基于基因編輯技術創(chuàng)制高亞油酸水稻材料

陳曉軍，吳凱伸，惠建，白海波，馬斯霜，李靖宇

基于基因編輯技術創(chuàng)制高亞油酸水稻材料

陳曉軍1，吳凱伸2，惠建1，白海波1，馬斯霜1，李靖宇2

1寧夏農(nóng)林科學院農(nóng)業(yè)生物技術研究中心/寧夏農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室，銀川 750002；2北方民族大學生物科學與工程學院，銀川 750021

【】亞油酸是一種人體必需的脂肪酸，能加快體內(nèi)脂肪代謝與分解、減少膽固醇在血管壁上形成積存、有效預防動脈硬化的發(fā)生、提高人體免疫力、促進骨骼發(fā)育、提高記憶力、預防腦部功能退化等功能。利用基因編輯技術對控制脂肪酸合成途徑的關鍵酶ω-3脂肪酸去飽和酶基因進行精準編輯，關閉下游產(chǎn)物的合成途徑，以便提高水稻上游亞油酸的含量，為創(chuàng)制富集亞油酸水稻材料提供依據(jù)。水稻脂肪酸合成途徑中的關鍵酶ω-3脂肪酸去飽和酶基因（）存在2個拷貝，分別分布在第11和第12染色體，且兩者cDNA同源性達97.32%。根據(jù)基因編輯原理（編輯的特異性取決于引導RNA（gRNA）的特性），在2個同源基因序列高度一致的外顯子區(qū)域，分別設計合成2個gRNA，并分別構建植物基因編輯載體，利用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化本地受體材料（富源4號）。通過對基因編輯植株進行靶位點測序鑒定，分析2個位點的編輯效率和基因型。同時，對雙突變體進行粒寬、粒長等主要籽粒農(nóng)藝性狀分析。采用氣質(zhì)聯(lián)用檢測法測量雙突變體籽粒的37種脂肪酸含量。獲得2個位點的純合編輯材料，同時也獲得了其他不同基因型組合的編輯材料；與對照材料相比，雙突變體的粒寬、粒長等主要籽粒農(nóng)藝性狀均沒有發(fā)生顯著變化，但稻谷中亞油酸的相對含量提高了3.36個百分點。在不改變籽粒主要農(nóng)藝性狀的前提下，實現(xiàn)了利用基因編輯技術通過轉(zhuǎn)化一個載體同時精準敲除2個ω-3脂肪酸去飽和酶基因，提高了籽粒中亞油酸的相對含量。

水稻；基因編輯；高亞油酸;米糠油

0 引言

【研究意義】亞油酸（十八碳二烯酸）是一種人體必需的脂肪酸，具有保護心腦血管的功效，通過加快體內(nèi)脂肪代謝與分解，減少膽固醇在血管壁上形成積存，有效預防動脈硬化的發(fā)生。亞油酸還具有提高人體免疫力、促進骨骼發(fā)育、提高記憶力、預防腦部功能退化[1-2]等功能。米糠是稻谷加工過程中的副產(chǎn)品，可使用壓榨法或浸出法從中制取米糠油，米糠油是一種營養(yǎng)價值很高的食用油品種。中國米糠油原料資源豐富，但米糠油的生產(chǎn)和消費還處在起步階段。據(jù)統(tǒng)計，中國水稻總產(chǎn)量約2億t，米糠產(chǎn)量占7%，米糠出油率約15%，按此粗算，如完全利用，可產(chǎn)200萬t米糠油，約等于中國第二大油料作物——花生的產(chǎn)油量，相當于1 200萬t大豆的含油量，因此，提高水稻中米糠油的含量，可有效緩解食用油供求失衡的壓力[3]?！厩叭搜芯窟M展】米糠油中亞油酸和油酸含量分別為38%和42%。水稻中亞油酸轉(zhuǎn)化亞麻酸主要由ω-3脂肪酸去飽和酶（FAD3.1和FAD3.2）催化合成（圖1）[4]。Abe等[4]利用基因編輯技術敲除了水稻控制油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸的關鍵酶基因——，結果表明，油酸含量較野生型增加2倍。隨著基因編輯技術的迅速興起，各種Cas9突變體[5-6]、基因定點突變[7-10]、單堿基替換[11-14]等基因編輯手段和方法對植物合成途徑的精準控制成為可能?！颈狙芯壳腥朦c】基于前人研究，米糠油中高油酸含量已經(jīng)實現(xiàn)，但有關高亞油酸米糠油的研究鮮見報道。水稻中亞油酸到亞麻酸的合成由2個冗余基因控制。因此，同時敲除這兩個基因，成為改良水稻含油量的難點?！緮M解決的關鍵問題】本研究基于CRISPR-Cas9編輯技術原理，構建、轉(zhuǎn)化一個植物基因編輯載體同時敲除ω-3脂肪酸去飽和酶的2個基因（和），阻斷亞油酸轉(zhuǎn)化亞麻酸的途徑，為創(chuàng)制富集亞油酸水稻材料提供依據(jù)。

