流體剪切力調(diào)節(jié)HO-1表達對髓核細胞自噬作用及細胞外基質(zhì)的影響

曹良國 姚依村 葉冬平 梁偉國 王文

廣州市紅十字會醫(yī)院骨科 510000

下腰痛是一種常見且經(jīng)常復(fù)發(fā)的肌肉骨骼疾病，在全球范圍內(nèi)造成沉重的經(jīng)濟負擔(dān)［1-2］。椎間盤（IVD）退變被認為是下腰痛的主要原因，因此了解IVD的病理生理學(xué)具有重要意義［3］。越來越多的證據(jù)表明，機械應(yīng)力，包括流體剪切力（FSS）、靜水壓、壓縮應(yīng)力、拉伸應(yīng)力和其他機械應(yīng)力，在椎間盤的細胞外基質(zhì)（ECM）穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［4］。為了保持直立姿勢，椎間盤受到壓縮應(yīng)力，可引起髓核（NP）變形并產(chǎn)生靜水壓。然后將靜水壓轉(zhuǎn)移至纖維環(huán)（AF），并誘導(dǎo)產(chǎn)生拉伸應(yīng)力。在身體運動和脊柱運動過程中，NP內(nèi)的組織液進出以適應(yīng)這些應(yīng)力的變化。因此，NP細胞持續(xù)暴露于FSS。然而，F(xiàn)SS是否能夠以及如何調(diào)節(jié)NP細胞的ECM穩(wěn)態(tài)還知之甚少。

自噬是一種高度保守的適應(yīng)性過程，涉及選擇性消除和回收大量有害細胞質(zhì)物質(zhì)，如錯誤折疊的蛋白質(zhì)和受損的細胞內(nèi)細胞器，從而作為維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的主要細胞保護系統(tǒng)［5-6］。通常，細胞表現(xiàn)出較低和基礎(chǔ)水平的自噬。但是，自噬水平可顯著增加，以應(yīng)對外部環(huán)境應(yīng)激，包括機械應(yīng)激和營養(yǎng)剝奪，為基本細胞功能提供營養(yǎng)［7］。血紅素加氧酶-1（HO-1）已在許多組織和器官以及不同的病理生理學(xué)情景中被確定，是血紅素代謝為膽綠素、一氧化碳和鐵的限速酶，可對各種外部環(huán)境應(yīng)激誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激發(fā)揮細胞保護作用，炎癥和細胞死亡［8-9］。本研究中探究FSS對調(diào)節(jié)HO-1表達及髓核細胞自噬作用和ECM的影響。

1 材料與方法

1.1 NP細胞系培養(yǎng)及FSS實驗 本研究中使用永生化大鼠NP細胞系。細胞在補充1%青霉素-鏈霉素的含10%FBS的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中于37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)。如前所述進行FSS實驗。將細胞以3.0×104/cm2的密度接種到Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)玻片（75 mm×25 mm×1 mm；FFCS-C；Flexcell，美國）上，并在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。當(dāng)細胞達到85%融合時，將玻片置于Streamer?系統(tǒng)（STR-4000；Flexcell，美國），細胞暴露于12或24 dyne/cm2FSS0、1、2、3和4 h。NP細胞在暴露于FSS前用10μm鈷原卟啉（CoPP，Sigma，C1900，美國）預(yù)處理1 h或用500 nm雷帕霉素（Selleck，S1039，美國）預(yù)處理12 h。

1.2 RNA測序分析 使用TransZol Up Plus RNA試劑盒（ER501-01；Transgen，中國）從有或無FSS刺激的NP細胞中分離總RNA，每份樣品3μg RNA用作RNA樣品制備的輸入材料。使用NEBNext?UltraTM RNA文庫制備試劑盒（Illunina，NEB，美國）生成測序文庫，并在Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)上評估文庫質(zhì)量。簇生成后，在Illumina Hiseq平臺上對文庫制備物進行測序，生成150 bp配對末端讀取。質(zhì)量控制、reads映射到參考基因組并定量基因表達水平后，采用DESeq2 R包（1.16.1）進行差異表達分析，采用cluster Profiler R包進行基因本體（GO）和京東基因與基因組大百科全書（KEGG）富集分析。RNASeq數(shù)據(jù)已保存在序列讀取檔案（SRA，PRJNA587407）中。

