潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道菌群紊亂與Th17/ Treg 平衡及相關(guān)細(xì)胞因子的關(guān)系

葉 佳 朱梅萍 劉 暢

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院脾胃病科，上海 201203

炎癥性腸?。↖BD）是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，而潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是IBD 常見(jiàn)類型，主要特點(diǎn)為結(jié)直腸黏膜彌漫、連續(xù)炎癥改變，病變主要局限于黏膜下層和大腸黏膜[1]。研究認(rèn)為，免疫失衡在UC 發(fā)病中扮演重要角色，以抗炎與促炎因子間失衡為主要研究方向[2]。T 淋巴細(xì)胞為機(jī)體重要免疫細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)T 淋巴細(xì)胞激活后可釋放多種血管活性物質(zhì)和細(xì)胞因子，加重組織炎癥反應(yīng)，促進(jìn)UC 發(fā)生和發(fā)展[3]。輔助性T 細(xì)胞17（Th17）和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）是新近發(fā)現(xiàn)的CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群，在多種免疫性疾病發(fā)生、發(fā)展中Th17/Treg 失衡及相關(guān)細(xì)胞因子的異常表達(dá)發(fā)揮重要作用[4]。有研究證實(shí)，UC 的發(fā)生和發(fā)展不僅與免疫調(diào)節(jié)功能紊亂有關(guān)，還與腸道菌群紊亂有關(guān)，是免疫損傷重要激發(fā)因素[5]。本研究就探討UC 患者腸道菌群紊亂與Th17/Treg 平衡及相關(guān)細(xì)胞因子的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年7 月—2020 年7 月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）收治的30 例活動(dòng)期UC（AUC）患者為AUC組，其中男14 例，女16 例；平均年齡（45.56±3.72）歲；1∶1 選取我院30 例緩解期UC（RUC）患者為RUC組，其中男15 例，女15 例；平均年齡（45.68±3.63）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診，符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)（2018 年，北京）》[6]中AUC、RUC 診斷標(biāo)準(zhǔn)；②患者及家屬均知情研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠及哺乳期婦女；②心、肝、腎功能損害；③近1 個(gè)月使用免疫抑制劑、激素、微生態(tài)制劑、抗生素；④完全性腸梗阻或不完全性腸梗阻。另選取同期30 名來(lái)我院體檢健康者為對(duì)照組，其中男16 名，女14 名；平均年齡（44.57±3.87）歲；三組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 腸道菌群數(shù)目檢測(cè) 分別留取三組自然排出糞便1 g，糞便基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司；貨號(hào)：D2700；規(guī)格：50T），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（蘇州宇恒生物科技有限公司；貨號(hào)：R2043；規(guī)格：20 μL×100T）轉(zhuǎn)錄合成cDNA，加入細(xì)菌基因組DNA 引物，引物序列見(jiàn)表1，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增曲線計(jì)算細(xì)菌數(shù)目，以lg n/g 表示。

表1 腸道菌群引物序列

1.2.2 外周血Th17、Treg、Th17/Treg比值測(cè)定抽取三組3mL空腹外周靜脈血，密度梯度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞，各管加入CD8a-異硫氰酸熒光素、CD3-藻紅蛋白Cy5、白細(xì)胞介素（IL）-17 藻紅蛋白，室溫避光孵育30 min。加入100 μL 固定劑，孵育30 min，加入100 μL 破膜劑A，室溫孵育15 min，磷酸緩沖鹽溶液洗滌，800 r/min 離心6 min（半徑13.5 min），收集細(xì)胞，加入100 μL破膜劑B 和IL-17 抗體，室溫孵育20 min，磷酸緩沖鹽溶液洗滌，磷酸緩沖鹽溶液500 μL細(xì)胞重懸，貝克曼庫(kù)爾DxFLEX 流式細(xì)胞儀測(cè)定Th17 占比。再抽取三組3 mL 空腹外周靜脈血，加入10 μL CD127-藻紅蛋白-Cy5、CD25-Cy5、CD4-異硫氰酸熒光素，室溫孵育20 min，加入1 mL 溶血素，混勻后再加入磷酸緩沖鹽溶液2 mL，1500 r/min 離心5 min（半徑8 cm），棄上清，磷酸緩沖鹽溶液500 μL細(xì)胞重懸，貝克曼庫(kù)爾DxFLEX 流式細(xì)胞儀測(cè)定Treg 占比，并計(jì)算Th17/Treg 比值。

