穗花杉雙黃酮對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響

何鋒榮 操龍斌 張琳 鄭介婷 邱欣 邱峰南方醫(yī)科大學(xué)南海醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣東 5844；南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣州 5055

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是由環(huán)境和遺傳等多種因素共同作用所導(dǎo)致的一類長(zhǎng)期且復(fù)雜的血管病變，是冠心病、腦血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心腦血管病的主要病理基礎(chǔ)［1-2］。血管內(nèi)皮細(xì)胞是直接暴露于循環(huán)系統(tǒng)中代謝產(chǎn)物等相關(guān)內(nèi)源性危險(xiǎn)因子的細(xì)胞，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷對(duì)AS形成和發(fā)展中的諸多病理學(xué)環(huán)節(jié)均具有重要作用［3］。因此，尋找能夠?qū)够钚匝跻鸬难趸瘧?yīng)激損傷對(duì)治療動(dòng)脈粥樣硬化具有重要臨床意義。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，穗花杉雙黃酮（AF）可有效保護(hù)羥基自由基（?OH）氧化誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，但具體機(jī)制不明，既往也沒(méi)有研究。本研究用過(guò)氧化氫（H2O2）處理血管內(nèi)皮細(xì)胞，構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞模型，采用不同濃度的AF干預(yù)。觀察AF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力、凋亡等指標(biāo)的影響，檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子、基因、蛋白表達(dá)情況。旨在初步探索穗花杉雙黃酮對(duì)巨噬細(xì)胞極化的分子調(diào)控作用，為動(dòng)脈粥樣硬化提供新的治療靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系（HUVECs）購(gòu)自美國(guó)ATCC，RPMI1640培養(yǎng)基、雙抗（青霉素-鏈霉素）、胰蛋白酶（Hyclone）、胎牛血清（FBS）購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司，AF、二甲基亞砜（DMSO）、3%H2O2購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（cell counting kit-8，CCK-8）檢測(cè)試劑購(gòu)自東仁化學(xué)科技上海有限公司，乳酸脫氫酶（LDH）和超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，Hoechst 33258染色液及Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，抗體Bcl-2、Bax、Bcl-x、Cleaved-caspase3、GAPDH 購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling Technology（CST）公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HUVECs細(xì)胞用含有10%熱滅活FBS和10 U/ml青霉素、10μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，維持細(xì)胞數(shù)1×108/培養(yǎng)瓶左右。胰酶消化細(xì)胞稀釋成1×106/ml，接種于對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)皿中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分組：對(duì)照組、H2O2組、H2O2+AF組。對(duì)照組為單純HUVECs培養(yǎng)，H2O2組為單純HUVECs培養(yǎng)基礎(chǔ)上加入H2O2，終濃度為300μm。H2O2+AF組為含300μm H2O2+不同濃度的AF共孵育。

1.3 CCK-8測(cè)定 細(xì)胞毒性檢測(cè)：在96孔板中每孔加入HUVECs細(xì)胞（1×105/ml）100μl的細(xì)胞懸液，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，饑餓12 h，在每組中加入AF 0.0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、100.0μm分別于24、48、72 h后，按照CCK-8說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)確定實(shí)驗(yàn)的安全濃度。細(xì)胞增殖檢測(cè)：按上述方法將細(xì)胞鋪板，待細(xì)胞貼壁后，細(xì)胞分組，300μm H2O2處理24 h加不同濃度的AF，作用規(guī)定時(shí)間后分別加入20μl CCK-8溶液，37℃避光孵育30 min，檢測(cè)450 nm吸光度，與對(duì)照組比較細(xì)胞存活率。

1.4 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中相關(guān)細(xì)胞因子含量將建模成功的HUVECs細(xì)胞每孔以1×106個(gè)接種于24孔板中，每孔加入不同濃度AF藥物處理24 h。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)細(xì)胞上清中LDH、SOD的表達(dá)水平。

