝分別獲得噻蟲嗪敏感和抗性種群樣品56 872 051和62 249 136個(gè)原始序列數(shù)據(jù)以及55 903 706和61 082 076個(gè)過濾后的序列數(shù)據(jù)，過濾后的序列長(zhǎng)度分別為8.39和9.16 G，堿基錯(cuò)誤率均為0.03%?？剐苑N群中差異表達(dá)的P450基因13個(gè)，其中2個(gè)基因顯著上調(diào)。3個(gè)上調(diào)的P450基因和的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致，qRT-PCR分析還發(fā)現(xiàn)和在抗性種群成蟲中表達(dá)量顯著增加，噻蟲嗪LD50處理均可引起URMQ2種群4齡幼蟲和成蟲表達(dá)量顯著上調(diào)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)成蟲對(duì)噻蟲嗪的抗性水平與表達(dá)量呈顯著正相關(guān)?？赡茉隈R鈴薯甲蟲中對(duì)噻蟲嗪具有重要的解毒作用，其他基因的作用也不能排除。

馬鈴薯甲蟲；噻蟲嗪；抗藥性；細(xì)胞色素P450；基因表達(dá)

0 引言

【研究意義】馬鈴薯甲蟲（）屬鞘翅目葉甲科，是世界公認(rèn)的馬鈴薯毀滅性檢疫害蟲。除直接取食危害寄主植物葉片外，成蟲還能傳播褐斑病、環(huán)腐病等病害，造成農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的巨大損失[1-2]。馬鈴薯甲蟲自20世紀(jì)90年代初經(jīng)哈薩克斯坦口岸傳入我國新疆，現(xiàn)已擴(kuò)散至天山以北地帶，對(duì)當(dāng)?shù)伛R鈴薯安全生產(chǎn)構(gòu)成持續(xù)的威脅[3]。作為第4大類殺蟲劑[4]，新煙堿類殺蟲劑以其作用機(jī)制獨(dú)特、高效、低毒、對(duì)環(huán)境安全成為防治馬鈴薯甲蟲的主要?dú)⑾x劑之一，其中1995年問世的吡蟲啉和1998年市場(chǎng)化的噻蟲嗪分別為第1代和第2代新煙堿類藥劑的代表品種[5]。隨著使用的頻繁，國內(nèi)外抗性調(diào)查發(fā)現(xiàn)馬鈴薯甲蟲已對(duì)吡蟲啉等產(chǎn)生了不同水平的抗性。因此，闡明相關(guān)抗藥性分子機(jī)制對(duì)于防止抗性加劇及延長(zhǎng)該類藥劑的使用壽命具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Zhao等[6]2000年報(bào)道紐約州長(zhǎng)島馬鈴薯甲蟲成蟲對(duì)吡蟲啉產(chǎn)生了100—150倍的極高水平抗性；Mota-Sanchez等[7]于2006年報(bào)道該地區(qū)種群對(duì)吡蟲啉的抗性已發(fā)展到309倍，另外美國特拉華、愛達(dá)荷、伊利諾斯等地區(qū)以及加拿大的安大略、愛德華王子島、魁北克田間種群也對(duì)吡蟲啉和噻蟲嗪產(chǎn)生不同程度的抗性。在我國，王志田等[8]調(diào)查發(fā)現(xiàn)新疆奇臺(tái)和烏魯木齊馬鈴薯甲蟲成蟲對(duì)吡蟲啉的抗性個(gè)體達(dá)到30%左右；劉萍等[9]監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)2009年新疆6個(gè)馬鈴薯甲蟲成蟲種群中有3個(gè)對(duì)啶蟲脒和噻蟲嗪產(chǎn)生低水平抗性，2010年監(jiān)測(cè)的6個(gè)種群均對(duì)噻蟲嗪產(chǎn)生了抗性，其中低抗和中抗種群各3個(gè)。由此可見，新疆馬鈴薯甲蟲對(duì)新煙堿類藥劑尤其是噻蟲嗪的抗性逐年發(fā)展。解毒代謝作用的增強(qiáng)是昆蟲抗藥性產(chǎn)生的重要機(jī)制之一。昆蟲體內(nèi)的解毒酶系主要包括細(xì)胞色素P450單加氧酶系（cytochrome P450 monooxygenases，P450）、谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶（glutathione-transferase，GST）和酯酶（esterase，EST），其中由P450介導(dǎo)的昆蟲抗藥性是主要的抗性機(jī)制。研究表明害蟲對(duì)新煙堿類殺蟲劑抗性的產(chǎn)生主要與P450基因過表達(dá)有關(guān)。Kaplanoglu等[10]對(duì)吡蟲啉抗性馬鈴薯甲蟲種群中顯著上調(diào)的進(jìn)行RNA干擾（RNA interference，RNAi），驗(yàn)證了該基因在抗性產(chǎn)生中的作用；Clements等[11-12]發(fā)現(xiàn)美國威斯康星州吡蟲啉抗性馬鈴薯甲蟲成蟲過表達(dá)，通過RNAi可使馬鈴薯甲蟲對(duì)吡蟲啉的抗性水平降低，作者隨后在該抗性種群中又發(fā)現(xiàn)另一個(gè)過表達(dá)的P450基因[13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來抗性監(jiān)測(cè)已發(fā)現(xiàn)新疆馬鈴薯甲蟲對(duì)噻蟲嗪的敏感性逐年下降，抗性分布不斷擴(kuò)展且水平較高，但有關(guān)抗性分子機(jī)制尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】監(jiān)測(cè)新疆不同地區(qū)馬鈴薯甲蟲對(duì)噻蟲嗪的抗性水平，測(cè)定噻蟲嗪處理對(duì)主要解毒酶活性的影響，利用轉(zhuǎn)錄組分析抗性和敏感種群的差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG），定量分析不同田間種群以及噻蟲嗪處理后的6個(gè)P450基因的表達(dá)水平，篩查與噻蟲嗪抗性相關(guān)的P450基因，為闡明馬鈴薯甲蟲對(duì)噻蟲嗪的代謝抗性分子機(jī)制打下基礎(chǔ)，同時(shí)為馬鈴薯甲蟲的抗性治理提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018—2019年在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所安寧渠試驗(yàn)基地和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲生理生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 供試?yán)ハx

