幾種外源物質(zhì)對鹽脅迫下火力楠幼苗生理特性的影響1)

粟莉圓 胡穎 梁機 楊章旗 陳旋 孫明升

(廣西大學(xué)，南寧，530004)(廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院)

鹽脅迫不僅會導(dǎo)致植物滲透脅迫，根系吸水困難，造成水分及營養(yǎng)的供應(yīng)不足；同時體內(nèi)積累活性氧，若不能及時清除會對葉綠素、不飽和脂、蛋白質(zhì)、核酸等生物分子具有破壞作用[1]，進(jìn)而引起酶活性下降、蛋白降解和脂質(zhì)過氧化等反應(yīng)[2]。甜菜堿(BT)具有調(diào)節(jié)植物對環(huán)境脅迫的適應(yīng)性，提高細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)的能力，可減少滲透失水對植物造成的傷害[3]。它具有保持細(xì)胞與外界環(huán)境滲透平衡的穩(wěn)定復(fù)合蛋白4級結(jié)構(gòu)，使受到鹽脅迫影響而降低的Rubisco恢復(fù)活力，保持相關(guān)酶處于有功能的狀態(tài)[4]；有研究表明在鹽脅迫下添加外源甜菜堿后，明顯提高了玉米及小麥的光合能力、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率和相關(guān)抗氧化酶的活性，從而抵御鹽脅迫環(huán)境[5]。鈣(Ca2+)是植物生長發(fā)育所必須的元素，與維持細(xì)胞膜通透性、離子運輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程息息相關(guān)[6]，可增加植物抗性，尤其是產(chǎn)生抗鹽性狀。鹽脅迫下，細(xì)胞游離Ca2+濃度的增加顯著減少了細(xì)胞內(nèi)Na+的濃度。有證據(jù)表明，Ca2+是通過降低質(zhì)膜透性來減少Na+進(jìn)入細(xì)胞的。當(dāng)植物受到鹽脅迫時，細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度增加，Ca2+通過與其主要受體CaM結(jié)合，從而進(jìn)一步激活適當(dāng)?shù)牡鞍准っ?，激發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，這是Ca2+的一般作用方式[4]。丁能飛等[7]發(fā)現(xiàn)外源鈣的添加可顯著促進(jìn)西蘭花的生長、增加鮮重，使SOD、POD、CAT活性升高，降低西蘭花葉片MDA含量，減輕鹽脅迫對葉片膜脂過氧化程度，減少地上部、地下部Na+的積累，增加K+、Ca2+的濃度，提高其耐鹽性。茉莉酸(MeJA)參與調(diào)控植物發(fā)育、滲透脅迫和防御反應(yīng)過程等[8]。有研究表明外源施用茉莉酸甲酯能有效對抗鹽脅迫造成的生長抑制，減輕鹽脅迫對幼苗造成的傷害，提高幼苗的耐鹽能力[9]。研究還發(fā)現(xiàn)，MeJA不僅可系統(tǒng)誘導(dǎo)蛋白酶抑制劑(PI)和多酚氧化酶(PPO)，從而影響植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，還能增加過氧化物酶和脂氧合酶等防御蛋白的活性水平，使植物積累生物堿和酚酸類次生物質(zhì)增加并改變揮發(fā)性信號化合物的釋放[10]。Taheri et al.[11]報道了鹽脅迫誘導(dǎo)牛舌草葉片鮮質(zhì)量、葉面積、葉相對含水量(RWC)、葉綠素a、可溶性糖、總蛋白質(zhì)等含量顯著降低，而MeJA緩解了鹽脅迫植株的不良作用。水楊酸(SA)對植物的作用主要在防病害及緩解逆境脅迫方面，作為信號分子來調(diào)控植物基因表達(dá)而影響其生理特性，提高植物抗性[12]。在Mimouni et al.[13]的研究中，NaCl脅迫下大針茅幼苗的相對電導(dǎo)率和MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高，而凈光合作用、相對含水量降低，幼苗整體的生長速率明顯降低。對葉片施用SA能提高葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和抗氧化酶活性，并增加CO2的凈同化速率，提高光合作用過程，減輕膜損傷，進(jìn)而增加了莖和根的干物質(zhì)含量。還有研究發(fā)現(xiàn)幼苗的發(fā)芽率和生長速率(從莖和根的長度來看)在鹽處理下顯著降低，通過添加SA可以調(diào)節(jié)緩解鹽脅迫對水稻植株的不利影響[14]；外施不同濃度的水楊酸后，白刺葉片質(zhì)膜所受傷害均有不同程度的緩解[15]。目前，國內(nèi)外對植物耐鹽生理機制、外源物質(zhì)添加對植物生理的影響做了許多研究，外源添加上述4類物質(zhì)已被證明可有效緩解鹽脅迫對植物的傷害；但同時使用兩種以上外源物質(zhì)及其不同濃度處理探究植物鹽脅迫生理特性的報道較少，此外研究對象多為農(nóng)作物等草本植物，在用材林樹種火力楠耐鹽性方面也未涉及。