1.5 Wound healing實(shí)驗(yàn) 培養(yǎng)板接種細(xì)胞之前先用Marker筆在24孔板背面畫(huà)橫線標(biāo)記，細(xì)胞消化后每孔接入5×104個(gè)HUVECs細(xì)胞，每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞鋪滿板底后，用20μl微量移液槍頭在單層細(xì)胞上呈“｜”字形劃痕，制造細(xì)胞創(chuàng)傷模型，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS沖洗孔板3次，洗去劃痕產(chǎn)生的細(xì)胞碎片。300μm H2O2處理12 h后加入低血清濃度的MPMI1640培養(yǎng)基配制的含不同濃度AF的藥物培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別在劃痕0 h和48 h時(shí)觀察創(chuàng)傷愈合程度，并用顯微鏡在100倍視野下拍照（目鏡10×，物鏡10×）。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：取2 ml HUVECs細(xì)胞以5×105個(gè)/ml密度接種于12孔板中，待貼壁后300μm H2O2處理14 h加不同濃度的AF培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。孵育后，用不含EDTA的胰酶消化，1 000轉(zhuǎn)/min（離心半徑為10 cm），4℃離心5 min收集細(xì)胞。預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次均在1 000轉(zhuǎn)/min（離心半徑為10 cm），4℃離心5 min。收集約（1～5）×105個(gè)細(xì)胞。100μl 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞混勻。每管加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI，輕輕混勻后室溫避光反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后，每管加入400μl 1×Binding Buffer，混勻，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。熒光染色：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于12孔板，待貼壁后300μm H2O2處理24 h加不同濃度的AF培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。小心吸去培養(yǎng)基，冷PBS清洗2次后每孔加入DAPI染液或Hochest 33258染液0.5 ml室溫避光反應(yīng)20～30 min。PBS清洗3次，每次5 min。熒光顯微鏡下紫外光激發(fā)觀察采像。

1.7 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 取4 ml HUVECs細(xì)胞以2.5×104個(gè)/ml密度接種于6孔板中，實(shí)驗(yàn)分組同上。規(guī)定時(shí)間后收集細(xì)胞，冰上裂解30 mim，12 000轉(zhuǎn)/min（離心半徑為10 cm）離心30 min，吸取上清液，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物）檢測(cè)總蛋白濃度，將裂解液蛋白（50～100μg）進(jìn)行8%～15%SDS-PAGE，電泳轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（Amersham Bioscience）上。印跡后，將膜與特異性一抗在4℃孵育過(guò)夜。與HRP連接的二抗雜交后，通過(guò)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑［Amersham Biosciences，中國(guó)（代理）］顯可視化蛋白質(zhì)條帶。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析及雙因素方差分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AF對(duì)細(xì)胞的毒性作用 CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明，隨著AF濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制細(xì)胞的增殖效果增強(qiáng)，且高濃度具有殺傷作用。AF對(duì)HUVECs細(xì)胞24、48、72 h的IC50值分別為（54.57±4.28）μm、（15.97±4.13）μm和（7.55±1.87）μm。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇5μm、10μm濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 AF對(duì)H2O2損傷的細(xì)胞增殖活力的影響 CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明，藥物作用48 h后，H2O2組與H2O2+AF組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩兩比較，H2O2作用24 h能顯著抑制HUVECs的增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；應(yīng)用AF（10μm）處理后，能顯著逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制，提 高 細(xì) 胞 存 活 率（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

2.3 AF對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞LDH含量和SOD活性水平的影響 ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，H2O2誘導(dǎo)后的HUVECs細(xì)胞LDH［（85.75±2.97）U/ml］升高，SOD［（11.01±0.84）U/ml］活性水平降低。與H2O2組比較，AF干預(yù)后能使SOD活性水平上調(diào)，而使LDH表達(dá)水平下調(diào)。特別是10μm的AF可使LDH表達(dá)水平下調(diào)至（40.78±0.97）U/ml，SOD活性水平上調(diào)至（15.98±1.86）U/ml（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。這說(shuō)明AF能改善H2O2對(duì)細(xì)胞的氧化損傷作用。