圖1 水稻中脂肪酸合成路徑[4]

1 材料與方法

1.1 材料

水稻轉(zhuǎn)化受體材料富源4號由寧夏農(nóng)林科學院農(nóng)作物研究所提供?；蚓庉嬢d體AarI-Cas9- PC1300由中國水稻研究所王克劍研究員惠贈。試驗于2019年完成載體構建、基因轉(zhuǎn)化，2020年完成籽粒農(nóng)藝性狀調(diào)查，均在寧夏農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室完成；2020年盆栽試驗在寧永王太堡網(wǎng)室中進行。

1.2 靶位點設計

ω-3脂肪酸去飽和酶基因（LOC_ Os11g01340）和（LOC_Os12g01370）均由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成，分別分布在水稻第11和第12染色體（圖2）。二者cDNA同源性達97.32%，且第一外顯子同源性達93.14%。2個基因編碼區(qū)的同源性高度一致，為由1個gRNA同時編輯2個基因提供了必要條件。

基因編輯的特異性取決于gRNA的特異性。選取2個基因編碼區(qū)序列一致的區(qū)域，尋找基因編輯所必備的PAM結構（圖3），設計2個靶位點gRNA1和gRNA2的引物序列（FAD3-cas9-SE1F：5-TCGCC GATGCGGAAGGGCGG-3，F(xiàn)AD3-cas9-SE1R：5-CCGCCCTTCCGCATCGGCGA-3；FAD3-cas9-SE2F：5-TCTTGCGCCAGCAGTGGGCG-3，F(xiàn)AD3-cas9- SE2R：5-CGCCCACTGCTGGCGCAAGA-3。下劃線為與基因編輯載體AarI-Cas-9-PC1300相連接所需的黏性末端），引物由捷瑞生物北京分公司合成。

bar=100 bp

圖3 gRNA1靶位點設計示意圖

1.3 基因編輯載體的構建

gRNA1和gRNA2引物由捷瑞生物公司以脫鹽方式合成4 OD，依據(jù)合成量，將合成好的上下游引物分別加入去離子ddH2O，并稀釋至100 μmol·L-1。分別吸取上述引物（FAD3-cas9-SE1F/FAD3-cas9- SE1R和FAD3-cas9-SE2F/FAD3-cas9-SE2R）的母液各10 μL加入同一PCR管中進行退火。退火程序為98℃ 5 min，自然冷卻至室溫。gRNA1和gRNA2黏性末端片段制備完成，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將AarI-Cas9-PC1300載體經(jīng)Ⅰ37℃酶切，酶切體系為載體質(zhì)粒10 μL、Ⅰ 2 μL、10×Buffer 5 μL、50×oligonucleotide（0.025 mmol·L-1）1 μL，補充ddH2O至50 μL。酶切產(chǎn)物回收、純化，用30 μL ddH2O洗脫，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將gRNA1和gRNA2片段分別與AarI-Cas9- PC1300載體連接（圖4）。連接體系為T4 DNA Ligase1 μL、5×Rapid Buffer 2 μL、退火產(chǎn)物片段6 μL和AarI- Cas9-PC1300載體1 μL。22℃溫浴20 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，過夜培養(yǎng)，篩選陽性克隆測序，檢測這兩個載體是否構建成功，并命名為FAD3-S1-PC1300和FAD3-S2-PC1300。

1.4 農(nóng)桿菌介導的基因編輯

參考Toki等[15]方法將植物基因編輯載體FAD3- S1-PC1300和FAD3-S2-PC1300進行基因轉(zhuǎn)化。

圖4 植物基因編輯載體示意圖

1.5 基因編輯植株的靶位點基因型鑒定

為了精確檢測編輯靶位點的突變類型，將對T1代植株進行基因型鑒定。按照陳曉軍等[16]方法提取植株葉片DNA。在靶位點上、下游分別設計引物（OsFAD3.1-dect-F：5-CCTTCCTTCCTTCCTTCCTG GG-3，OsFAD3.1-dect-R：5-GAAATACCAGTCGTGG CCGAG-3；OsFAD3.2-dect-F：5-GGAGGAGCTTGGT TTCTGGG-3，OsFAD3.2-dect-R：5-GGCCAGGCCGC CCAGGCGA-3），擴增片段508 bp，擴增片段447 bp。一個轉(zhuǎn)化植株同時對2個靶位點進行突變類型鑒定。PCR反應體系為模板DNA 2 μL、2×Mixture 20 μL、上下引物各1 μL，補充ddH2O至40 μL。PCR反應程序為93℃ 3 min；93℃ 30 s，55℃30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余產(chǎn)物Sanger測序留用。

