降鈣素受體基因多態(tài)性與昆明地區(qū)2型糖尿病伴骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性

李博一，牛 玲，馬 蓉，張 嫻，劉 方，唐 艷，苗翠娟，韓竺君，張 程

（昆明市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，云南 昆明 650011）

隨著人們生活水平的提高和壽命的延長(zhǎng)，2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus）和骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率逐年上升，據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（international diabetes federation，IDF）預(yù)計(jì)2030年T2DM發(fā)病率將翻倍，而中國(guó)T2DM將達(dá)到4 230萬(wàn)人，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率也已躍居各種常見(jiàn)病的第7位，已成為全球主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。在眾多的發(fā)病因素中，遺傳是T2DM和骨質(zhì)疏松癥主要的發(fā)病原因，有研究認(rèn)為，糖尿病性骨質(zhì)疏松是一種多基因遺傳病，這些基因[2]包括降鈣素受體（calcitonin receptor，CTR）基因，維生素D受體基因及護(hù)骨素基因等。對(duì)CTR基因型多態(tài)性與骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性，國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果尚不一致。CTR基因型與T2DM伴骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系研究較少。本研究旨在探討CTR基因多態(tài)性與昆明地區(qū)T2DM伴骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性，持續(xù)為昆明地區(qū)T2DM伴骨質(zhì)疏松癥防治提供理論依據(jù)，并早期防治糖尿病性骨質(zhì)疏松，提高糖尿病患者的生活質(zhì)量。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年6月至2019年1月在昆明市第一人民醫(yī)院甘美醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的2型糖尿病患者237例。糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考2013年版《中國(guó)2型糖尿病防治指南》[3]；骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考2011年版《原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診治指南》[4]。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）T2DM；（2）昆明地區(qū)居住時(shí)間大于10 a。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）1型糖尿?。唬?）各種糖尿病急性并發(fā)癥、感染、營(yíng)養(yǎng)不良及嚴(yán)重的心肝腎臟疾病及腫瘤患者；（3）甲狀腺手術(shù)史，合并其他可能引起甲狀腺激素代謝異常的其他內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)疾病、結(jié)締組織病者，如垂體瘤、垂體功能減退者，亞急性甲狀腺炎等；（4）皮膚疾病無(wú)法接受陽(yáng)光照射者；（5）存在風(fēng)濕或類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，且應(yīng)用激素類(lèi)藥物時(shí)間超過(guò)6個(gè)月，或曾經(jīng)接受活性維生素D、降鈣素、雌激素受體調(diào)節(jié)劑等影響骨代謝的藥物治療者；（6）存在畸形性骨關(guān)節(jié)炎者和成骨不全患者。按骨密度檢測(cè)結(jié)果分組為糖尿病無(wú)骨質(zhì)疏松癥（A組）61例，占25.7%；糖尿病合并骨量減少組（B組）111例，占46.8%；糖尿病伴骨質(zhì)疏松組（C組）65例，占27.4%。男性122例，女性115例，年齡50～84歲，平均年齡（64.68±7.92）歲。納入研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，且本研究經(jīng)昆明市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 一般指標(biāo)測(cè)試當(dāng)日由專(zhuān)人用固定體重身高測(cè)量?jī)x測(cè)定：體重、身高、計(jì)算BMI，記錄年齡、性別、糖尿病的病程。

1.2.2 血壓測(cè)定采用汞柱式標(biāo)準(zhǔn)袖帶血壓表，休息5 min 后測(cè)定坐位右上臂收縮壓（SBP）/舒張壓（DBP），單位mmHg，（1 mmHg=0.133 kPa）。

1.2.3 其他生化指標(biāo)測(cè)定受試者隔夜禁食8～12 h，清晨取靜脈血測(cè)FPG、HbA1c、肝腎功能電解質(zhì)（血鈣）、血脂、UA、維生素D濃度、雌激素水平、睪酮水平，Hs-CRP、FIB。按標(biāo)準(zhǔn)方法行OGTT試驗(yàn)，檢測(cè)OGTT-0 h、2 h血糖，采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定0 h、2 h INS水平，并計(jì)算HOMA-IR。