1.3 硫酸化糖胺聚糖（sGAG）含量分析 4%多聚甲醛固定后，NP細胞經(jīng)不同濃度乙醇和二甲苯脫水。然后用阿利新藍對細胞進行染色。為測定sGAG含量，用木瓜蛋白酶提取試劑消化細胞，然后通過Blyscan SGAG測定法（B1000；Biocolor，英國）定量測定sGAG含量。

1.4 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）分析 使用Tripure分離試劑（11667165001，Roche，德國）從NP細胞中提取總RNA。進行逆轉(zhuǎn)錄（RT）和qRT-PCR分析。根據(jù)生產(chǎn)商的方案，使用PrimeScriptTM RT Master Mix（RR036A，Takara，日本）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄后，使用iTaqTM Universal SYBR?Green Supermix（172-5121，Bio-Rad）進行qRT-PCR。采用2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)，GAPDH作為內(nèi)對照。

1.5 免疫印跡分析髓核細胞用三純分離試劑（11667165001，德國羅氏）裂解。在4℃下12 000×g離心10 min后，用乙醇沉淀法從下層紅色有機相中分離出蛋白質(zhì)顆粒。用0.3M鹽酸胍/95%乙醇洗滌蛋白顆粒3次，加入1%十二烷基硫酸鈉溶解蛋白顆粒。用PierceTM BCA蛋白分析試劑盒（23225，Thermo Fisher Science，美國）檢測蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)負載于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳。蛋白轉(zhuǎn)移后，用5%脫脂牛奶封閉膜，然后與抗Col2a1抗體（1∶1 000，A1560；Abclon Technology，中國）、Aggrecan（1∶1 000，ab36861；Abcam，英 國）、MMP13（1∶3 000，ab39012；Abcam，英國）、ADAMTS5（1∶500，ab41037；Abcam，英國）、HO-1（1∶1 000，ab39012；Abcam，英國）在4℃孵育過夜。IFT88（1∶500，13967-1-AP；Proteintech，中國）和GAPDH（1∶2 000，TA-08；ZSGB-Bio，中國）。用TBST洗滌3次后，在室溫下與二次抗體孵育1 h。最后采用增強化學(xué)發(fā)光法對蛋白質(zhì)進行檢測。

1.6 免疫熒光 細胞在4%多聚甲醛中室溫固定10 min后，在0.1%Triton-100中通透15 min，室溫下用1%牛血清白蛋白阻斷1 h。隨后，細胞與抗HO-1抗體（1∶200，10701-1-AP；Proteintech，中國）和乙酰化微管蛋白（1∶400，T6793；Sigma，美國）在4℃下孵育過夜，然后與AlexaFluor488偶聯(lián)的兔和小鼠二抗（1∶500，A11008和A11001，Thermo Fisher Science，美國）在室溫下孵育1 h。DAPI染色后，用共聚焦顯微鏡（A1R，尼康，日本）觀察細胞，并用ImageJ軟件（1.50版，美國國立衛(wèi)生研究院）進行分析。

1.7 纖毛長度和患病率測量 使用Nikon A1R共聚焦顯微鏡（油浸×100物鏡）創(chuàng)建共聚焦z堆棧的最大投影，根據(jù)該投影通過ImageJ軟件測量纖毛長度。同時采用共聚焦z最大投影測定纖毛患病率和DAPI核染色。