廣西濱海地區(qū)土壤作為后備資源用地，具有優(yōu)良的立地條件，但造林樹種單一，生物多樣性低[16]，豐富沿海造林樹種，對廣西林業(yè)發(fā)展以及生態(tài)可持續(xù)具有重要的意義。但沿海地區(qū)土壤含鹽量高，過量的鹽會影響植物種子萌發(fā)、生長發(fā)育和光合作用，最終對植物產(chǎn)生毒害作用?；鹆﹂?MicheliamacclureiDandy)學(xué)名醉香含笑，為木蘭科含笑屬喬木，是華南地區(qū)珍貴速生常綠闊葉樹種之一，具有很高的經(jīng)濟價值。其木材可做優(yōu)良建筑和家具用材，果實可提取植物油。本文研究4種外源物質(zhì)對鹽脅迫下火力楠幼苗生理指標(biāo)的影響，探究外源物質(zhì)處理對鹽脅迫下火力楠幼苗的生理代謝機制，篩選出緩解鹽脅迫的最佳外源物質(zhì)種類及其濃度或物質(zhì)的量，旨在為廣西沿海造林綠化與生態(tài)工程建設(shè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗苗木處理在廣西大學(xué)林學(xué)院苗圃進(jìn)行，供試1年生火力楠幼苗來源于廣西林科院。2018年7月選取長勢一致、健康良好，苗高55～65 cm的1年生火力楠盆栽幼苗用于試驗。

1.2 試驗設(shè)計

鹽脅迫前對幼苗采用BT、CaCl2、MeJA、SA 4種外源物質(zhì)進(jìn)行噴施處理，每種外源物質(zhì)分別設(shè)置低、中、高3種質(zhì)量濃度或濃度梯度(表1)。一個組包含30～40株幼苗，總共12組，另設(shè)對照。每天上午08：00對火力楠幼苗噴施上述溶液，噴施量以葉片正反面完全濕潤到剛有水滴出為準(zhǔn)，連續(xù)噴施3 d，而后使用300 mmol·L-1NaCl溶液浸沒至營養(yǎng)杯2/3處，處理7 d。以未作任何處理的普通幼苗為對照CK1，以單鹽脅迫處理幼苗為對照CK2，分別在NaCl處理第1天、第4天和第7天早上08：00測定葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并采集幼苗根莖向上第4～5位火力楠葉片帶回實驗室保存在超低溫冰箱-80 ℃，進(jìn)行其余各項指標(biāo)測定，重復(fù)3次。