馬鈴薯甲蟲分別于2018年和2019年6—7月采自新疆察布查爾縣（Qapqal，QPQL）、伊寧縣（Yining，YN）、塔城市（Tacheng，TC）、烏魯木齊市（Urumqi，URMQ）和吉木薩爾縣（Jimusar，JMS）的田間馬鈴薯苗上，種群具體采集信息見表1。室內(nèi)用馬鈴薯苗飼養(yǎng)，養(yǎng)蟲室條件為（26±1）℃，相對(duì)濕度50%—60%，光周期為光/暗=16 h/8 h。選取大小一致、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的4齡幼蟲和成蟲作為試蟲。2018年抗性測(cè)定參照的敏感種群QPQL-S于2015年6月采自察布查爾縣扎庫齊牛錄鄉(xiāng)，不接觸藥劑下飼養(yǎng)3年。

表1 馬鈴薯甲蟲種群采集信息

1.2 供試藥劑

97%吡蟲啉原藥（江蘇紅太陽有限公司）；95%噻蟲嗪原藥（鹽城雙寧農(nóng)化有限公司）。

1.3 毒力測(cè)定

采用微量點(diǎn)滴法。使用丙酮溶解原藥并稀釋制備1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.007813 mg·mL-1系列梯度濃度的藥液。采用Hamilton微量進(jìn)樣器進(jìn)行藥劑點(diǎn)滴，藥劑點(diǎn)滴部位：成蟲腹部腹面第二節(jié)，4齡幼蟲腹部背面的第3、4節(jié)；點(diǎn)滴量：4齡幼蟲0.22 μL/頭，成蟲1.1 μL/頭。點(diǎn)滴同體積的丙酮作為對(duì)照。每個(gè)處理試蟲10頭，共3個(gè)重復(fù)。處理后置于塑料培養(yǎng)皿（直徑9 cm），在室內(nèi)用新鮮馬鈴薯葉飼養(yǎng)，72 h后檢查死亡蟲數(shù)。馬鈴薯甲蟲死亡標(biāo)準(zhǔn)參考劉萍等[9]和盧偉平等[14]。

1.4 解毒酶活性測(cè)定

1.4.1 酶液制備 收集URMQ2、URMQ3、YN2和JMS種群成蟲分別經(jīng)噻蟲嗪LD50點(diǎn)滴法處理72 h后的存活個(gè)體，對(duì)照為丙酮處理，將試蟲單頭放于勻漿器內(nèi)，加入1.2 mL 0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.6，其中含1 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1DTT，1 mmol·L-1PTU，1 mmol·L-1PMSF）勻漿用于細(xì)胞色素P450單加氧酶活性測(cè)定；加入1.2 mL 0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.6）勻漿用于谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定；加入1.2 mL 0.02 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.0）勻漿用于酯酶活性測(cè)定。勻漿液于4℃，13 000×下離心15 min后，將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管，重復(fù)離心一次后，取上清液作為酶源。每個(gè)處理6個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3個(gè)技術(shù)性重復(fù)。