1.2.3 結(jié)腸黏膜組織中炎癥因子表達(dá)水平測(cè)定 石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精洗去二甲苯，檸檬酸鈉緩沖液抗原修復(fù)，使內(nèi)部抗原決定簇暴露，3%過(guò)氧化氫浸泡10 min，封閉，加入稀釋一抗4℃孵育12 h，沖洗后加入二抗室溫孵育30 min，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3 次。二氨基聯(lián)苯胺作用4 min，去離子水終止，高倍鏡（400 倍）下取5 個(gè)視野，計(jì)算黏膜組織中IL-2、IL-6、IL-10、IL-17 光密度值，以平均值為表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)；Pearson 系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組腸道菌群數(shù)目比較

AUC組腸球菌、腸桿菌數(shù)目明顯多于RUC組、對(duì)照組，且RUC組高于對(duì)照組（P ＜0.05）；AUC組擬桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)目明顯少于RUC組、對(duì)照組，且RUC組低于對(duì)照組（P ＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 三組腸道菌群數(shù)目比較（lg n/g，）

表2 三組腸道菌群數(shù)目比較（lg n/g，）

注：與對(duì)照組比較，ΔP ＜0.05；與RUC組比較，*P ＜0.05。UC：潰瘍性結(jié)腸炎

2.2 三組外周血Th17、Treg、Th17/Treg 比值比較

AUC組外周血Th17 細(xì)胞比例明顯高于RUC組、對(duì)照組，且RUC組高于對(duì)照組（P ＜0.05）；AUC組Treg 細(xì)胞比例和Th17/Treg 比值明顯低于RUC組、對(duì)照組，且RUC組低于對(duì)照組（P ＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 三組外周血Th17、Treg、Th17/Treg 比值比較（）

表3 三組外周血Th17、Treg、Th17/Treg 比值比較（）

注：與對(duì)照組比較，ΔP ＜0.001；與RUC組比較，*P ＜0.001。Th17：輔助性T 細(xì)胞17；Treg：調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞；UC：潰瘍性結(jié)腸炎

2.3 三組結(jié)腸黏膜組織中炎癥因子表達(dá)水平比較

AUC組黏膜組織中IL-2、IL-6、IL-17 表達(dá)明顯高于RUC組、對(duì)照組，且RUC組高于對(duì)照組（P ＜0.05）；AUC組IL-10 表達(dá)明顯低于RUC組、對(duì)照組，且RUC組低于對(duì)照組（P ＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 三組結(jié)腸黏膜組織中炎癥因子表達(dá)水平比較（μm2，）

表4 三組結(jié)腸黏膜組織中炎癥因子表達(dá)水平比較（μm2，）

注：與對(duì)照組比較，ΔP ＜0.05；與RUC組比較，*P ＜0.05。IL：白細(xì)胞介素；UC：潰瘍性結(jié)腸炎

2.4 UC 患者外周血Th17、Treg 及炎癥因子與腸道菌群數(shù)目的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)性分析顯示，UC 患者外周血Th17、IL-2、IL-6、IL-17 與腸球菌、腸桿菌呈正相關(guān)，與擬桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌呈負(fù)相關(guān)（P ＜0.05）；Treg、IL-10 與腸球菌、腸桿菌呈負(fù)相關(guān)，與擬桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌呈正相關(guān)（P ＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 UC 患者外周血Th17、Treg 及炎性因子與腸道菌群數(shù)目的相關(guān)性（n=60）