1.6 基因編輯植株的籽粒農(nóng)藝性狀測定

利用萬深SC-A1型種子自動考種及千粒重儀對受體材料和基因編輯材料進行考種。測定平均粒長（average grain length，AGL）、平均粒寬（average grain width，AGW）和千粒重（thousand grain weight，TGW）。

1.7 基因編輯植株的脂肪酸測定

采用國家標準GB5009.168-2016第一法內(nèi)標法，利用氣質(zhì)聯(lián)用對3份受體材料和3份基因編輯材料進行37種脂肪酸測定。所用水稻材料去內(nèi)外稃后備用。測定的脂肪酸包括丁酸C4:0、己酸C6:0、辛酸C8:0、癸酸C10:0、十一烷酸C11:0、月桂酸C12:0、十三烷酸C13:0、肉豆蔻酸C14:0、肉豆蔻烯酸C14、十五烷酸C15:0、十五碳烯酸C15:1、棕櫚酸C16:0、棕櫚油酸C16:1、十七烷酸C17:0、十七碳烯酸C17:1、十八烷酸C18:0、油酸C18:1、反油酸C18:1、亞油酸C18:2、反亞油酸C18:2TT,trans-9,12、γ-亞麻酸C18:3,cis- 6,9,12、亞麻酸C18:3,cis-9,12,15、花生酸C20:0、二十碳烯酸C20:1,cis-11、二十碳三烯酸C20:3,cis-11, 14,17、二十碳三烯酸C20:3,cis-8,11,14、花生四烯酸C20:4,cis-5,8,11,14、二十碳五烯酸（EPA-M）C20:5,cis-5,8,11,14,17、二十一烷酸C21:0、二十碳二烯酸C20:2,cis-11,14、二十二碳酸C22:0、芥酸C22:1,cis-13、二十二碳二烯酸C22:2,cis-13,16、二十二碳六烯酸（DHA-M）C22:6,cis-4,7,10,13,16,19、二十三烷酸C23:0、二十四烷酸C24:0和二十四碳烯酸C24:1,cis-15。

2 結果

2.1 植物編輯載體的鑒定

通過對所構建的植物基因編輯載體進行測序鑒定，靶位點gRNA1的20個堿基正確連入編輯載體FAD3-S1-PC1300（圖5-A）；靶位點gRNA2的20個堿基也正確連入編輯載體FAD3-S2-PC1300（圖5-B）。

2.2 OsFAD3突變體的鑒定

在T1代測序中，可以觀察到同一植株2個靶位點和都有純合突變，即在第二代中獲得2個位點的純合突變體（圖6）。但2個載體存在編輯效率的差異。FAD3-S1-PC1300在T1代中出現(xiàn)了2個靶位點均純合的植株，而FAD3-S2-PC1300在T1代中出現(xiàn)2個靶位點雜合的植株較多（圖6）。

A：FAD3-S1-PC1300載體測序；B：FAD3-S2-PC1300載體測序 A: Sequence of FAD3-S1-PC1300; B: Sequence of FAD3-S2-PC1300

A、B：FAD3-S1-PC1300基因編輯載體轉(zhuǎn)化植株測序；C、D：FAD3-S2-PC1300基因編輯載體轉(zhuǎn)化植株測序；A、C：OsFAD3.1靶位點；B、D：OsFAD3.2靶位點；箭頭所示位置為編輯位點

在FAD3-S1-PC1300載體的基因編輯后代純合個體中，大多數(shù)突變發(fā)生在PAM結構前3個堿基，符合增加或減少1個堿基的預期。但也有大片段缺失（-40 bp）（圖7-A），可見植物體發(fā)生基因編輯的機制還很復雜，可能與染色體DNA的高級結構相關。

A：FAD3-S1-PC1300編輯植株；B：FAD3-S2-PC1300編輯植株

在FAD3-S2-PC1300載體的基因編輯后代純合個體中，2個靶位點同時出現(xiàn)純合突變的植株較少。在T1代測序后代株系中有2個靶位點雜合的植株，表明2個靶位點同時發(fā)生了基因編輯（圖7-B）。