1.4.2 P450活性測(cè)定 在96孔酶標(biāo)板中加入100 μL 2 mmol·L-1對(duì)硝基苯甲酚（PNA）和90 μL酶液，混合液在30℃溫育3 min，然后加入10 μL 9.6 mmol·L-1NADPH啟動(dòng)反應(yīng)。利用SPECTRA max?340-PC型酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）在波長(zhǎng)405 nm下記錄15 min內(nèi)的吸光值變化，酶促反應(yīng)溫度為30℃。

1.4.3 GST活性測(cè)定 在96孔酶標(biāo)板中分別加入10 μL稀釋10倍的酶液（CDNB為底物）或25 μL酶液（DCNB為底物）、1.2 mmol·L-1CDNB或DCNB 100 μL，以及6 mmol·L-1谷胱甘肽（GSH）100 μL。在波長(zhǎng)340 nm下記錄10 min內(nèi)的吸光值變化，酶促反應(yīng)溫度為27℃。

1.4.4 EST活性測(cè)定 在96孔酶標(biāo)板中分別加入20 μL稀釋10倍的酶液，0.2 mol·L-1PBS（pH 6.0）與固藍(lán)RR鹽和-乙酸萘酯（-NA）的乙醇溶液（100 mmol·L-1）以1﹕2﹕0.01比例的混合液205 μL，在波長(zhǎng)450 nm下記錄10 min內(nèi)的吸光值變化，酶促反應(yīng)溫度為27℃。

1.4.5 蛋白含量測(cè)定 采用Bradford考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定粗酶液的蛋白質(zhì)含量，以BSA做標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。

1.5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

URMQ3和JMS種群成蟲用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，每個(gè)種群設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3頭試蟲。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)組裝及分析：RNA的提取、cDNA文庫的建立及測(cè)序工作由北京諾禾致源科技股份有限公司完成，采用Illumina HiSeqTM2500系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序。使用HISAT2v2.0.5構(gòu)建參考基因組的索引，并使用HISAT2 v2.0.5將配對(duì)末端clean reads與參照基因組比對(duì)，采用StringTie軟件新轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行組裝[16]。

轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因的篩選：首先對(duì)原始的readcount進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（normalization），主要是對(duì)測(cè)序深度的校正。然后通過統(tǒng)計(jì)學(xué)模型進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)概率（-value）的計(jì)算，最后進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正（BH），得到FDR值（錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率）。以＜0.05、|log2fold change(Fc)|≥1作為篩選標(biāo)準(zhǔn)[17]，|log2Fc|越大，則基因表達(dá)差異越明顯。篩選出解毒代謝酶、表皮蛋白、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、煙堿型乙酰膽堿受體等與抗性相關(guān)的差異表達(dá)基因。

1.6 馬鈴薯甲蟲種群P450基因表達(dá)量分析

1.6.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 將馬鈴薯甲蟲4齡幼蟲和成蟲單頭分別按照Trizol試劑說明進(jìn)行總RNA提取，于-80℃冰箱貯存?zhèn)溆?，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（日本TaKaRa公司）反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。

1.6.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)GenBank上馬鈴薯甲蟲的序列（NCBI登錄號(hào)分別為XP_023027514、XP_023018115、XP_023018114、XP_023021616、XP_ 023023178、XP_023015477），利用Beacon Designer 7.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，委托南京金斯瑞公司合成，以和作為內(nèi)參基因[18]，引物序列見表2。采用ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（美國Applied Biosystems公司），以SYBR Green為染料，用稀釋5倍的cDNA作為模板，測(cè)定P450基因的相對(duì)表達(dá)水平。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqTM（2×）10 μL，cDNA模板1.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye2（50×）0.4 μL，用無核酶水補(bǔ)足至20 μL。PCR程序采用兩步法：95℃30 s；95℃5 s；60℃34 s，共40個(gè)循環(huán)，然后95℃15 s；60℃60 s；95℃15 s用于記錄熔解曲線。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