3 討論

UC 是消化系統(tǒng)疑難疾病，盡管目前UC 的確切病因不明，但近年有關(guān)免疫力和腸道菌群的研究興起，發(fā)現(xiàn)UC 患者腸壁內(nèi)存在明顯過(guò)度免疫反應(yīng)，引起腸道菌群抗原過(guò)度應(yīng)答，導(dǎo)致消化道損傷，最終產(chǎn)生免疫損傷效應(yīng)機(jī)制[7-13]。正常情況下，有超過(guò)500 種細(xì)菌定居于腸道，其中專性厭氧菌即生理性優(yōu)勢(shì)菌占菌群總量的99%，其余兼性厭氧菌即條件致病菌占1%，繁殖處于相對(duì)抑制狀態(tài)[14-16]。Rosen 等[17]、Derikx 等[18]證實(shí)，UC 的發(fā)生與機(jī)體免疫和腸道菌群紊亂有關(guān)。Th17和Treg 為CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群成員，其中Th17 表現(xiàn)為前炎性細(xì)胞亞類特征，Treg 表現(xiàn)為拮抗Th17 作用，二者細(xì)胞信號(hào)通路相互制約、交通，其平衡關(guān)系與機(jī)體免疫反應(yīng)密切相關(guān)[19]。生理狀態(tài)下，T 淋巴細(xì)胞傾向Treg 分化，以維持機(jī)體免疫耐受，但若在感染、炎癥反應(yīng)等病理狀態(tài)下，可激活免疫系統(tǒng)，使T 淋巴細(xì)胞傾向Th17 分化，引起機(jī)體對(duì)自身抗原免疫反應(yīng)[20-21]。本研究結(jié)果顯示，三組外周血Treg 細(xì)胞比例逐漸降低，Th17 細(xì)胞比例和Th17/Treg 比值逐漸升高（P ＜0.05），提示UC 發(fā)生和發(fā)展有Th17/Treg 免疫失衡參與。結(jié)果顯示，Th17 與腸球菌、腸桿菌呈正相關(guān)，與擬桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌呈負(fù)相關(guān)（P ＜0.05）；Treg與腸球菌、腸桿菌呈負(fù)相關(guān)，與擬桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌呈正相關(guān)（P ＜0.05），兩者與腸道菌群間關(guān)系相反，進(jìn)一步提示腸道菌群紊亂可能通過(guò)各種機(jī)制影響Th17/Treg 免疫平衡，進(jìn)而參與UC 發(fā)生和發(fā)展。

Th17 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞均為CD4+T 細(xì)胞亞群之一，Th17 細(xì)胞可分泌IL-2、IL-6、IL-17 等促炎細(xì)胞，能誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，Treg 細(xì)胞可調(diào)節(jié)IL-10 等抗炎細(xì)胞，發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用[22]。本研究結(jié)果顯示，三組黏膜組織中IL-2、IL-6、IL-17 表達(dá)逐漸升高，IL-10表達(dá)逐漸降低（P ＜0.05），提示免疫炎癥反應(yīng)參與了UC 發(fā)生和發(fā)展。結(jié)果還顯示，IL-2、IL-6、IL-17 與腸球菌、腸桿菌呈正相關(guān)，與擬桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌呈負(fù)相關(guān)，IL-10 與腸球菌、腸桿菌呈負(fù)相關(guān)，與擬桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌呈正相關(guān)（P ＜0.05），推測(cè)腸道菌群紊亂可誘導(dǎo)Th17/Treg 免疫失衡，調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)參與UC 發(fā)生和發(fā)展。但目前尚不明確腸道菌群紊亂影響Th17/Treg 免疫失衡的機(jī)制，可能與以下幾點(diǎn)有關(guān)。①腸道菌群可能通過(guò)基因直接影響能量代謝、分化方向等相關(guān)物理功能，影響Th17/Treg 平衡：如腸道菌群能作用于胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素等受體，調(diào)控初始CD4+T 淋巴細(xì)胞向Th17 細(xì)胞或者Treg 細(xì)胞分化[23-24]。②腸道菌群可能通過(guò)能量代謝途徑影響Th17/Treg 平衡：如共生菌產(chǎn)生的三磷酸腺苷酶可直接激動(dòng)小腸固有層CD11、CD70 細(xì)胞，促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞向Th17 細(xì)胞分化，影響Th17/Treg 平衡，也可通過(guò)抑制1 型調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞生成，破壞免疫耐受，增加Th17 細(xì)胞數(shù)目[25]。乳酸菌可上調(diào)碳水化合物代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因，當(dāng)碳水化合物利用增加時(shí)，可增加參與葡萄糖和脂質(zhì)代謝的短鏈脂肪酸含量，通過(guò)游離脂肪酸受體2 和3 通路增強(qiáng)免疫耐受，抑制免疫炎癥反應(yīng)[26]。③腸道菌群可能通過(guò)細(xì)胞因子途徑影響Th17/Treg平衡：如分節(jié)絲狀菌能通過(guò)腸上皮細(xì)胞中樹(shù)突細(xì)胞抗原和淀粉樣蛋白A 促進(jìn)CD4+T 淋巴細(xì)胞向Th17 細(xì)胞分化；同時(shí)樹(shù)突細(xì)胞可分泌IL-22，通過(guò)先天淋巴細(xì)胞通道增加IL-6、IL-22 分泌，增加淀粉樣蛋白A表達(dá)，促進(jìn)向Th17 細(xì)胞分化[27-28]。

綜上所述，腸道菌群紊亂可能通過(guò)各種機(jī)制影響Th17/Treg 免疫平衡，調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)分泌，參與UC 發(fā)生和發(fā)展。但本研究樣本量少，還需大樣本前瞻性研究證實(shí)。