2.4 不同劑量AF對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞遷移能力的影響 Wound healing實(shí)驗(yàn)證明HUVECs細(xì)胞在H2O2作用下橫向遷移能力減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而AF能有效促進(jìn)細(xì)胞的遷移，其效果具有濃度依賴性，即與H2O2組比，各濃度H2O2+AF組HUVECs的遷移能力顯著提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖1 AF對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞增殖的影響（n=3）

圖2 AF對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞LDH含量和SOD活性水平的影響（n=3，A為AF對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞LDH含量的影響，B為AF對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞SOD活性水平的影響）

圖3 AF和H2O2對(duì)HUVECs遷移能力的影響（n=3，A為各組Wound healing實(shí)驗(yàn)圖片，B為各組劃痕面積比值）

圖4 AF干預(yù)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs凋亡情況（n=3，A為Hochest33258染色熒光顯微鏡圖片×200，B為流式細(xì)胞術(shù)各區(qū)比例圖片，C為實(shí)驗(yàn)組與H2O2組細(xì)胞凋亡率比值）

2.5 不同劑量AF對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs凋亡的影響 為了解AF是否干預(yù)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs凋亡情況，利用Hochest33258染色熒光顯微鏡觀察法和流式細(xì)胞術(shù)分析不同濃度解AF處理后的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AF減少H2O2誘導(dǎo)的HUVECs凋亡，且有濃度依賴性。Hochest33258染色熒光顯微鏡觀察到作用48 h后，10μm AF明顯減少H2O2誘導(dǎo)的HUVECs凋亡（P＜0.01）。流式細(xì)胞術(shù)統(tǒng)計(jì)到對(duì)照組、H2O2組、H2O2+AF（5μm）組、H2O2+AF（10μm）組的細(xì)胞［早期凋亡區(qū)域（Q3）和晚期凋亡區(qū)域（Q2）］凋亡率分別為（8.57±0.86）%、（20.64±0.90）%、（13.05±2.57）%、（11.23±1.74）%，10μm AF明顯減少H2O2誘導(dǎo)的HUVECs Q3和Q2的比例（P＜0.01）。見(jiàn)圖4。

2.6 不同劑量AF對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平影響 在上述表型實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們推測(cè)AF可能對(duì)凋亡相關(guān)蛋白有影響。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞中，藥物同步處理24 h后，促凋亡蛋白Bax下調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-x上調(diào)，凋亡執(zhí)行因子Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)（圖5）。

3 討 論

AS是由環(huán)境和遺傳等多種因素共同作用所導(dǎo)致的一類長(zhǎng)期且復(fù)雜的血管病變，是目前對(duì)人類健康影響最嚴(yán)重、最常見(jiàn)的慢性病之一，是冠心病、腦血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心腦血管病的主要病理基礎(chǔ)［4］。目前，AS發(fā)病的炎癥機(jī)制學(xué)說(shuō)得到諸多研究的證實(shí)，炎性細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用調(diào)控著AS的發(fā)生、發(fā)展及消退。AS病理過(guò)程中的多種危險(xiǎn)因子例如高糖、氧化型低密度脂蛋白、膽固醇晶體、活性氧自由基、高同型半胱氨酸等均參與AS發(fā)生發(fā)展［5］，但是這些物質(zhì)參與AS的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制未明。AS的抗炎治療也得到國(guó)際醫(yī)學(xué)界認(rèn)可，中醫(yī)藥可通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性，在防治AS易損斑塊中展現(xiàn)良好的應(yīng)用前景［6-7］。他汀治療率低、依從性差，患者使用他汀后的不良反應(yīng)（肌病或肝酶升高）嚴(yán)重，依哲麥布降低低密度脂蛋白膽固醇的幅度有限，只能輔助治療且對(duì)肝臟有損傷［8-10］。因此，尋找安全、有效的抗AS新藥勢(shì)在必行。AF是一種黃酮類中藥單體，既往的研究顯示它有抗炎、抗氧化等作用［11］。AF可有效保護(hù)?OH氧化誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，但具體機(jī)制不明，既往少有文獻(xiàn)報(bào)道。

