基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術探討參附湯治療心肌梗死的活性成分及靶點

劉甜甜 姚魁武

1.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院心血管科，北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院藥劑科，北京 100078

心肌梗死是臨床常見疾病，近年來發(fā)病率逐年升 高，并趨于年輕化?，F(xiàn)代治療心肌梗死的方法除藥物治療、介入治療、心臟輔助裝置和心臟移植外，中醫(yī)藥療法因在預防介入術后再狹窄、防治再灌注后無復流、改善患者臨床癥狀、提高生活質(zhì)量、增加活動耐量和改善患者遠期預后等優(yōu)勢，已逐漸成為臨床治療心肌梗死的重要手段。中醫(yī)認為心肌梗死屬“胸痹”“心痛”“心悸”等病證范疇，指出心肌梗死的基本病機是陽微陰弦、心陽不振、瘀血滯脈。參附湯源自《圣濟總錄》卷五十九，該方主要由人參、附子組成，具有回陽益氣、救脫之功效。臨床常用其單方或合方防治心力衰竭，心絞痛和阿霉素導致的心臟毒性等[1-5]。關于參附湯治療心肌梗死的作用機制還未見報道，本研究旨在應用網(wǎng)絡藥理學及分子對接構建參附湯治療心肌梗死的“藥物-活性成分-靶點-通路”關聯(lián)網(wǎng)絡和關鍵成分-核心靶點的結合位點，從中醫(yī)整體觀探索參附湯治療心肌梗死的作用機制。

1 資料與方法

1.1 篩選參附湯活性成分及靶點

采用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）依次搜索參附湯中人參、附子的活性成分，設置篩選參數(shù)為口服生物利用度（OB）＞30%且類藥性（DL）＞0.18，選出參附湯活性成分[6]。采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲得人參、附子活性成分的靶點蛋白，采用Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）和String 平 臺（https：//string-db.org/cgi/input.pl）將蛋白名轉(zhuǎn)為基因名。

1.2 繪制“活性成分-靶點”網(wǎng)絡

采用Cytoscape 3.7.2 軟件繪制“活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖，使用網(wǎng)絡拓撲結構分析，計算出自由度（degree），挑選主要活性成分[7]。

1.3 篩選心肌梗死靶點

GeneCards 是人類基因信息收錄最全面的數(shù)據(jù)庫，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）中輸入關鍵詞“myocardial infarction”，檢索心肌梗死靶基因[8]。

1.4 構建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡

取活性成分和疾病的相交靶點基因，錄入String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl），物種設為“Homo sapiens”，獲取基因-基因相互作用網(wǎng)絡數(shù)據(jù)[9]，將數(shù)據(jù)以TSV.格式導入Cytoscape 3.7.2 軟件，構建PPI 網(wǎng)絡，基于網(wǎng)絡拓撲參數(shù)獲得degree 值較高的核心靶點。

1.5 分析靶點基因本體（GO）功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路

應用David 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp）進行相交靶基因的生物過程、分子功能和KEGG通路富集分析[10]。依據(jù)P ＜0.05 和錯誤發(fā)現(xiàn)率Benjamini ＜0.05，選出差異顯著的生物過程和信號通路。采用Cytoscape 軟件繪制“藥物-活性成分-關鍵靶點-信號通路”網(wǎng)絡。

1.6 分子對接

將“活性成分-靶點”網(wǎng)絡中degree 值最高的4 個活性成分與PPI 網(wǎng)絡中degree 值最高的7個核心蛋白進行分子對接。通過PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）獲得活性成分3D 結構，通過PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org）獲取蛋白質(zhì)結構。使用DockThor 平臺（https：//dockthor.lncc.br/v2/）進行預處理和分子對接[11]，通過Pymol 軟件進行對接結果可視化。

2 結果

2.1 參附湯的活性成分和靶點

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索到人參活性成分22 個，附子活性成分21 個，刪除重復項之后的作用靶點120 個。其中，17 個人參活性成分和6 個附子活性成分具有作用靶點。