死亡率和校正死亡率的計(jì)算使用Abbott公式，采用機(jī)率值分析法計(jì)算毒力回歸曲線、LD50、相關(guān)系數(shù)及95%置信限，抗性倍數(shù)（RR）=田間測(cè)試種群的LD50/（相對(duì)）敏感種群的LD50?？顾幮运絽⒄找韵聵?biāo)準(zhǔn)：敏感（RR＜3.0）、敏感性降低（RR 3.1—5.0）、低水平抗性（RR 5.1—10.0）、中水平抗性（RR 10.1—40.0）、高水平抗性（RR 40.1—160.0）和極高水平抗性（RR＞160.0）[19]。利用2-ΔΔCt方法[20]計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，數(shù)據(jù)用Excel 2003進(jìn)行分析。利用SPSS 18.0軟件（One-way ANOVA）進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析（Tukey檢驗(yàn)，＜0.05），以及對(duì)抗性水平和基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析。

表2 馬鈴薯甲蟲實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

2 結(jié)果

2.1 新疆不同馬鈴薯甲蟲種群對(duì)噻蟲嗪的抗性

對(duì)于4齡幼蟲，2018年測(cè)試種群中，與敏感種群QPQL-S相比，YN1、TC和URMQ1種群對(duì)噻蟲嗪均表現(xiàn)敏感（RR分別為1.88、2.14和2.42倍），而QPQL1種群為敏感性降低（RR為4.23倍）；2019年測(cè)試種群中，URMQ2種群對(duì)噻蟲嗪的LD50最低（5.52 ng/頭），以此作為相對(duì)敏感種群，URMQ3、URMQ4、JMS、QPQL2、YN3種群對(duì)噻蟲嗪均保持敏感（RR＜3倍），僅YN2種群敏感性降低（RR為3.71倍）（表3）。

表3 新疆不同馬鈴薯甲蟲種群4齡幼蟲和成蟲對(duì)噻蟲嗪的敏感性

在成蟲中，與QPQL-S相比，2018年測(cè)試種群均對(duì)噻蟲嗪產(chǎn)生抗性，其中YN1和URMQ1種群為低水平抗性，而TC和QPQL1種群已達(dá)中等水平抗性，RR分別為5.99、8.81、10.86和20.33倍；2019年所有種群中，URMQ2種群對(duì)噻蟲嗪的LD50最低，為24.69 ng/頭，與之相比，URMQ3和URMQ4種群對(duì)噻蟲嗪保持敏感（RR＜3倍），QPQL2、YN3種群為敏感性降低，RR分別為3.45和4.50倍，YN2和JMS種群則達(dá)到中水平抗性，RR分別為11.82和14.05倍（表3）。

從兩年的抗性監(jiān)測(cè)結(jié)果可以看出新疆馬鈴薯甲蟲成蟲對(duì)噻蟲嗪的敏感性普遍較低，抗性達(dá)低至中等水平，而4齡幼蟲對(duì)噻蟲嗪普遍敏感。

2.2 噻蟲嗪脅迫下馬鈴薯甲蟲的解毒酶活性

噻蟲嗪可引起3種解毒酶的活性發(fā)生改變。其中P450活性在4個(gè)測(cè)試種群URMQ2、URMQ3、YN2、JMS處理組的活性均顯著提高，分別為對(duì)照的1.76、2.75、1.91和1.66倍；URMQ3種群處理組的GST活性（CDNB和DCNB為底物）活性顯著升高，分別為對(duì)照的1.19和2.10倍，而其他種群的GST活性無顯著變化；URMQ2和YN2種群處理組的EST活性顯著增加，分別為對(duì)照的1.35和1.91倍，其他種群的EST活性與對(duì)照相比差異不顯著（圖1）。

圖中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，柱上不同字母表示差異顯著（P＜0. 05）。下同

2.3 馬鈴薯甲蟲敏感和抗性種群的轉(zhuǎn)錄組分析及驗(yàn)證

2.3.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝 對(duì)噻蟲嗪敏感種群UMRQ3和抗性種群JMS成蟲進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，分別獲得56 872 051和62 249 136個(gè)原始序列數(shù)據(jù)以及55 903 706和61 082 076個(gè)過濾后的序列數(shù)據(jù)；過濾后的序列長(zhǎng)度分別為8.39和9.16 G；堿基錯(cuò)誤率均為0.03%；Phred數(shù)值＞20的堿基占總堿基的百分比（Q20）分別為97.77%和97.75%；Phred數(shù)值＞30的堿基占總堿基的百分比（Q30）分別為93.28%和93.25%；鳥嘌呤+胞嘧啶（guanine cytosine，GC）含量分別為38.95%和38.68%，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量較高（表4）。

2.3.2 抗藥性相關(guān)的差異表達(dá)基因 按照解毒機(jī)