1.8 小干擾RNA（siRNA）的轉(zhuǎn)染 分別用陰性對照（NC）siRNA和3個獨立的HO-1-siRNAs和IFT88-siRNAs轉(zhuǎn)染NP細胞。使用HO-1-siRNA（#2）和IFT88-siRNA（#1）的最有效靶序列。用Lipofectamine TMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑（13778150；Thermo Fisher Science，美國）將siRNA以50 pmol/105cell轉(zhuǎn)染細胞。24 h后，將轉(zhuǎn)染細胞消化后接種于Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)片上進行進一步研究。

1.9 透射電子顯微鏡（TEM）收獲的NP細胞在PBS和去離子水中清洗，然后通過離心沉淀。細胞分別用2.5%戊二醛固定2 h，1%四氧化鋨固定2 h。然后將細胞在乙醇中脫水，浸潤并包埋在Embed 812中。超薄切片用UranyLess（22409；EMS，英國）和檸檬酸鉛（22410；EMS，英國）染色，并用TEM（HT7700；Hitachi，日本）檢查。

1.10 使用mRFP-GFP-LC3慢病毒載體進行自噬檢測 NP細胞接種于24孔板（1×105/板）。24 h后按廠家說明書用慢病毒載體（武漢惠爾生物科技有限公司）感染細胞。感染后48 h，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達mRFP-GFP-LC3的NP細胞系。然后將轉(zhuǎn)染后的細胞用于自噬檢測。通過共聚焦顯微鏡（A1R；Nikon，日本）測定自噬。通過評價GFP和mRFPpuncta的數(shù)量檢測自噬通量。自由紅點表示自噬溶酶體，黃點表示自噬體。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析 使用GraphPad Prism 6軟件（GraphPad software Inc，美國）進行統(tǒng)計分析。所有實驗均至少進行3次獨立實驗，符合正態(tài)分布的計數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用獨立樣本t檢驗分析兩組參數(shù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FSS調(diào)節(jié)大鼠NP細胞ECM蛋白表達和sGAG含量 作為探索機械力調(diào)節(jié)IVD穩(wěn)態(tài)機制的初始步驟，我們進行了實驗以確定FSS對大鼠NP細胞的ECM蛋白表達的影響，見圖1。NP細胞以12 dyne/cm2的劑量在指定時間進行FSS處理（圖1B），然后測定sGAG含量和幾種關(guān)鍵ECM蛋白的表達。結(jié)果顯示，F(xiàn)SS處理1、2 h時sGAG含量和聚集蛋白聚糖蛋白水平顯著升高，F(xiàn)SS處理1、2和3 h時MMP13蛋白水平顯著降低（圖1C、D、E、G、H）。FSS處 理 使Col2a1表 達輕度增加，ADAMTS5表達降低（圖1F、I）。然而，當(dāng)NP細胞暴露于24 dyne/cm2FSS處理時，sGAG含量和Col2a1和聚集蛋白聚糖的蛋白水平降低，而MMP13和ADAMTS5的水平呈時間依賴性升高。提示中度FSS上調(diào)NP細胞sGAG含量和合成代謝ECM蛋白（Col2a1和聚集蛋白聚糖），下調(diào)分解代謝ECM蛋白（MMP13和ADAMTS5），而高FSS發(fā)揮相反的作用。我們接下來的研究重點是確定中度FSS（即12 dyne/cm2處理2 h）調(diào)節(jié)NP細胞中關(guān)鍵ECM蛋白表達和sGAG含量的潛在機制。

圖1 FSS調(diào)節(jié)NP細胞的ECM的表達和sGAG含量（A為NP細胞FSS的形成，顯示了C、HP和T。B為Flexcell Streamer系統(tǒng)示意圖。C為阿利新藍染色，NP房間與12 dyne/cm2 FSS在指定時間被對待；條形，100μm。D為sGAG含量，NP細胞按圖B處理，然后進行Blyscan SGAG試驗。E～I為Western blotting；NP細胞按圖C處理，然后進行Col2a1、聚集蛋白聚糖、MMP13和ADAMTS5表達的蛋白質(zhì)印跡分析）