2.2 活性成分-靶點網(wǎng)絡

通過Cytoscape 軟件構建“活性成分-靶點”網(wǎng)絡，網(wǎng)絡拓撲分析得出142 個節(jié)點，286 條邊，平均degree值為4，圖中degree 值越大，顏色越深，見圖1。degree大于均值的化合物有13 個，見表1。

表1 degree 值較大的活性成分

圖1 活性成分-靶點網(wǎng)絡

2.3 參附湯活性成分治療心肌梗死的靶點

以心肌梗死為關鍵詞，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫搜索疾病靶點，共檢索到3651 個靶點，依據(jù)相關性得分≥1，得到心肌梗死靶基因2495 個。對活性成分和疾病靶點取交集，獲得78 個相交靶點，見圖2。

圖2 化合物-疾病韋恩圖

2.4 參附湯治療心肌梗死的靶點PPI 網(wǎng)絡分析

將78 個相交靶點，錄入String 數(shù)據(jù)庫，獲得PPI網(wǎng)絡及互作數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)導入Cytoscape 軟件進行拓撲參數(shù)分析，得到69 個節(jié)點，280 條邊，平均介數(shù)為0.039 79，平均接近中心性為0.406，平均最短路徑長度為2.633，平均degree 值為8，其中degree 值≥9 的靶點有AKT1、MAPK8、TNF、JUN、STAT3、IL-1β、RELA、PTGS2、STAT1、HSP90AA1、CASP3、PPARG、CASP8、NOS2、ICAM1、IFNG、RXRA、NR3C1、NFKBIA、AR、ESR1、HMOX1、BCL2、VCAM1、TGFB1、PRKCA。對上述26 個靶點進行子網(wǎng)絡提取，獲得核心靶點的PPI 網(wǎng)絡，圈越大表示degree 值越大，說明參與的生物功能越多，在網(wǎng)絡中的重要性越強，見圖3。

圖3 參附湯治療心肌梗死的靶點PPI 網(wǎng)絡圖

2.5 參附湯治療心肌梗死的靶點功能和通路富集分析

把78 個靶點導入David 數(shù)據(jù)庫，根據(jù)P ＜0.05和錯誤發(fā)現(xiàn)率Benjamini＜0.05，選出102 個生物過程、26 個分子功能、15 個細胞組分。生物過程主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導、細胞增殖的正調(diào)控、凋亡過程、缺氧反應、炎癥反應等。分子功能涉及蛋白質(zhì)結合、蛋白質(zhì)同源二聚活性、酶結合、轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白質(zhì)異構化活性、轉(zhuǎn)錄因子結合等。細胞組分涉及質(zhì)膜、胞漿、細胞外間隙、核染色質(zhì)等。選出基因條目數(shù)排名前12 的生物過程、分子功能、細胞組分繪制條形圖，見圖4。

圖4 參附湯治療心肌梗死的靶點GO 功能分析

采用David 數(shù)據(jù)庫對78 個靶點進行KEGG 通路富集分析，得到102 個條目，依據(jù)P ＜0.05 和錯誤發(fā)現(xiàn)率Benjamini＜0.05，去掉共性通路后，得到差異顯著的22 個信號通路，見表2。使用Cytoscape 軟件繪制“藥物-活性成分-關鍵靶點-信號通路”網(wǎng)絡，見圖5，方形表示藥物，菱形表示活性成分，圓形表示關鍵靶點，角形表示信號通路，結果顯示參附湯主要通過2 味中藥的22 個活性成分，作用于78 個靶點的22 條信號通路治療心肌梗死。