表1 不同處理組合梯度設(shè)置

1.3 指標(biāo)測定

采用相對電導(dǎo)率法[17]測量細(xì)胞膜透性；葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用SPAD502葉綠素含量測定儀測定?？扇苄蕴琴|(zhì)量分?jǐn)?shù)(SS)、可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)(SP)、過氧化氫酶(CAT)活性、過氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性分別根據(jù)蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2010進(jìn)行收集與整理，檢驗方法使用雙因素重復(fù)測量方差分析，運用SPSS 24進(jìn)行一般描述與統(tǒng)計并進(jìn)行事后多重比較(LSD法)，P<0.05為顯著差異，Oringin 2017作圖；Fuzzy綜合評價法評價不同處理下火力楠幼苗的耐鹽性，具體計算方法如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 外源物質(zhì)處理對鹽脅迫下葉片相對電導(dǎo)率的影響

由表2可知，隨著鹽脅迫時間的增加各處理的相對電導(dǎo)率逐漸升高，CK2處理葉片在NaCl脅迫后的相對電導(dǎo)率均顯著高于CK1(P<0.05)，說明葉片細(xì)胞膜受損，膜透性逐漸增大。噴施外源物質(zhì)后，各處理的相對電導(dǎo)率均顯著低于單鹽脅迫CK2，4種外源物質(zhì)的中等質(zhì)量濃度或濃度處理下相對電導(dǎo)率較低，其中S2、C2、MJ2處理的相對電導(dǎo)率分別為CK2的71.93%、73.68%、75.44%。以上分析表明這4種外源物質(zhì)中等質(zhì)量濃度或濃度處理可顯著緩解葉片鹽害，其中SA中質(zhì)量濃度處理(S2，100 mg·L-1SA)相對電導(dǎo)率最小，緩解鹽傷害效果最好。

表2 鹽脅迫下外源物質(zhì)處理葉片相對電導(dǎo)率的變化

2.2 外源物質(zhì)處理對鹽脅迫下葉片葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

從表3可以看出，隨著鹽脅迫時間的增加，各處理葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢。脅迫7 d后，大部分處理葉綠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于對照CK2，但差異均未達(dá)到顯著水平，比CK2高出0.02～0.21 mg·g-1。由此可見，火力楠幼苗葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在短時間鹽脅迫下響應(yīng)不靈敏，在外源物質(zhì)作用下略有提高。

表3 鹽脅迫下外源物質(zhì)處理火力楠幼苗葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

2.3 外源物質(zhì)處理對鹽脅迫下葉片可溶性蛋白和可溶性糖的影響

表4顯示，隨著鹽脅迫時間的增加，單鹽處理CK2的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸升高，在7 d后為CK1的1.21倍，在4種外源物質(zhì)作用下可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較CK2均有提高，且存在顯著差異(P<0.05)。4種外源物質(zhì)處理調(diào)節(jié)可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高作用大小排序為MeJA、BT、SA、CaCl2；外源物質(zhì)MeJA高物質(zhì)的量、BT高濃度以及CaCl2低物質(zhì)的量處理下可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于CK2，其中可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的MJ3(3 mmol·L-1)比CK2高出2.28 mg·g-1。

表4 鹽脅迫下外源物質(zhì)處理葉片可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

從表5可以看出，噴施不同4種外源物質(zhì)在鹽脅迫后可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于CK2(P<0.05)，且由大到小MeJA、SA、BT、CaCl2。其中MeJA、BT處理與CK2存在顯著差異；但其不同濃度或物質(zhì)的量處理間不存在明顯差異。測定結(jié)果表明，鹽脅迫下火力楠幼苗滲透調(diào)節(jié)功能受到了影響，4類外源物質(zhì)均可調(diào)節(jié)火力楠幼苗的滲透能力，減輕幼苗受到的傷害，綜合比較發(fā)現(xiàn)外源MeJA處理可顯著調(diào)節(jié)葉片中可溶性糖和蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其次SA、BT處理效果也相對較好。

表5 鹽脅迫下外源物質(zhì)處理葉片可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

2.4 外源物質(zhì)處理對鹽脅迫下葉片CAT、POD、SOD活性的影響

由表6可知，在整個鹽脅迫過程中CK2活性都高于CK1，在4d后達(dá)到顯著差異(P<0.05),說明鹽脅迫刺激火力楠幼苗CAT活性升高；不同外源物質(zhì)處理后，除B1、C2外各處理CAT活性總體呈升高趨勢。MeJA作用相比其他3種外源物質(zhì)使幼苗CAT活性升高更明顯，MeJA高物質(zhì)的量處理(MJ3)后葉片CAT活性為CK2的1.51倍。