在所有2個載體的純合突變體中，同一株系后代只有2種突變形式，表明T0代嵌合體的數(shù)目較少。

對FAD3-S1-PC1300載體的基因編輯后代4個株系共37株（n=15，n=3，n=9，n=10）植株進行測序，對FAD3-S2-PC1300載體的基因編輯后代4個株系共36株（n=14，n=3，n=10，n=9）植株進行測序，統(tǒng)計（AA）和（BB）基因型（圖9）。2個載體轉(zhuǎn)化后代均沒有aaBb基因型，F(xiàn)AD3-S1- PC1300載體中沒有AAbb和AaBB；FAD3-S2-PC1300載體中沒有aabb和aaBb。

2.3 OsFAD3雙突變體的籽粒農(nóng)藝性狀測定

在受體材料和基因編輯的雙突變體稻米材料中，營養(yǎng)生長期和生殖生長期在株高、葉片形態(tài)和顏色、穗型上均無顯著改變。此外，還重點調(diào)查了其籽粒性狀，它們的千粒重、平均粒長、平均粒寬均無顯著變化，受體材料千粒重（TGW）、平均粒長（AGL）、平均粒寬（AGW）分別為23.84 g、6.77 cm和3.14 cm；基因編輯雙位點純合突變體材料的千粒重、平均粒長、平均粒寬分別為22.78 g、6.67 cm和3.07 cm（圖10）。

圖9 9種基因型在基因編輯后代中的分布

A：千粒重；B：平均粒長；C：平均粒寬

2.4 OsFAD3雙突變體的脂肪酸含量測定

在受體材料和基因編輯雙突變體稻米材料中，檢測到10種脂肪酸，包括肉豆蔻酸、棕櫚酸、十八烷酸、油酸、亞油酸、花生酸、二十碳烯酸、亞麻酸、芥酸和二十四烷酸（圖11）。受體稻米材料中脂肪酸相對含量分別為棕櫚酸（25.23±0.06）%、十八烷酸（1.77±0.13）%、油酸（33.12±0.95）%、亞油酸（36.01±1.07）%和亞麻酸（1.59±0.22）%?；蚓庉嫷久撞牧现兄舅嵯鄬糠謩e為棕櫚酸（25.05±0.41）%、十八烷酸（2.19±0.15）%、油酸（30.15±0.31）%、亞油酸（39.36±0.72）%和亞麻酸（0.89±0.14）%?；蚓庉嫷久讈営退嵯鄬刻岣?.36個百分點。亞麻酸相對含量降低0.7個百分點。結果表明，雙突變對棕櫚酸、十八烷酸的相對含量影響不大，但對亞油酸的含量顯著提高。

3 討論

據(jù)生物信息分析，在水稻中共有20個脂肪酸去飽和酶基因[17]，其表達產(chǎn)物分布在細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體、線粒體和質(zhì)膜上，其中，OsFAD3-1和OsFAD3-2定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。植物體內(nèi)，根據(jù)電子供體不同可將ω-3脂肪酸去飽和酶分為兩類，一類定位于植物細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，以細胞色素b5為電子供體，作用于磷脂酞甘油（phosphatidylglyeerol，PG）或其他磷脂；另一類定位于植物細胞質(zhì)體，以鐵氧還蛋白為電子供體，作用于磷脂酞甘油，硫脂和半乳糖脂。植物體內(nèi)有2條多聚不飽和脂肪酸的生物合成途徑。其中一條在微體中合成，另一條在質(zhì)體膜上。自從克隆了擬南芥內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ω-3脂肪酸去飽和酶基因[18]以來，又陸續(xù)克隆了核桃[19]、西班牙鼠尾草[20]、紫蘇[20-21]、油茶[22]、油菜[23]、高粱[24]、大豆[25]等的不飽和脂肪酸的合成基因。

圖11 脂肪酸含量對比

植物中的不飽和脂肪酸由脂肪酸去飽和酶合成，它在植物的生長發(fā)育以及植物非生物脅迫方面起著重要的作用。水稻葉中、、和的mRNA表達具有晝夜節(jié)律性，在光照下表達量低，而在隨后的黑暗中表達量高，和的mRNA表達的晝夜節(jié)律性可能與水稻幼苗葉片中NADPH量的改變有關[26]。

在根組織中含量豐富，而在葉片中幾乎檢測不到。根組織中，在15℃和20℃條件下高水平表達，在低于10℃條件下其水平顯著降低。在正常生長溫度和低溫條件下，在葉組織中的積累保持在相當?shù)偷乃?。在耐冷性和不耐冷性水稻品種中表現(xiàn)出相似的溫度響應[27]。

