西瓦克顆粒指紋圖譜及抗氧化活性研究

陳 麗 劉 柳 馬慶苓 希爾艾力·吐爾遜 吳 濤 信學(xué)雷 阿吉艾克拜爾·艾薩

1.中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所干旱區(qū)植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830011；2.中國科學(xué)院大學(xué)研究生院，北京 100049；3.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所維吾爾醫(yī)方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830049

西瓦克方劑由一枝蒿、茵陳、毛菊苣、玫瑰花、大黃和甘草六味藥材組成，傳統(tǒng)采取全方水提制成口服制劑，在新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院主要用于治療肝損傷，具有顯著的保肝護(hù)肝功效，但其質(zhì)控方面尚未完善。中藥指紋圖譜能夠全面反映復(fù)方所含的復(fù)雜化學(xué)成分，且已在中藥質(zhì)量控制研究中得到了廣泛的應(yīng)用，是評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量非常重要的手段之一[1-9]。本課題組前期已對(duì)西瓦克顆粒物質(zhì)作用基礎(chǔ)及小鼠肝損傷保肝作用進(jìn)行了初步的研究[10]，本實(shí)驗(yàn)建立了西瓦克顆粒指紋圖譜及含量測定方法[11-21]，并測定了10 批西瓦克顆粒中5 個(gè)成分的含量。同時(shí)采用薄層色譜-生物自顯影的方法對(duì)西瓦克顆粒體外抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 高效液相色譜儀（美國）；Sartorius BT 25S型十萬分之一電子天平（賽多利斯）；SK7210LHC 型超聲清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；高效薄層色譜儀（HPLC，瑞士CAMAG）；薄層色譜掃描儀（瑞士CAMAG，型號(hào)：TLC Scanner3 System）。

1.2 藥品與試劑

10 批次西瓦克顆粒（自制），批號(hào)分別為S1：20161206，S2：20161208，S3：20170105，S4：20161213，S5：20170109，S6：20161216，S7：20161219，S8：20161220，S9：20161222，S10：20170112。一枝蒿酮酸（中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所提供，批號(hào)：GSB11-2530-2016）；沒食子酸（批號(hào)：110831-201604）、3，5-O-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)：111782-201706）、4，5-O-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)：111894-201602）、異槲皮苷（批號(hào)：111809-201403）對(duì)照品均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）（德國慕尼黑），2，2’-氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）（Sigma），甲醇、乙腈均為色譜純，重蒸水（自制）。高效薄層色譜正相硅膠玻璃板GF254（20 cm×10 cm，Merck，Darmstadt，德國）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

InertSustain C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫0～10 min，4%～7%A；10～30 min，7%～8%A；30～35 min，8%～10%A；35～65 min，10%～13%A；65～80 min，13%～16%A；80～100 min，16%～28%A。檢測波長：0～＜39 min：320 nm，39～＜63 min：300 nm，63～＜67 min：360 nm，67.0～＜70.5 min：350 nm，70.5～＜73.5 min：245 nm，73.5～＜100.0 min：260 nm，流速1.0 mL/min；柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL，理論塔板數(shù)按各色譜峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.2 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱取5 個(gè)特征化合物對(duì)照品適量，置棕色量瓶中，加50%甲醇溶液分別制成每1 mL 含沒食子酸86.10 μg、3，5-O-二咖啡酰奎寧酸9.25 μg、異槲皮苷20.21 μg、4，5-O-二咖啡?？鼘幩?2.08 μg、一枝蒿酮酸25.67 μg 的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取西瓦克顆粒約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，取出，冷卻至室溫，再稱定重量，用相應(yīng)溶劑補(bǔ)足減少的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 西瓦克顆粒指紋圖譜的建立

將10 批西瓦克顆粒HPLC 圖譜導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A 版）”進(jìn)行分析，以S1 為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗為0.1 min，采用多點(diǎn)校正后，自動(dòng)進(jìn)行色譜峰匹配，以中位數(shù)法生成指紋圖譜（圖1）。經(jīng)處理后共標(biāo)定36 個(gè)共有峰，通過與對(duì)照品的比較對(duì)照，指認(rèn)了其中5 個(gè)特征峰，分別是沒食子酸、3,5-O-二咖啡?？鼘幩?、異槲皮苷、4,5-O-二咖啡?？鼘幩?、一枝蒿酮酸（圖2）。結(jié)果表明，10 批西瓦克顆粒色譜圖相似度均≥0.811（表1）。表明制備工藝穩(wěn)定，方法準(zhǔn)確可靠。

表1 10 批西瓦克顆粒相似度

圖1 10 批西瓦克顆粒指紋圖譜

圖2 混合對(duì)照品與西瓦克顆粒高效液相色譜分析圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性范圍考察 精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2.0、4.0、8.0、10.0、12.0、16.0、20.0 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以沒食子酸、3，5-O-二咖啡酰奎寧酸、異槲皮苷、4，5-O-二咖啡?？鼘幩?、一枝蒿酮酸的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各成分回歸方程見表2。