圖5 藥物-活性成分-關鍵靶點-信號通路網(wǎng)絡

表2 參附湯治療心肌梗死的靶點通路

2.6 參附湯治療心肌梗死的活性成分分子對接結果

采用DockThor 軟件將“活性成分-靶點”網(wǎng)絡degree 較高的4 個活性成分與PPI 網(wǎng)絡中degree 較高的7 個核心蛋白進行分子對接，對接結合能見表3。將結果導入Pymol 軟件進行可視化，得到分子對接三維圖。分子對接結果顯示，山奈酚與AKT1 中氨基酸殘基ASP240、ASP258 形成氫鍵，與TNF 中殘基LEU90、ILE89、PRO88、GLU141、ASP139 形成氫鍵，與MAPK8 中殘基ASP161、GLU101、MET103 形成氫鍵；β-谷甾醇與AKT1 中殘基ALA54 形成氫鍵，與TNF中殘基ASN21 形成氫鍵，與MAPK8 中殘基MET103形成氫鍵；豆甾醇與AKT1 中殘基ALA54 形成氫鍵，與TNF 中殘基SER43、LYS42 形成氫鍵，與MAPK8中殘基MET103、GLU101 形成氫鍵，見圖6。

圖6 部分蛋白和活性成分的分子對接結果

表3 關鍵活性成分與核心蛋白結合能（kcal/mol）

3 討論

參附湯主要由人參、附子組成，該方藥少而力專，人參大補元氣、復脈固脫，附子回陽救逆、散寒止痛。全方合奏益氣、溫陽、固脫、止痛之功。藥理研究證實，參附湯具有抗氧化應激、增加冠脈血流、改善血液流變學、保護心功能的作用，臨床常用于心肌梗死、心肌重塑、慢性心力衰竭、心律失常等治療[12-16]。目前發(fā)現(xiàn)參附湯可能還有防治新型冠狀病毒肺炎的功效[17-18]。本研究結果顯示，參附湯的活性成分山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、弗羅汀酮、人參皂苷等可能主要作用于核心靶點上的炎癥免疫、細胞凋亡、血管新生、氧化應激等介導心肌梗死的治療。

通過網(wǎng)絡藥理學對參附湯治療心肌梗死的作用機制進行系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)人參、附子有22 個生物活性成分，其中degree 值較大的山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、弗羅汀酮、人參皂苷rh2、吉九里香堿、阿樸天仙子堿等可能是參附湯發(fā)揮療效的基礎。研究證實，人參中黃酮醇類化合物、人參皂苷具有保護血管內(nèi)皮、提高免疫功能、改善心肌缺血、抑制細胞凋亡的作用[19-22]。附子中生物堿類物質(zhì)具有強心、降壓、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗血栓、保護心肌等功效[23-25]。據(jù)此推測參附湯可能基于上述成分發(fā)揮治療作用。

GO 功能分析顯示，參附湯主要通過調(diào)控細胞增殖、凋亡過程、一氧化氮生物合成、缺氧和炎癥反應等方面參與心肌梗死治療。KEGG 通路富集分析表明，TNF、NF-κB、MAPK、mTOR、PI3K-Akt、VEGF、細胞凋亡等信號通路是參附湯治療心肌梗死的主要作用機制，并且參附湯通過以上通路發(fā)揮抗炎、抗氧化、抑制細胞凋亡和促進血管新生作用。分子對接結果顯示，參附湯中的主要活性成分山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、弗羅汀酮A 與核心靶點AKT1、TNF、MAPK8、STAT3、JUN、IL-1β、RELA 表現(xiàn)出較好的結合能力，說明活性化合物與核心靶點存在相互作用，且可以形成結合能低、活性高、結構穩(wěn)定的構象[26]。綜上說明參附湯可能通過與核心靶蛋白互作，激活或阻斷多條信號通路發(fā)揮減輕炎癥反應、抑制心肌凋亡、促進血管再生的作用。

本研究采用網(wǎng)絡藥理學和分子對接方法探討參附湯的活性成分及作用靶點，結果顯示，參附湯中黃酮醇類和生物堿類化合物通過作用于78 個核心靶點上的22 條通路協(xié)同抗心肌梗死。由于中藥復方存在多成分、多靶點及有效成分與靶點相互作用不清等問題。因此，后續(xù)還要通過臨床和基礎實驗進一步驗證，深入探索參附湯治療心肌梗死的作用機制。