制進(jìn)行分類，鑒定到差異表達(dá)的P450基因13個(gè)，谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶基因1個(gè)，酯酶基因7個(gè)，尿苷二磷酸-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因9個(gè)，表皮蛋白基因6個(gè)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因12個(gè)，煙堿型乙酰膽堿受體基因11個(gè)（表5）。

表4 敏感和抗性馬鈴薯甲蟲種群成蟲的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果

表5 抗性種群和相對(duì)敏感種群的差異表達(dá)基因

log2FC＞1為判斷基因上調(diào)的標(biāo)準(zhǔn)，＜0.05即為顯著。下同

Up-regulated transcripts were classified using a log2FC＞1 and significant difference at＜0.05 level. The same as below

抗性種群JMS中表達(dá)量上調(diào)的基因見表6，其中，顯著上調(diào)的P450基因有2個(gè)（111509985、111511395）、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因3個(gè)（有2個(gè)基因?yàn)樾骂A(yù)測(cè)的基因，NCBI未見相關(guān)序列，由轉(zhuǎn)錄組測(cè)序公司編號(hào)）、尿苷二磷酸-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因1個(gè)，顯著上調(diào)的基因用加粗字體表示。

2.3.3 抗性和敏感種群P450差異表達(dá)基因的驗(yàn)證 DEG測(cè)序文庫結(jié)果顯示，抗性種群JMS的和基因表達(dá)量顯著上調(diào)（＜0.05），分別為相對(duì)敏感種群的13.45和4.44倍，在抗性種群中的表達(dá)量為相對(duì)敏感種群的3.60倍，但差異不顯著。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示這3個(gè)P450基因和在JMS種群中的表達(dá)量顯著上調(diào)（＜0.05），分別為相對(duì)敏感種群URMQ3的5.03、5.32和8.01倍（圖2）。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果與DEG測(cè)序文庫顯示的結(jié)果基本一致。

2.4 新疆不同馬鈴薯甲蟲種群P450基因的表達(dá)水平

2018年4齡幼蟲中，與QPQL-S相比，和在QPQL1和YN1種群、在TC種群的表達(dá)量均顯著增加，表達(dá)量分別為QPQL-S的1.90、1.58、1.53、1.44和1.61倍（圖3-A）；2019年4齡幼蟲中，與相對(duì)敏感種群URMQ2相比，YN3種群中的表達(dá)量最高，顯著增加為URMQ2的6.74和4.15倍；JMS種群以及QPQL2的的表達(dá)量在所有種群中最高，顯著上調(diào)，表達(dá)量分別是URMQ2的5.35、21.95、3.51和3.11倍。此外，其他種群的其他基因表達(dá)量無顯著變化（圖3-B）。

表6 抗性種群中表達(dá)量上調(diào)的基因

圖2 qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證3個(gè)P450基因的表達(dá)

2018年成蟲中，、和分別在QPQL1、URMQ1種群中顯著上調(diào)，表達(dá)量分別為QPQL-S的1.53、1.50和2.22倍，而和在TC種群中的表達(dá)量均顯著降低，表達(dá)量是QPQL-S的49.45%和52.55%（圖4-A）；2019年成蟲中，與相對(duì)敏感種群URMQ2相比，YN2種群、的表達(dá)最高且顯著增加，表達(dá)量分別為URMQ2的5.56、4.03倍，的表達(dá)量在JMS中最高，顯著高于URMQ2（6.6倍），其次是QPQL2，其他4個(gè)種群的表達(dá)量較低；在YN3的表達(dá)量最高，顯著上調(diào)，表達(dá)量是URMQ2的7.49倍，其次是URMQ4和YN2種群，JMS、QPQL2和URMQ3種群的表達(dá)量較低；的表達(dá)量在各種群中無顯著變化（圖4-B）。

2.5 噻蟲嗪脅迫下馬鈴薯甲蟲P450基因的表達(dá)分析

將2019年馬鈴薯甲蟲相對(duì)敏感種群URMQ2的4齡幼蟲和成蟲經(jīng)噻蟲嗪LD50處理72 h，利用qRT-PCR測(cè)定其P450基因的表達(dá)變化，結(jié)果如圖5所示。4齡幼蟲中，以未處理同日齡的試蟲為對(duì)照，處理組的表達(dá)量顯著上升，分別為對(duì)照的5.08、4.25、2.38和2.79倍；而成蟲處理組顯著上調(diào)表達(dá)量分別為對(duì)照的1.80和1.68倍，顯著下調(diào)?？梢钥闯?，經(jīng)噻蟲嗪LD50處理均可誘導(dǎo)4齡幼蟲和成蟲表達(dá)量顯著增加，在4齡幼蟲和成蟲的表達(dá)變化則相反，而的表達(dá)量均無顯著變化。