Yin等[28]從水稻和大豆中克隆了2個ω3/Δ15脂肪酸去飽和酶基因，并在胚特異啟動子REG驅(qū)動下將它們導入水稻中。轉(zhuǎn)基因株系中，胚和米糠中的α-亞麻酸（α-linolenic acid，ALA）含量分別增加到6.09和5.86 mg·g-1，這比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.24和0.21 mg·g-1提高了25.4和27.9倍。而本試驗中，亞麻酸相對含量則由（1.59±0.22）%降低到（0.89±0.14）%。說明完全缺失該基因確實關閉了下游亞麻酸的合成。

Liu等[29]過量表達定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的和的轉(zhuǎn)基因株系，種子中ALA含量從0.36 mg·g-1分別提升到8.57和10.06 mg·g-1，是非轉(zhuǎn)基因植株的23.8和27.9倍。在水稻種子中OsFAD3催化亞油酸（linoleic acid，LA）向ALA轉(zhuǎn)化的活性強于GmFAD3-1。過量表達定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的GmFAD3-2/ GmFAD3-3以及葉綠體定位的OsFAD7/OsFAD8對于提高水稻種子ALA含量的作用較小。

本研究表明，獲得的ω-3脂肪酸去飽和酶2個基因的突變材料能夠增加亞油酸的含量3.36個百分點。

由于冗余功能基因的存在，多拷貝基因的生物學功能一直是研究難點。一個gRNA打靶2個同源基因這一策略客觀上要求在基因編輯后代中能夠利用引物的特異性把2個靶基因分開。只有這樣才能同時對2個基因進行靶位點的鑒定。本研究通過獲得了一系列基因編輯材料，對研究功能基因的劑量效應[30]也有一定幫助。另外，同時敲除3個或以上的高拷貝基因可能也達到預計的目的。

4 結論

根據(jù)基因編輯原理，達到了一個載體同敲除2個同源基因的目的，并且易獲得2個位點的純合編輯材料，同時亞油酸含量提高了3.36個百分點。

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Production of High Linoleic Acid Rice by Genome Editing

CHEN Xiaojun1, WU Kaishen2, HUI Jian1, BAI HaiBo1, MA Sishuang1, LI Jingyu2

1Agricultural Biotechnology Center, Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Key lab of Agricultural Biotechnology of Ningxia, Yinchuan 750002;2College of Biological Science & Engineering, North Minzu University, Yinchuan 750021

【】 Linoleic acid is one of essential fatty acid for human, which can accelerate the metabolism and decomposition of fat in the body, reduce the accumulation of cholesterol on the wall of blood vessels, effectively prevent the occurrence of arteriosclerosis, improve human immunity, promote bone development, improve memory and prevent brain function degradation. Rice bran is a by-product of rice processing, and is an edible oil with high nutritional value. In this paper, we precisely edited the gene of ω-3 fatty acid desaturase, which is the key enzyme controlling fatty acid synthesis pathway. It can enrich the upstream linoleic acid, while closing the synthesis pathway of downstream products. 【】There are two copies of the key enzyme ω-3 fatty acid desaturase gene () in the fatty acid synthesis pathway in rice, which are located on chromosome 11 and chromosome 12, and their cDNA homology is 97.32%. According to the basic principles of gene editing, the specificity of edit depends on the characteristics of the guide RNA (gRNA). In this study, two gRNAs were designed and synthesized in the exon region of two homologous genes, and were constructed into editing vectors respectively. The local receptor material (Fuyuan 4) was successfully transformed by Agrobacterium mediated method. The editing efficiency and genotype of the two sites were analyzed. At the same time, the main agronomic characters ofdouble mutant were measured, such as grain width and grain length. The contents of 37 fatty acids were figured by GC-MS in the grains ofdouble mutants. 【】The results showed two homozygous editing materials were obtained, and other editing materials with different genotypes were obtained. Compared with the control materials, the main agronomic traits such as grain width and grain length ofdouble mutant materials had no significant changes, however, the relative content of linoleic acid in rice increased by 3.36%. 【】One gRNA vector knock out two ω-3 fatty acid desaturase genes at the same time, which improves the relative content of linoleic acid in grains without changing the main agronomic traits of seeds.

rice; gene edit; high linoleic; rice bran

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.001

2020-11-02；

2021-01-29

國家自然科學基金（31860374）、寧夏農(nóng)林科學院資金引導項目（DW-X-2018004，NKY-18-06）、寧夏自治區(qū)自然科學基金（2018AAC02017）、寧夏農(nóng)業(yè)育種專項（2018NYYZ 0302）

陳曉軍，E-mail：smallgene@126.com

（責任編輯 李莉）