表2 西瓦克顆粒中5 種化合物回歸方程與線性范圍

2.5.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取適量濃度的對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測得沒食子酸、3，5-O-二咖啡酰奎寧酸、異槲皮苷、4，5-O-二咖啡?？鼘幩?、一枝蒿酮酸的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）分別為0.85%、0.59%、2.09%、1.39%、0.47%，均＜3%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品（S4，批號(hào)：20161213），按“2.3”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液。于制備后0、2、4、6、8、10、12 h 分別進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，測得沒食子酸、3，5-O-二咖啡?？鼘幩帷愰纹ぼ?、4，5-O-二咖啡?？鼘幩?、一枝蒿酮酸峰面積的RSD分別為0.52%、0.76%、2.02%、2.20%、0.43%，均＜3%，表明供試品溶液放置12 h 穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品（S4，批號(hào)為20161213），按“2.3”項(xiàng)下的方法，制備6 份供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下測定，測得沒食子酸、3，5-O-二咖啡?？鼘幩?、異槲皮苷、4，5-O-二咖啡酰奎寧酸、一枝蒿酮酸峰含量的RSD 分別為1.24%、2.43%、2.07%、2.42%、2.18%，均＜3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率 取已知含量的供試品0.350 g（其中沒食子酸、3,5-O-二咖啡?？鼘幩?、異槲皮苷、4，5-O-二咖啡?？鼘幩帷⒁恢锿岬暮糠謩e為1.59、0.21、0.28、0.20、0.43 mg/g），精密稱定，共9 份于10 mL容量瓶中，按照供試品中5 個(gè)化合物的含量與各自對(duì)照品溶液1∶1 的量分別加入混合對(duì)照品，加入50%甲醇適量，超聲處理（250 W，頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，定容至刻度，按上述方法測定5 個(gè)化合物的加樣回收率。見表3～7。

表3 沒食子酸回收率

表4 3，5-O-二咖啡?？鼘幩峄厥章?/p>

表5 異槲皮苷回收率

表6 4，5-O-二咖啡?？鼘幩峄厥章?/p>

表7 一枝蒿酮酸回收率

2.6 10 批西瓦克顆粒5 個(gè)特征成分的含量測定

取10 批西瓦克顆粒，照“2.3”項(xiàng)下方法，依法制備，按上述擬定的含測方法測定5 個(gè)化合物含量，平行操作2 次，取平均值，結(jié)果見表8。

表8 10 批西瓦克顆粒中5 個(gè)特征化合物的含量（mg/g）

2.7 薄層色譜指紋圖譜

分別取10 批西瓦克顆粒1.5 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。取秦皮乙素，同法制成每1 mL 含0.2 mg 的對(duì)照品溶液。以乙酸乙酯-甲酸-乙酸-水（12∶1∶1∶1）為展開劑，展開后置紫外燈下檢視。通過對(duì)薄層板斑點(diǎn)位置、顏色的比對(duì)，表明供試品質(zhì)量均一、穩(wěn)定，由此建立了供試品薄層色譜指紋圖譜的方法。見圖3（封三）。

圖3 西瓦克顆粒和秦皮乙素薄層色譜圖

2.8 薄層生物自顯影法檢測西瓦克顆粒體外抗氧化活性

薄層生物自顯影法可以準(zhǔn)確、快速、直觀地判斷中藥復(fù)方制劑清除自由基的能力[22-24]。當(dāng)ABTS 和DPPH 與抗氧化活性成分結(jié)合后，會(huì)形成白色和黃色斑點(diǎn)[25-26]。供試品與自由基反應(yīng)后，色譜條帶多數(shù)部位分別呈現(xiàn)出白色和亮黃色，說明西瓦克顆粒含有具備清除自由基的成分，具備一定抗氧化活性。見圖4（封三）。

圖4 西瓦克顆粒和秦皮乙素薄層色譜圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用50%甲醇制備供試品溶液，以0.2%磷酸：乙腈系統(tǒng)為流動(dòng)相，并根據(jù)HPLC 色譜圖中不同類型化合物的保留時(shí)間及吸收波長的特點(diǎn)，采用分時(shí)段波長檢測，同時(shí)測定黃酮、多酚和倍半萜等不同類型的化合物。

由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，10 批西瓦克顆粒指紋圖譜相似度均≥0.811，提示西瓦克顆粒制備工藝穩(wěn)定性、重現(xiàn)性良好，可批量生產(chǎn)。通過與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)了5 個(gè)特征化合物，分別為沒食子酸、3，5-O-二咖啡?？鼘幩帷愰纹ぼ?、4，5-O-二咖啡?？鼘幩帷⒁恢锿?。并能在同一色譜條件下，同時(shí)測定10 批西瓦克顆粒中5 個(gè)特征化合物的含量，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

通過西瓦克顆粒與ABTS、DPPH 的反應(yīng)表明其具有良好的清除自由基和抗氧化活性的作用[27-28]。

綜上所述，本研究所建立的指紋圖譜可用于西瓦克顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)，含量測定方法操作簡便，可同時(shí)測定5 種特征成分的含量，與抗氧化活性相關(guān)的有效成分及其保肝作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的探索和研究。