表6 鹽脅迫下外源物質(zhì)處理葉片CAT活性變化

鹽脅迫后，CK2的POD活性先升高后下降，四種外源物質(zhì)均能提高葉片POD活性(表7，P<0.05)，作用大小排序為MeJA、CaCl2、SA、BT，其中MeJA、CaCl2這兩種外源物質(zhì)與對照存在明顯差異；4種外源物質(zhì)的低質(zhì)量濃度或濃度處理后葉片POD活性均顯著高于對照。POD活性最高為S1(25 mg·L-1SA)處理后的火力楠葉片，最低為S3(200 mg·L-1SA)處理，說明POD活對SA濃度變化響應(yīng)靈敏。

表7 鹽脅迫下外源物質(zhì)處理葉片POD活性變化

從表8可以看出，整個鹽脅迫過程中單鹽處理(CK2)的SOD活性均高于CK1，隨著脅迫時間的增加呈升高趨勢，4種外源物質(zhì)處理后SOD活性均顯著提高(P<0.05)；外源物質(zhì)CaCl2低、中濃度以及SA中、高質(zhì)量濃度作用相較其他處理的SOD活性升高顯著。綜上可得，除MJ2外，各處理均能顯著增加火力楠幼苗葉片中的SOD活性，其中S2(100 mg·L-1SA)處理下葉片SOD活性升高明顯。

2.5 鹽脅迫下火力楠幼苗生理指標(biāo)的相關(guān)分析

由表9可得，鹽脅迫下火力楠葉片相對電導(dǎo)率(RC)與可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、SOD活性呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)與CAT活性呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與SOD活性呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。相關(guān)分析結(jié)果表明當(dāng)幼苗受到鹽脅迫導(dǎo)致葉片受到傷害，細(xì)胞液外滲、相對電導(dǎo)率升高，活性氧等氧化物自由基對細(xì)胞膜系統(tǒng)的損害加重，細(xì)胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)及CAT、SOD酶活性也升高，而葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)受到鹽脅迫影響而降低。

表9 鹽脅迫下火力楠幼苗各生理指標(biāo)間的相關(guān)分析

2.6 外源物質(zhì)處理下火力楠幼苗耐鹽脅迫的綜合評價

采用Fuzzy綜合評價法計算各處理指標(biāo)的隸屬值及對總分排序(表10)，總分越高表示參試處理越能降低火力楠幼苗所受鹽害。4類外源物質(zhì)緩解效果排序由大到小為MeJA、SA、CaCl2、BT，其不同質(zhì)量濃度或濃度處理排序由大到小分別為B1、B3、B2，C1、C3、C2，MJ3、MJ1、MJ2，S2、S3、S1。排名大于CK1的處理從高到低為MJ3、S2、C1、MJ1、S3、MJ2、S1、C3、B1、B3、C2。說明對葉片噴施3 mmol·L-1MeJA(MJ3)最能有效提高火力楠幼苗的耐鹽能力。