1.2.4 外周血基因組DNA提取空腹采集靜脈血6～8 mL，EDTA抗凝，-80 ℃保存，標(biāo)本收集結(jié)束后購(gòu)進(jìn)DNA提取試劑盒統(tǒng)一提取CTR基因。具體所需試劑及儀器見(jiàn)表1。

1.2.5 PCR擴(kuò)增（1）擴(kuò)增所使用的引物：上游引物5′-CTCAGTGATCACGATACTGTG-3′；下游引物5′-TTCAGT GGAACCAGCGTTGG-3′；（2）PCR反應(yīng)體系：共25 μL，包括2XTaq PCR Master Mix 12.5 μL，PCR Forward Primer（10 μM，碩擎）1 μL，PCR Reverse Primer（10 μM，碩擎）1 μL，Template DNA 4 μL，Nuclease-freeWater 8.5 μL；（3）PCR反應(yīng)條件：共35個(gè)循環(huán)，95 ℃預(yù)變性5 min，然后95 ℃變性30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸60 s，反應(yīng)完成后，72 ℃再延伸10 min。

1.2.6 酶切鑒定基因型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用AluⅠ內(nèi)切酶酶切后，置于2%瓊脂糖凝膠電泳紫外燈下觀察基因型。

1.2.7 骨密度測(cè)量采用通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)（中國(guó)）有限公司生產(chǎn)的雙能x線(xiàn)骨密度儀（型號(hào)DPX Bravo）測(cè)量腰椎L1-L4，股骨頸及髖部骨密度（BMD），單位g/cm2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究的所有數(shù)據(jù)均使用SPSS11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。采用Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)基因型的分布是否具有代表性。正態(tài)分布計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，3個(gè)獨(dú)立樣本比較，采用方差分析，組間比較用最小有意義差異法（LSD檢驗(yàn)）。2個(gè)獨(dú)立樣本比較，采用t檢驗(yàn)。非正態(tài)分布計(jì)量資料用M（P25，P75）表示，采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用多因素Logistic回歸分析篩選獨(dú)立危險(xiǎn)因素，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組人群一般資料比較

結(jié)果顯示：3組患者年齡、身高、體重、BMI比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 研究對(duì)象的一般資料比較[（），M（P25，P75）]Tab.2 Comparison of general data of study subjects [（），M（P25，P75）]

表2 研究對(duì)象的一般資料比較[（），M（P25，P75）]Tab.2 Comparison of general data of study subjects [（），M（P25，P75）]

總體比較：*P＜0.05；兩兩比較：與A組比較，#P＜0.05；與B組比較，&P＜0.05。

2.2 CTR基因型和等位基因頻率的分布

2.2.1 CTR基因型酶切電泳圖CTR基因AluI酶切位點(diǎn)多態(tài)性確定為：CC 型228 bp；CT 型228 bp和120 bp；TT 型120 bp，見(jiàn)圖1。

圖1 CTR基因型酶切電泳圖Fig.1 CTR genotype digestion electrophoresis diagram

2.2.2 CTR基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，說(shuō)明所選人群代表性好。在237例人群中，CTR基因型分布情況為：CC型181例（76.4%），CT型56例，（23.6%），TT型未檢出。提示昆明地區(qū)2型糖尿病患者中，CTR基因型以CC型為主，未見(jiàn)TT型。在65例糖尿病合并骨質(zhì)疏松組中CTR基因型分布情況為：CC型49例（75.4%），CT型16例（24.6%），TT型未檢出。提示昆明地區(qū)2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松中，CTR基因型仍以CC型為主，未見(jiàn)TT型。

2.2.3 3組人群CTR基因型分布頻率比較結(jié)果顯示：TT基因型在人群中均未檢出，CTR基因型CC、CT無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 CTR基因型分布頻率比較[n（%）]Tab.3 Comparison of CTR genotypes distribution frequency [n（%）]

2.2.4 3組人群CTR等位基因分布比較結(jié)果顯示：等位基因C、T的分布頻率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表4 CTR等位基因分布頻率Tab.4 CTR allele frequency distribution

2.2.5 CTR基因多態(tài)性與T2DM患者BMD的關(guān)系結(jié)果顯示：237例T2DM患者中，CTR不同基因型在各部位的BMD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表5。