圖5 AF對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白影響

活性氧自由基（reactive oxidative species，ROS）包括H2O2、氧自由基（O-）、超氧自由基（O2-）、?OH等，其中H2O2、是細(xì)胞內(nèi)最主要、最早期的兩類ROS［12］。ROS是通過(guò)外源環(huán)境和細(xì)胞自身或作為其他生物學(xué)反應(yīng)的副產(chǎn)物而生成，它可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，但機(jī)制尚未明確。細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)的ROS都來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)線粒體中的呼吸鏈反應(yīng)，并隨之產(chǎn)生具有毒性的代謝副產(chǎn)物［13］；在線粒體氧化磷酸化電子傳遞過(guò)程中，2%～4%的氧氣沒(méi)有被還原產(chǎn)生水而是轉(zhuǎn)變?yōu)镽OS［14］。線粒體被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)ROS來(lái)源的主要亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，線粒體膜上的許多氧化還原酶也會(huì)產(chǎn)生ROS，線粒體至少擁有10個(gè)能夠產(chǎn)生ROS的位點(diǎn)［12］。除了線粒體外，過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)膜、溶酶體等也都能產(chǎn)生ROS［12］。ROS這種復(fù)雜的角色使其在生物代謝過(guò)程中必須受到嚴(yán)格的控制，任何細(xì)胞內(nèi)ROS水平的改變，則很可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部活性的變化。

本研究顯示，10μm的AF可使LDH表達(dá)水平下調(diào)至（40.78±0.97）U/ml，SOD活性水平上調(diào)至（15.98±1.86）U/ml（P＜0.05）。HUVECs在H2O2作用下橫向遷移能力減弱，而AF能有效促進(jìn)細(xì)胞的遷移，其效果具有濃度依賴性。另外，利用Hochest33258染色熒光顯微鏡觀察法和流式細(xì)胞術(shù)分析不同濃度AF處理后，發(fā)現(xiàn)AF減少H2O2誘導(dǎo)的HUVECs凋亡，10μm AF明顯減少H2O2誘導(dǎo)的HUVECs Q3和Q2的比例（P＜0.01）。這些表型實(shí)驗(yàn)說(shuō)明AF有效調(diào)節(jié)ROS水平可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

過(guò)高的ROS可造成線粒體損傷，誘導(dǎo)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放入胞漿進(jìn)而激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終通過(guò)線粒體凋亡途徑誘發(fā)凋亡［15］。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)這個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平均進(jìn)行了檢測(cè)，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示AF可下調(diào)H2O2誘導(dǎo)的凋亡執(zhí)行因子Cleaved-caspase 3蛋白表達(dá)。細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞色素C的釋放受Bcl-2家族蛋白調(diào)控，其中抗凋亡Bcl-2蛋白與促凋亡Bax蛋白常被用來(lái)評(píng)價(jià)線粒體完整性和Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活程度，是決定細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵［16］。為了進(jìn)一步探究AF降低細(xì)胞凋亡的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)觀察了Bcl-2、Bax及Bcl-x蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷后，Bcl-2和Bcl-x蛋白下調(diào)，Bax蛋白上調(diào)；而AF處理能夠上調(diào)Bcl-2和Bcl-x蛋白，下調(diào)Bax蛋白，提示AF可能通過(guò)上調(diào)Bcl-2/Bax蛋白比值，從而減少細(xì)胞凋亡，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，中藥單體AF能對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制Cleaved-caspase-3級(jí)聯(lián)反應(yīng)，上調(diào)Bcl-2和Bcl-x蛋白，下調(diào)Bax蛋白，減少細(xì)胞凋亡有關(guān)，但對(duì)細(xì)胞更深層次機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

利益沖突：作者已申明文章無(wú)相關(guān)利益沖突。