2.2 HO-1在NP細胞中被中度FSS大量上調(diào) 為了鑒定受中度FSS處理調(diào)控的基因，用或不用FSS（12 dyne/cm2處 理NP細胞2 h）處理NP細胞。分離兩組的總RNA，并按照材料和方法中的描述進行RNA測序分析。在上調(diào)的基因中，我們發(fā)現(xiàn)FSS處理顯著上調(diào)HO-1，P值最低（圖2A、B）。qRT-PCR分析、western blotting和免疫熒光染色結(jié)果進一步驗證了FSS處理使HO-1 mRNA和蛋白的水平急劇升高（圖2C～G）。

2.3 HO-1是NP細胞ECM中度FSS調(diào)節(jié)的關(guān)鍵 我們接下來確定HO-1是否參與NP細胞ECM蛋白的FSS調(diào)節(jié)。為此，用陰性對照siRNA（NC-siRNA）和3種不同的HO-1 siRNA（#1、#2和#3）轉(zhuǎn)染NP細胞。在本研究中，我們選擇了#2 HO-1 siRNA進行HO-1敲低，因為#2 HO-1 siRNA表現(xiàn)出最佳的敲低效率（圖2H、I）。為了確定HO-1是否參與FSS對ECM的調(diào)節(jié)，首先用對照siRNA或HO-1-siRNA（#2）轉(zhuǎn)染NP細胞。然后，用或不用HO-1誘導(dǎo)劑鈷原卟啉IX（CoPP）（10μm）預(yù)處理細胞1 h，用12 dyne/cm2FSS預(yù)處理細胞2 h。正如預(yù)期的那樣，HO-1 siRNA顯著降低HO-1蛋白的水平，CoPP處理可顯著逆轉(zhuǎn)HO-1蛋白的水平（圖2J、K）。此外，HO-1 siRNA顯著減少了sGAG的合成，CoPP處理可部分逆轉(zhuǎn)sGAG的合成（圖2L、M）。同樣，蛋白免疫印跡分析結(jié)果顯示HO-1 siRNA下調(diào)合成代謝ECM蛋白（Col2a1和聚集蛋白聚糖）的水平，上調(diào)分解代謝ECM蛋白（MMP13和ADAMTS5）的水平，CoPP處理可逆轉(zhuǎn)這種作用（圖2N～R）。

2.4 FSS促進NP細胞自噬 我們確定FSS是否激活NP細胞的自噬。結(jié)果顯示，與未處理的細胞相比，用FSS處理的NP細胞表現(xiàn)出自噬增加，表現(xiàn)為LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1蛋白水平的急劇增加（圖3A～C）。同樣，TEM分析顯示，與未處理細胞相比，F(xiàn)SS處理細胞中自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量顯著增加（圖3D）。此外，免疫熒光共聚焦顯微鏡分析顯示，與未處理的細胞相比，F(xiàn)SS處理的NP細胞中自噬體（黃點）和自噬溶酶體（游離紅點）的數(shù)量均顯著增加（圖3E、F）。

2.5 HO-1調(diào)節(jié)FSS誘導(dǎo)的NP細胞自噬 我們接下來確定HO-1是否在介導(dǎo)FSS誘導(dǎo)的NP細胞自噬中發(fā)揮作用。NP與FSS被對待，有或沒有CoPP處理，在有或沒有HO-1敲低siRNA。結(jié)果顯示，HO-1敲低顯著降低了FSS處理誘導(dǎo)的NP細胞LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1表達的增加，CoPP處理可顯著逆轉(zhuǎn)該作用（圖3G～I）。TEM分析顯示，與對照siRNA/FSS處理的細胞相比，HO-1 siRNA顯著減少了FSS處理的NP細胞中自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量，CoPP處理可在很大程度上逆轉(zhuǎn)這種情況（圖3J）。同樣，免疫熒光共聚焦顯微鏡分析顯示，與對照siRNA/FSS處理的細胞相比，HO-1 siRNA/FSS處理的NP細胞中自噬體（黃點）和自噬溶酶體（游離紅點）的數(shù)量均急劇下降，CoPP處理可逆轉(zhuǎn)這種情況（圖3K、L）。