表5 CTR基因多態(tài)性與T2DM患者BMD的關(guān)系[（g/cm2），（）]Tab.5 The relationship between the CTR gene polymorphism and BMD of T2DM patients [（g/cm2），（）]

表5 CTR基因多態(tài)性與T2DM患者BMD的關(guān)系[（g/cm2），（）]Tab.5 The relationship between the CTR gene polymorphism and BMD of T2DM patients [（g/cm2），（）]

2.2.6 CTR基因多態(tài)性與T2DM伴骨質(zhì)疏松癥患者BMD的關(guān)系結(jié)果顯示：65例T2DM伴骨質(zhì)疏松癥患者中，CTR不同基因型在各部位BMD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表6。

表6 CTR基因多態(tài)性與T2DM伴骨質(zhì)疏松癥患者BMD的關(guān)系[（g/cm2），（）]Tab.6 The relationship between the CTR gene polymorphism and BMD of T2DM patients with osteoporosis [（g/cm2），（）]

表6 CTR基因多態(tài)性與T2DM伴骨質(zhì)疏松癥患者BMD的關(guān)系[（g/cm2），（）]Tab.6 The relationship between the CTR gene polymorphism and BMD of T2DM patients with osteoporosis [（g/cm2），（）]

2.2.7 T2DM伴骨質(zhì)疏松患者多因素Logistic回歸分析結(jié)果將CTR基因型（1為CC型，2為CT型）及單因素分析3組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的變量，即性別（0為女，1為男）、年齡、舒張壓、身高、體重、BMI、HDL-C、雌激素、睪酮作為因變量，糖尿病有無(wú)骨質(zhì)疏松（0為無(wú)，1為有）作為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，以篩選糖尿病伴骨質(zhì)疏松的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)果顯示：年齡（OR1.112、95%CI：1.034～1.196、P=0.004）可以進(jìn)入回歸方程，見(jiàn)表7。

表7 Logistic回歸分析結(jié)果Tab.7 Logistic analysis results

參考類(lèi)別說(shuō)明：“CTR基因型”中的CC型，“性別”以女性，“糖尿病有無(wú)骨質(zhì)疏松”以糖尿病無(wú)骨質(zhì)疏松作為參考類(lèi)別。

3 討論

T2DM是一種嚴(yán)重的高風(fēng)險(xiǎn)疾病，除血糖升高外，心、腦、眼、腎、神經(jīng)等全身并發(fā)癥是T2DM致死、致殘、致盲的主要原因。有研究表明，與糖尿病有關(guān)的并發(fā)癥中如喪失的視力均可增加骨折風(fēng)險(xiǎn)[5]。

T2DM伴骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，近年來(lái)各國(guó)學(xué)者對(duì)T2DM與骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性研究日益增多，目前認(rèn)為發(fā)病機(jī)制除了與年齡、性別、體重、營(yíng)養(yǎng)、生活方式有關(guān)外，環(huán)境和遺傳因素亦起著重要作用。對(duì)CTR基因多態(tài)性的研究在國(guó)際上已經(jīng)引起了重視，CTR基因多態(tài)性與骨質(zhì)疏松的相關(guān)性已有大量報(bào)道，而CTR基因多態(tài)性與T2DM并骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性研究在國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。

本研究中的一般臨床資料顯示：從T2DM無(wú)骨質(zhì)疏松癥組到T2DM合并骨量減少組再到T2DM伴骨質(zhì)疏松組年齡呈逐漸增加趨勢(shì)，且不論是總體比較還是兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明隨著年齡的增長(zhǎng)，T2DM患者患骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)增加，且Logstic回歸分析顯示：年齡是昆明地區(qū)T2DM伴骨質(zhì)疏松癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，說(shuō)明昆明地區(qū)T2DM伴骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病與年齡相關(guān)。BMI無(wú)論3組比較還是兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示伴隨BMI降低，昆明地區(qū)T2DM患骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)增加。高BMI一度被認(rèn)為是T2DM骨密度的保護(hù)性因素[6]。原因可能是：（1）BMI較高，在重力作用下骨骼機(jī)械負(fù)荷增加，有助于維持骨量[7]；（2）脂肪組織較為發(fā)達(dá)，使雄激素向雌激素轉(zhuǎn)換，骨吸收作用減少[8]；（3）脂肪細(xì)胞分泌脂聯(lián)素、瘦素等脂肪因子，脂聯(lián)素可以促進(jìn)骨形成，瘦素下調(diào)RANKL活性，抑制破骨細(xì)胞分化及骨吸收，同時(shí)瘦素還能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和活性[6]。所以適當(dāng)增加體重對(duì)防治T2DM并發(fā)骨質(zhì)疏松有積極的意義。