圖3 馬鈴薯甲蟲田間種群4齡幼蟲P450基因的相對(duì)表達(dá)量（A：2018；B：2019）

圖4 馬鈴薯甲蟲田間種群成蟲P450基因的相對(duì)表達(dá)量（A：2018；B：2019）

L4：4齡幼蟲4th instar larva；A：成蟲 Adult；TMX：噻蟲嗪thiamethoxam

2.6 新疆馬鈴薯甲蟲對(duì)噻蟲嗪的抗性水平與P450基因表達(dá)量的相關(guān)性分析

利用SPSS分析2018年和2019年新疆馬鈴薯甲蟲不同種群對(duì)噻蟲嗪的抗性水平與上述P450基因表達(dá)量之間的相關(guān)性，結(jié)果如表7所示，馬鈴薯甲蟲成蟲對(duì)噻蟲嗪的抗性水平與表達(dá)量之間的相關(guān)系數(shù)（）為0.810（=0.027），二者之間為高度顯著正相關(guān)。

表7 新疆馬鈴薯甲蟲對(duì)噻蟲嗪的抗性水平與P450基因表達(dá)量的相關(guān)性分析

3 討論

馬鈴薯甲蟲對(duì)殺蟲劑容易產(chǎn)生抗性，對(duì)于一種新的殺蟲劑，往往在使用2—4年就產(chǎn)生明顯的抗藥性[2]。噻蟲嗪是新疆地區(qū)防治馬鈴薯甲蟲的主推藥劑之一，隨著使用周期的累積，其抗性發(fā)展不可避免。2009、2010年的調(diào)查發(fā)現(xiàn)新疆馬鈴薯甲蟲4齡幼蟲對(duì)噻蟲嗪普遍敏感，僅2010年特克斯（TKS）種群產(chǎn)生8.03倍的低水平抗性[14]；同時(shí)馬鈴薯甲蟲成蟲的抗性監(jiān)測(cè)顯示2009年昌吉（CJ）種群對(duì)噻蟲嗪具有5.22倍的低水平抗性，2010年CJ、QPQL、TC和URMQ1種群對(duì)噻蟲嗪發(fā)展了低到中等水平抗性（7.48、5.98、10.15和10.39倍）[9]。本研究抗性監(jiān)測(cè)表明2018年YN1、URMQ1、TC和QPQL1以及2019年YN2、JMS田間種群成蟲對(duì)噻蟲嗪產(chǎn)生了5.99—20.33倍的低至中水平抗性。其中2019年YN2種群對(duì)噻蟲嗪的抗性水平比2018年YN1種群增加了1倍。對(duì)上述采集地用藥情況的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，察布查爾、伊寧地區(qū)近3年均施用噻蟲嗪、吡蟲啉等藥劑，吉木薩爾縣近10年持續(xù)使用阿立卡（12.6%噻蟲嗪·9.4%高效氯氟氰菊酯）防治馬鈴薯甲蟲。可見長(zhǎng)期、頻繁的用藥導(dǎo)致當(dāng)?shù)胤N群對(duì)新煙堿類殺蟲劑的敏感性明顯下降。另外，還可以發(fā)現(xiàn)本文的監(jiān)測(cè)結(jié)果與劉萍等[9]、盧偉平等[14]的調(diào)查結(jié)果具有相似的趨勢(shì)，即成蟲對(duì)噻蟲嗪的敏感性較低，而幼蟲的敏感性較高，且隨著時(shí)間發(fā)展田間最高抗性水平有所上升。雖然新疆馬鈴薯甲蟲對(duì)噻蟲嗪的抗性還處于低至中等水平，但其發(fā)展不容忽視，注意合理輪換使用不同作用機(jī)制的藥劑，盡量避免在高齡期或成蟲期用藥，同時(shí)開展持續(xù)的抗性監(jiān)測(cè)及抗性機(jī)制研究是馬鈴薯甲蟲抗性治理的重要前提。

細(xì)胞色素P450單加氧酶是馬鈴薯甲蟲代謝吡蟲啉的主要酶系。Zhao等[6]研究發(fā)現(xiàn)，胡椒基丁醚在紐約州長(zhǎng)島馬鈴薯甲蟲成蟲和幼蟲中對(duì)吡蟲啉都有明顯增效作用；Mota-Sanchez等[7,21]在其他種群的增效研究也獲得同樣的結(jié)果。在本研究中，噻蟲嗪LD50處理72 h都可引起敏感和抗性馬鈴薯甲蟲4個(gè)種群的P450活性顯著升高，另外URMQ2和YN2種群的EST及URMQ3種群的GST活性也顯著增加，這表明P450可能在馬鈴薯甲蟲對(duì)噻蟲嗪的解毒代謝中起主要作用。類似的研究發(fā)現(xiàn)褐飛虱（）噻蟲嗪抗性種群的細(xì)胞色素P450活性也顯著高于室內(nèi)敏感品系（2.13倍）[22]。