圖2 HO-1調(diào)節(jié)FSS介導(dǎo)的NP細胞內(nèi)ECM的產(chǎn)生[A為RNA-SEQ數(shù)據(jù)熱圖。NP細胞用或不用12 dyne/cm2 FSS處理2 h，然后進行RNA-seq分析，如“材料與方法”中所述。B為RNA-SEQ數(shù)據(jù)的火山圖。藍色箭頭表示血紅素加氧酶-1(HO-1)。C為實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)分析。NP細胞經(jīng)12 dyne/cm2 FSS作用2 h后，進行qRT-PCR分析。D、E為Western blotting。NP細胞按C組處理，然后進行Western blotting。來自3個獨立實驗的定量數(shù)據(jù)（E）。F、G為免疫熒光（IF）染色。NP細胞按組（C）處理，免疫熒光染色（E），F(xiàn)放大倍數(shù)為400倍BAR，50μm。來自3個獨立實驗的定量數(shù)據(jù)（G）。H、I為HO-1 siRNA敲除。用陰性對照siRNA（NC-siRNA）和3個HO-1-siR?NA（#1、#2、#3）轉(zhuǎn)染NP細胞。然后，對細胞進行HO-1的Western blotting檢測（H）。3個獨立實驗的定量數(shù)據(jù)（I）。#2 HO-1-siRNA表現(xiàn)出最好的擊倒效果，并用于本研究的所有后續(xù)實驗。J、K為Western blotting。將陰性對照siRNA（NC-siRNA）和HO-1-siRNA（#2）轉(zhuǎn)染NP細胞。然后，用或不加HO-1誘導(dǎo)劑鈷原卟啉IX（10μm）預(yù)處理細胞，用12 dyne/cm2的FSS處理2 h，然后用Western blotting檢測HO-1（J）。來自3個獨立實驗的定量數(shù)據(jù)（K）。L、M為SGAG含量（L采用阿辛藍染色，×100）。NP細胞按面板（J）處理，阿利新藍染色和Blycan硫酸化糖胺多糖檢測。來自3個獨立實驗的SGAG含量的定量數(shù)據(jù)（M）。N-R為Western blotting。NP細胞與面板（J）一樣處理，然后用Western blotting檢測所示蛋白的表達。定量數(shù)據(jù)來自3個獨立的實驗（O～R）]

2.6 雷帕霉素逆轉(zhuǎn)FSS處理的NP細胞中HO-1基因敲除誘導(dǎo)的自噬和ECM穩(wěn)態(tài)改變 我們接下來確定雷帕霉素處理對FSS處理的NP細胞中HO-1敲低誘導(dǎo)的自噬抑制的影響。首先用HO-1 siRNA轉(zhuǎn)染NP細胞，然后用或不用雷帕霉素預(yù)處理NP細胞12 h，進行FSS處理2 h，結(jié)果顯示雷帕霉素處理NP細胞可顯著提高LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，Beclin-1蛋白的表達水平和自噬體和自噬溶酶體的形成（圖4A～F）。此外，雷帕霉素處理也逆轉(zhuǎn)了FSS處理的NP細胞中HO-1敲除誘導(dǎo)的sGAG含量的降低和ECM蛋白表達的改變（圖4G～M）。

2.7 CoPP或雷帕霉素可大量逆轉(zhuǎn)FSS處理的NP細胞中IFT88缺失誘導(dǎo)的自噬和ECM穩(wěn)態(tài)的改變 最后，我們確定雷帕霉素或CoPP上調(diào)HO-1是否可以逆轉(zhuǎn)FSS處理的NP細胞中IFT88敲低誘導(dǎo)的自噬和ECM蛋白表達的改變。首先用IFT88-siRNA轉(zhuǎn)染NP細胞，然后，用CoPP（10μm）或雷帕霉素（500 nm）預(yù)處理細胞，再進行FSS處理。結(jié)果顯示，CoPP或雷帕霉素處理均在很大程度上逆轉(zhuǎn)了IFT88敲除誘導(dǎo)的LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1蛋白水平的改變（圖5A～C）、自噬體和自噬溶酶體的形成（圖5D～F）、sGAG含量（圖5G、H）以及合成代謝和分解代謝ECM蛋白的表達（圖5I～M）。