CTR不同等位基因的檢出率在不同種族和地域存在差異。本研究發(fā)現(xiàn)昆明地區(qū)T2DMCTR基因型分布頻率為：CC型76.4%、CT型23.6%，TT型未檢出；T2DM伴骨質(zhì)疏松CTR基因型分布頻率為：CC型75.4%，CT型24.6%，TT型未檢出。這與北京[9]、廣州[10]研究結(jié)果相近似，與臺(tái)灣[11]、日本地區(qū)[12]的研究結(jié)果亦相似。Masi等[13]對(duì)意大利、Bandres等研究結(jié)果顯示CTR基因多態(tài)性基因型的分布頻率與高加索人群非常接近（從高到低依次是CT、TT、CC），與亞洲人不同。

本研究中，A組CTR基因型分布頻率分別為CC型80.3%、CT型19.7%、TT型 0%、B組CTR基因型分布頻率分別為CC型74.8%、CT型25.2%、TT型0%、C 組CTR基因型分布頻率分別為CC型75.4%、CT型24.6%、TT型0%，3組基因型分布頻率比較，CTR3種基因型CC、CT、TT的分布頻率及等位基因分布頻率差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這種多態(tài)性分布表明種族、飲食、生活習(xí)慣對(duì)遺傳因素的影響可能與同一種族產(chǎn)生相同的基因頻率有關(guān)，而與伴隨疾病T2DM及T2DM合并骨質(zhì)疏松癥可能無(wú)關(guān)。

筆者將CTR基因型及單因素分析3組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的變量作為因變量，糖尿病合并骨質(zhì)疏松作為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，以篩選糖尿病合并骨質(zhì)疏松的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，本研究顯示年齡是昆明地區(qū)T2DM伴骨質(zhì)疏松癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，CTR基因型未進(jìn)入回歸方程，說(shuō)明CTR基因型未增加T2DM人群患骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)，CTR基因型與昆明地區(qū)T2DM及 T2DM伴骨質(zhì)疏松癥遺傳易感性不相關(guān)。同時(shí)比較T2DM患者CTR基因型中不同部位的骨密度，結(jié)果顯示CTR不同基因型在各部位的骨密度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CTR基因型可能不是T2DM患者BMD改變的易感基因，這與楊軍等[7]研究相符。而對(duì)于糖尿病伴骨質(zhì)疏松的患者，筆者也比較了CTR基因型在不同部位的骨密度，結(jié)果顯示CTR不同基因型在各部位的骨密度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明T2DM和骨質(zhì)疏松癥受多個(gè)基因調(diào)控，多個(gè)易感基因組合構(gòu)成了該病的遺傳易感性，每個(gè)單一基因在遺傳易感性中所起的決定作用不同，因此導(dǎo)致了CTR 基因多態(tài)性與T2DM和T2DM合并骨質(zhì)疏松癥患者BMD相關(guān)性的不同。

總之，T2DM和骨質(zhì)疏松癥均是多因素疾病，相關(guān)的候選基因有很多，單一基因的作用是有限的，CTR基因的多態(tài)性是其核苷酸序列1 377處的C突變?yōu)門(mén)，它的突變可能是影響其與其配體的結(jié)合和改變受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)從而調(diào)節(jié)疾病發(fā)生發(fā)展，具體病理生理機(jī)制還不太清楚。CTR基因多態(tài)性與T2DM伴骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性研究一方面有助于從分子水平解釋T2DM伴骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的遺傳學(xué)機(jī)制，另一方面亦可以應(yīng)用于評(píng)估T2DM骨折的危險(xiǎn)性。因此，T2DM伴骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)基因研究應(yīng)更加廣泛和深入，進(jìn)行多種族、多地域、大樣本的研究，并綜合考慮諸多因素的協(xié)同作用。