近年來隨著分子生物學(xué)及生物信息學(xué)的快速發(fā)展，有關(guān)昆蟲對(duì)新煙堿類殺蟲劑抗性的解毒代謝分子機(jī)制也取得了一系列進(jìn)展[10-13]。為了篩查新疆馬鈴薯甲蟲對(duì)噻蟲嗪抗性相關(guān)的解毒酶基因，本研究就馬鈴薯甲蟲噻蟲嗪抗性和敏感成蟲進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與抗性相關(guān)的顯著差異表達(dá)的上調(diào)解毒酶基因有P450基因2個(gè)、尿苷二磷酸-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因1個(gè)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因3個(gè)，但未見有顯著差異表達(dá)的酯酶和谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶基因。Clements等[23]將吡蟲啉處理后的馬鈴薯甲蟲與對(duì)照進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，按照解毒機(jī)制進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)吡蟲啉可誘導(dǎo)4個(gè)P450基因、1個(gè)尿苷二磷酸-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因以及1個(gè)羧酸酯酶基因上調(diào)?？梢姴煌尘暗姆N群其解毒酶基因的表達(dá)量變化不同。本文利用qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中3個(gè)上調(diào)的P450基因和在抗性種群的表達(dá)量，結(jié)果與DEG數(shù)據(jù)基本一致，另外結(jié)合Zhu等[18]在美國長(zhǎng)島馬鈴薯甲蟲吡蟲啉抗性種群中發(fā)現(xiàn)的過表達(dá)基因和，本研究進(jìn)一步對(duì)上述6個(gè)P450基因在新疆馬鈴薯甲蟲不同田間種群的表達(dá)進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明，4齡幼蟲中，對(duì)噻蟲嗪敏感性降低的QPQL1種群中、的表達(dá)量顯著增加；成蟲中，對(duì)噻蟲嗪低水平抗性的URMQ1種群中高表達(dá)，和和以及分別在QPQL1、YN2以及JMS種群中顯著上調(diào)，這些種群對(duì)噻蟲嗪達(dá)到中水平抗性。綜上，可以看出和在敏感性降低的幼蟲和抗性成蟲種群中表達(dá)量均顯著提高，除以外其他5個(gè)基因在抗性成蟲中都顯著上調(diào)，表明這些基因可能參與了新疆馬鈴薯甲蟲對(duì)噻蟲嗪抗性的產(chǎn)生。

吡蟲啉對(duì)昆蟲P450基因表達(dá)具有誘導(dǎo)作用。Zhu等[18]研究顯示對(duì)吡蟲啉約30倍抗性的美國長(zhǎng)島馬鈴薯甲蟲種群中有21個(gè)P450基因可被吡蟲啉誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)；吡蟲啉處理蜜蜂可引起6個(gè)P450基因的表達(dá)量增加[24]；大草蛉（）幼蟲經(jīng)吡蟲啉誘導(dǎo)4 h其體內(nèi)P450基因表達(dá)量略微上調(diào)，16 h后轉(zhuǎn)錄水平達(dá)最高值，隨后逐漸下降[25]。本文qRT-PCR結(jié)果表明，經(jīng)噻蟲嗪LD50處理72 h，URMQ2種群4齡幼蟲和成蟲的和均顯著上調(diào)表達(dá)。ZHANG等研究發(fā)現(xiàn)褐飛虱中13個(gè)可被吡蟲啉誘導(dǎo)的P450基因在抗性種群中卻無差異表達(dá)，而和不能被吡蟲啉誘導(dǎo)，但在抗性種群中表達(dá)上調(diào)[26]，這表明可被藥劑誘導(dǎo)的基因與抗性相關(guān)的過表達(dá)基因并非完全一致。因此，綜合本研究中誘導(dǎo)試驗(yàn)及不同田間種群P450基因的表達(dá)分析結(jié)果，在噻蟲嗪抗性種群中顯著上調(diào)同時(shí)又能被噻蟲嗪誘導(dǎo)的基因即為和。另外相關(guān)性分析顯示成蟲對(duì)噻蟲嗪的抗性與表達(dá)量呈顯著正相關(guān)。而真正參與馬鈴薯甲蟲對(duì)噻蟲嗪抗性形成的基因有待進(jìn)一步的功能驗(yàn)證。