圖3 HO-1介導(dǎo)FSS誘導(dǎo)的NP細胞自噬[A～C為Western blotting。NP房間有或沒有12 dyne/cm2 FSS被對待2 h，然后為指示的蛋白質(zhì)表示西方的弄污。LC3-II/LC3-I比值（B）和Beclin-1（C）的定量。D為透射電子顯微鏡（TEM）。NP細胞按圖（A）處理，顯示了TEM圖像。箭頭表示不同階段的雙膜自噬體和自噬溶酶體。條形，500 nm。E為自噬體和自噬溶酶體的測量,免疫熒光染色，×400。用表達串聯(lián)mRFP-GFP-LC3構(gòu)建體的慢病毒感染NP細胞，用12 dyne/cm2 FSS處理2 h，獲得熒光圖像。條形，5μm。F為自噬體（黃點）和自噬溶酶體（游離紅點）的定量。G～I為Western blotting。NP細胞首先用和不用HO-1 siRNA敲低，在有和無CoPP的情況下處理。然后，用或不用HO-1誘導(dǎo)劑鈷原卟啉（CoPP）IX（10 μm）預(yù)處理細胞，并進行12 dyne/cm2 FSS處理2 h，然后進行蛋白質(zhì)印跡法以表達指定蛋白。來自3個獨立實驗（H、I）的LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1的定量。J為TEM。NP細胞按圖G處理。顯示了TEM圖像。箭頭表示雙膜自噬體和自噬溶酶體。條形，500 nm。K、L自噬體和自噬溶酶體的測量。K采用免疫熒光染色，×400。用表達串聯(lián)mRFP-GFP-LC3結(jié)構(gòu)的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)NP細胞，并按圖G處理。獲得熒光圖像。L為來自3個獨立實驗的自噬體（黃點）和自噬溶酶體（游離紅點）的定量]

3 討 論

在本研究中，我們證明了FSS對NP細胞ECM穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的影響。我們發(fā)現(xiàn)FSS以負荷大小和時間依賴性方式調(diào)節(jié)ECM代謝。當(dāng)NP細胞受到24 dyne/cm2FSS處理時，ECM合成代謝和分解代謝之間的平衡被破壞，表現(xiàn)為sGAG含量和Col2和聚集蛋白聚糖的表達減少，ECM降解蛋白酶MMP13和ADAMTS5的表達增加。然而，當(dāng)NP細胞暴露于相對中等 的FSS（12 dyne/cm21～2 h）時，F(xiàn)SS通過促進ECM合成代謝和抑制ECM分解代謝維持ECM穩(wěn)態(tài)。觀察到的中度FSS的促合成代謝和抗分解代謝作用與之前在暴露于不同機械刺激的各種細胞類型中的研究一致。在大鼠纖維軟骨細胞中，Tabeian等［10］報道動態(tài)拉伸應(yīng)變可顯著消除IL-1β誘導(dǎo)的MMP上調(diào)（MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP13、 MMP16、MMP17 和MMP19）。在人軟骨細胞中，He等［11］發(fā)現(xiàn)中度循環(huán)拉伸應(yīng)變可降低MMP-1和MMP-13的蛋白表達，并發(fā)揮抗分解代謝作用以保護軟骨完整性。Binch等［12］的結(jié)果證明，動態(tài)壓迫可促進脂肪干細胞中Col2和聚集蛋白聚糖的合成。我們的結(jié)果提示，NP細胞可以啟動早期ECM合成過程，以維持ECM穩(wěn)態(tài)，以應(yīng)對中度FSS，深入了解中度FSS調(diào)節(jié)NP細胞ECM穩(wěn)態(tài)的具體機制可能有助于我們尋找IVD變性的新的和早期預(yù)防和治療靶點。