表10 鹽脅迫下外源物質(zhì)處理火力楠幼苗生理指標(biāo)的隸屬值及排序

3 結(jié)論與討論

對多數(shù)植物來講，鹽含量過高會影響植物生長發(fā)育和生理功能，改變植物體內(nèi)的滲透平衡，降低光合作用，使植物生長變慢甚至死亡[18]。研究表明，逆境脅迫下細(xì)胞膜相對透性明顯變化，大量細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外滲，組織浸泡液的電導(dǎo)率會升高，同時還引起生理代謝紊亂，酶系統(tǒng)受影響，葉綠體結(jié)構(gòu)遭破壞，光合作用變?nèi)醯萚19]。本研究在300 mmol·L-1NaCl脅迫下，火力楠幼苗的相對電導(dǎo)率隨著脅迫時間的增加顯著升高，與前人研究結(jié)果相一致[18]。噴施中等質(zhì)量濃度或濃度的BT、CaCl2、MeJA、SA后的火力楠幼苗均可提高其耐鹽能力，其中100 mg·L-1SA處理效果好?？赡苡捎谠诿{迫中SA是驅(qū)動植物防御基因的表達(dá)的信號因子，能誘導(dǎo)特異基因表達(dá)，合成與植物細(xì)胞防御有關(guān)的蛋白質(zhì)及次生物質(zhì)[20]。間接使這些次生物質(zhì)作用于火力楠幼苗滲透，使這兩類外源物質(zhì)處理后的電導(dǎo)率更低，變幅更小。本試驗結(jié)果還說明了4種外源物質(zhì)過低或過高濃度處理下對火力楠幼苗的相對電導(dǎo)率影響較小甚至?xí)又赜酌缡艿降柠}害。

葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響植物光合作用強弱，是衡量植物代謝的重要指標(biāo)，鹽脅迫下葉片中葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)會降低[21]，Rao等認(rèn)為葉綠素的減少主要由于葉綠素酶對葉綠素b的降解所致[22]。本試驗中噴施外源物質(zhì)后300 mmol·L-1NaCl處理下火力楠幼苗體內(nèi)葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)各處理隨著鹽脅迫時間的增加呈下降趨勢，但差異不顯著，可能是鹽脅迫時間短而對葉綠素影響作用較小導(dǎo)致。

可溶性糖和可溶性蛋白是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，為適應(yīng)逆境條件，可主動積累[23]。本試驗中在外源物質(zhì)作用下可溶性糖和蛋白質(zhì)大量合成，調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透功能以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，這與宿越[24]等的結(jié)果一致。其中3 mmol·L-1MeJA處理對葉片中可溶性糖和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加效果最佳。

植物抗氧化防御系統(tǒng)由抗氧化酶活性和非酶抗氧化水平組成。大量研究表明，在鹽脅迫下，大多數(shù)植株中編碼抗氧化酶的基因(如SOD、POD和CAT)表達(dá)上調(diào)，如豌豆、北美豆梨等[25-26]；也有研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下植物SOD、POD和CAT活性先上升后下降[27]。山思雨[28]等發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下外源MeJA處理顛茄葉片的抗氧化酶活性均高于單鹽處理；MeJA對鹽脅迫下沙冬青幼苗也有同樣的作用[29]。本研究中在鹽脅迫下火力楠葉片的CAT、SOD活性均升高，POD活性先升高后下降，在施用外源MeJA后CAT活性變強，SA處理下POD、SOD活性明顯升高。鹽脅迫下3種抗氧化對鹽脅迫的作用機制不同導(dǎo)致酶活性表達(dá)有差異。CAT負(fù)責(zé)清除由光呼吸或脂肪酸氧化過程中形成的過氧化物；POD則主要催化H2O2、氧化酚類和胺類化合物；SOD是超氧化物陰離子清除酶，也是H2O2主要生成酶[30]。SA可通過調(diào)控信號分子代謝酶的活性而積累H2O2，H2O2作為第二信使誘導(dǎo)保護(hù)酶的合成[31]，這可能是SA相比其他3種外源物質(zhì)對酶活性影響更顯著的原因。

綜上，適宜濃度或物質(zhì)的量的外源甜菜堿、氯化鈣、水楊酸和茉莉酸對火力楠幼苗鹽脅迫均有緩解作用，經(jīng)過綜合評價發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下3 mmol·L-1茉莉酸甲酯、100 mg·L-1水楊酸、5 mmol·L-1氯化鈣處理均具有減少對火力楠幼苗傷害的功效，但鹽脅迫對植物的影響機制比較復(fù)雜，因此有關(guān)外源物質(zhì)對火力楠生理生化的影響尚需要進(jìn)一步研究。