4 結(jié)論

通過抗性監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)2018年YN1、URMQ1、TC和QPQL1以及2019年YN2和JMS種群成蟲對(duì)噻蟲嗪產(chǎn)生了低至中水平抗性。噻蟲嗪處理可引起測(cè)試種群P450活性的升高，表明其在馬鈴薯甲蟲對(duì)噻蟲嗪抗性產(chǎn)生中可能起到重要作用。抗性和敏感種群的轉(zhuǎn)錄組分析以及qRT-PCR結(jié)果顯示包括和的5個(gè)P450基因在抗性種群中顯著上調(diào)，同時(shí)噻蟲嗪又可誘導(dǎo)這兩個(gè)基因在4齡幼蟲和成蟲中的表達(dá)。結(jié)合相關(guān)性分析推測(cè)與馬鈴薯甲蟲對(duì)噻蟲嗪的抗性形成密切相關(guān)，但不排除其他P450基因以及其他解毒酶基因的作用。

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Resistance monitoring to thiamethoxam and expression analysis of cytochrome P450 genes infrom Xinjiang

Shixin1, Li sha1, Wang Zhimin1, Fu Kaiyun2, Fu Wenjun3, Jiang Weihua1

1College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;2Research Institute of Plant Protection, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Intergraded Management of Harmful Crop Vermin of China North-western Oasis, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Urumqi 830091;3Agricultural Technology Extension Master Station of Yili Prefecture, Yining 835000, Xinjiang

【】Colorado potato beetle (CPB),, is a significant agricultural pest in potato worldwide. The objective of the study is to identify the main cytochrome P450genes involved in metabolic regulation of neonicotinoid insecticide thiamethoxam in.【】In this study, the resistance level to thiamethoxam was assayed using topical applications in 11 field populations offrom Qapqal (QPQL), Yining (YN), Tacheng (TC), Urumqi (URMQ), Jimusar (JMS) of Xinjiang in 2018 and 2019. The activities of three detoxifying enzymes including cytochrome P450 monooxygenase (P450), glutathione-transferase (GST) and esterase (EST), exposed to LD50of thiamethoxam for 72 h were analyzed byenzyme activity assay. Thedifferentially expressed genes (DEGs) ofadults susceptible and resistant to thiamethoxam were detected by Illumina HiSeqTM2500 sequencing platform. The expression verification of three P450 genes and the expression change of six P450 genes in different populations and the beetles exposed to LD50of thiamethoxam for 72 h were performed by real-time quantitative PCR (qRT-PCR).【】Resistance monitoring results showed that the adults of YN1, URMQ1, TC and QPQL1 populations in 2018 and YN2 and JMS in 2019 developed low to moderate level resistance to thiamethoxam with resistance ratio (RR) ranging from 5.99 to 20.33 times. The P450 activities of adults from two sensitive populations URMQ2 and URMQ3 and two resistant populations YN2 and JMS after treatment with thiamethoxam LD50for 72 h were significantly increased to 1.76, 2.75, 1.91 and 1.66 times as high as the control, respectively. In addition, the GST (CDNB and DCNB as substrates) of URMQ3 population and the EST activities of URMQ2 and YN2 populations were obviously increased to 1.19, 2.10 and 1.35, 1.91 times of the control, respectively. Based on Illumina RNA sequencing, the raw reads (56 872 051 and 62 249 136), clean reads (55 903 706 and 61 082 076), clean bases (8.39 and 9.16 G) and error of basic group (0.03%) were obtained for the thiamethoxam-susceptible and -resistant samples of adult populations, respectively. Thirteen differentially expressed P450 genes were identified in the thiamethoxam-resistant sample, of which two genes were significantly up-regulated. The expression levels of three P450 genes, namely,andby RNA sequencing were validated by qRT-PCR analysis. Furthermore,,,,andwere up-regulated in the thiamethoxam-resistant adults, and the expression of,increased significantly in the 4th instar larvae and adults under thiamethoxam treatment. It was found by correlation analysis that there was a significant positive correlation between resistance level to thiamethoxam andexpression of adults. 【】may be involved in the production of thiamethoxam resistance in, and the role of other genes cannot be ruled out.

; thiamethoxam; resistance; cytochrome P450; gene expression

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.007

2020-10-30；

2020-11-21

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD0200802）

石鑫，E-mail：907094441@qq.com。通信作者姜衛(wèi)華，E-mail：jwh@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）