越來越多的證據(jù)表明，HO-1可以減弱炎癥和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的NP細胞和軟骨細胞中ECM合成代謝和分解代謝之間的不平衡［13-15］。在這項研究中，我們進行了RNA測序分析，并重點關(guān)注HO-1，它在暴露于中度FSS的NP細胞中顯著上調(diào)。我們發(fā)現(xiàn)，HO-1抑制降低了中度FSS暴露的NP細胞中sGAG含量，下調(diào)了ECM合成代謝相關(guān)蛋白（Col2a1，聚集蛋白聚糖）并上調(diào)了ECM分解代謝相關(guān)蛋白（MMP13，ADAMTS5），這可以被HO-1誘導(dǎo)劑CoPP逆轉(zhuǎn)。這提示HO-1在中度FSS誘導(dǎo)的ECM穩(wěn)態(tài)維持中起著關(guān)鍵性作用。

圖4 雷帕霉素調(diào)節(jié)NP細胞的自噬和ECM[A～C為Western blotting。NP細胞先用HO-1 siRNA轉(zhuǎn)染，用自噬激活劑雷帕霉素（RAP，500 nm）處理12 h，然后用12 dyne/cm2 FSS處理細胞2 h，然后用Western blotting檢測指示蛋白的表達。來自3個獨立實驗（B、C）的LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1的定量。D為透射電子顯微鏡（TEM）。NP細胞按圖（A）處理。顯示了TEM圖像。箭頭表示雙膜自噬體和自噬溶酶體。條形，500 nm。E為自噬體和自噬溶酶體的測量。E采用免疫熒光染色（×400），表達串聯(lián)mRFP-GFP-LC3結(jié)構(gòu)的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)NP細胞，并按圖（A）處理。獲得熒光圖像。F為來自3個獨立實驗的自噬體（黃點）和自噬溶酶體（游離紅點）的定量。G、H為sGAG含量。G采用阿辛藍染色，×100。H為Blyscan硫酸糖胺聚糖測定。I～M為Western blotting。NP細胞按圖（A）處理，然后用免疫印跡法檢測指定蛋白的表達（I）。來自3個獨立實驗（J～M）的Col2a1、聚集蛋白聚糖、MMP13和ADAMTS5的定量]

不同研究組的結(jié)果表明，F(xiàn)SS可誘導(dǎo)骨細胞、軟骨細胞和肝細胞癌細胞發(fā)生保護性自噬［16-18］。與以前的研究一致，我們的數(shù)據(jù)證明適度的FSS通過增加LC3-II與LC3-I的比率，Beclin-1的蛋白表達和自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量來激活NP細胞的自噬。HO-1上調(diào)作為自噬誘導(dǎo)的一種手段在許多疾病中都有報道［19-20］。例如，在鎘誘導(dǎo)的肺氣腫小鼠模型中，Surolia等［21］發(fā)現(xiàn)HO-1介導(dǎo)自噬的激活，并保護肺內(nèi)皮細胞凋亡和肺氣腫的發(fā)生。而在糖尿病腎病細胞模型中，Dong等［22］報道HO-1可以增強自噬，抑制高糖誘導(dǎo)的足細胞凋亡。在這項研究中，我們證明HO-1抑制了FSS誘導(dǎo)的自噬激活，而HO-1誘導(dǎo)劑CoPP逆轉(zhuǎn)了這一過程。此外，自噬激活劑雷帕霉素減弱HO-1抑制誘導(dǎo)的FSS誘導(dǎo)的NP細胞自噬激活和ECM穩(wěn)態(tài)的破壞?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明適度的FSS維持NP細胞的ECM穩(wěn)態(tài)，至少部分是通過HO-1介導(dǎo)的自噬。

盡管以上結(jié)果表明FSS可以通過HO-1介導(dǎo)的NP細胞自噬來調(diào)節(jié)ECM的動態(tài)平衡，但細胞如何感知FSS并將其轉(zhuǎn)化為下游分子信號仍不清楚。初級纖毛是一種以微管為基礎(chǔ)的細胞器，它作為單個突起從大多數(shù)哺乳動物細胞類型的表面延伸出來，包括NP細胞。它可以感知和傳遞細胞外的機械和化學(xué)信號，以調(diào)節(jié)各種細胞過程，并維持組織的動態(tài)平衡［23］。由于初級纖毛不能合成蛋白質(zhì)，纖毛相關(guān)運輸?shù)鞍祝鏘FT88，因此對纖毛的生物發(fā)生、維持和功能至關(guān)重要。最近的研究表明，IFT88的亞型突變可以導(dǎo)致初級纖毛嚴(yán)重發(fā)育不良，并取消周期性拉伸應(yīng)變對軟骨細胞對IL-1β炎癥反應(yīng)的抑制作用［24］。此外，Miceli等［25］報道了IFT88的亞型缺失損害了纖毛組裝，并抑制了FSS誘導(dǎo)的上皮細胞自噬激活。因此，我們推測當(dāng)NP細胞暴露于FSS時，與IFT88相關(guān)的初級纖毛可能在機械轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。正如預(yù)期的那樣，轉(zhuǎn)染IFT88-siRNA的NP細胞顯示出初級纖毛的缺陷，初級纖毛的破壞下調(diào)了HO-1的蛋白表達，抑制了自噬激活，破壞了適度FSS暴露的NP細胞的ECM動態(tài)平衡。同時，我們發(fā)現(xiàn)COPP和RAP都部分逆轉(zhuǎn)了這種變化。因此，我們的數(shù)據(jù)表明，初級纖毛可以感知和介導(dǎo)適度的FSS信號，以調(diào)節(jié)HO-1介導(dǎo)的自噬激活，從而維持NP細胞的ECM動態(tài)平衡。

圖5 HO-1上調(diào)或雷帕霉素逆轉(zhuǎn)FSS處理的NP細胞中IFT88缺失誘導(dǎo)的自噬和ECM產(chǎn)生的改變[A～C為Western blotting。用IFT88-siRNA轉(zhuǎn)染NP細胞。然后，用CoPP（10μm）或雷帕霉素（RAP，500 nm）預(yù)處理細胞，用12 dyne/cm2 FSS處理2 h，然后用免疫印跡法檢測LC3-I、LC3-II和Beclin-1（A）的表達。來自3個獨立實驗（B、C）的LC3-I/LC3-II比值和Beclin-1的定量。D為透射電子顯微鏡（TEM）。NP細胞按圖A處理。顯示了TEM圖像。箭頭表示雙膜自噬體和自噬溶酶體。條形，500 nm。E為自噬體和自噬溶酶體的測量。免疫熒光染色，×400。用表達串聯(lián)mRFP-GFP-LC3結(jié)構(gòu)的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)NP細胞，并按圖A處理。獲得熒光圖像。F為來自3個獨立實驗的自噬體（黃點）和自噬溶酶體（游離紅點）的定量。G采用阿辛藍染色，×100。H為Blyscan硫酸糖胺聚糖測定。I～M為Western blotting。NP細胞按圖A處理，然后用免疫印跡法檢測指定蛋白的表達（I）。來自3個獨立實驗（J～M）的Col2a1、聚集蛋白聚糖、MMP13和ADAMTS5表達的定量]

綜上所述，中度FSS可以維持NP細胞的ECM穩(wěn)態(tài)，這需要在初級纖毛存在的情況下通過HO-1介導(dǎo)的自噬激活。這項研究可以使我們更好地理解中度FSS介導(dǎo)的NP細胞ECM穩(wěn)態(tài)的維持，并可能為開發(fā)早期預(yù)防和治療IVD變性的新策略帶來曙光。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。