桑樹MaPP2C8基因克隆及其干旱脅迫下的表達(dá)

黃仁維，祁偉亮，曾 睿，任迎虹

(成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，特色園藝生物資源開發(fā)與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130)

桑樹(MorusalbaL.)屬桑科(Moraceae)桑屬(MorusLinn.)植物，由于其良好的適應(yīng)性而廣泛分布于世界各地，在中國已有5000多年的種植歷史[1]。桑樹的果實(shí)桑葚味道鮮美，營養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者的喜愛[2]。桑葉作為家蠶(Bombyx)唯一的營養(yǎng)來源具有重要的生態(tài)學(xué)意義，對(duì)養(yǎng)蠶業(yè)具有極其重要的作用[3]。桑樹具有一定程度的耐旱性，適應(yīng)性較強(qiáng)，被譽(yù)為生態(tài)經(jīng)濟(jì)兩用型樹種[4]。但由于地理位置的不同，尤其在中國的北方地區(qū)，年降雨量少，嚴(yán)重的干旱極大地影響桑樹的種植，且不同品種桑樹的耐旱性差異大，同樣嚴(yán)重制約了不同桑樹品種的推廣[5-6]。植物抗性基因產(chǎn)生響應(yīng)是植物應(yīng)對(duì)外界各種脅迫的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此克隆桑樹抗性相關(guān)基因，解析其脅迫響應(yīng)和抗性機(jī)制有利于桑樹的抗性育種。

植物對(duì)外界脅迫的響應(yīng)受多種基因的調(diào)控。植物蛋白磷酸酶(protein phosphatases, PPs)在植物中參與多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在可逆的磷酸化反應(yīng)中用于抵消激酶的作用，其中，2C型PPs(PP2Cs)是植物PPs的主要類群[7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PP2Cs參與多種與脫落酸(ABA)相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，使得PP2Cs被認(rèn)為處于植物逆境響應(yīng)和發(fā)育主要信號(hào)通路的中心位置[8]。截止目前，研究人員已在多個(gè)物種中鑒定出PP2C家族成員，對(duì)PP2C基因家族成員的分子、生化、遺傳及功能研究均表明，PP2Cs參與調(diào)控植物生理的多個(gè)方面[9-11]。在對(duì)多種模式植物，如，擬南芥、玉米、水稻等的PP2Cs表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn)，PP2Cs基因受ABA及多種非生物脅迫的誘導(dǎo)，如干旱脅迫、滲透性脅迫、鹽脅迫及低溫脅迫等[11-13]。He等[14]發(fā)現(xiàn)，玉米多個(gè)PP2C基因家族成員的表達(dá)受多種脅迫及ABA的誘導(dǎo)，表明這些基因可能在玉米抵御脅迫過程中扮演著重要的角色。綜上可知，PP2Cs基因家族在植物響應(yīng)外界脅迫中具有重要調(diào)控作用，克隆并解析桑樹MaPP2C家族基因的功能對(duì)桑樹抗性育種具有重要的作用。

目前針對(duì)PP2Cs家族基因的相關(guān)研究主要集中在一些模式植物上，對(duì)木本植物PP2Cs基因家族相關(guān)基因的研究還嚴(yán)重不足，有關(guān)桑樹MaPP2Cs家族相關(guān)基因的研究還鮮有報(bào)道。本團(tuán)隊(duì)對(duì)前期的桑樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MaPP2C8基因的表達(dá)受干旱脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)。因此，本研究對(duì)桑樹MaPP2C8基因及其啟動(dòng)子進(jìn)行了克隆并分析，并對(duì)干旱脅迫處理下MaPP2C8基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究MaPP2C8基因在干旱脅迫響應(yīng)中的功能奠定基礎(chǔ)，以期為桑樹抗旱基因工程和遺傳改良提供基因資源。

1 材料和方法

1.1 供試材料及處理

供試材料為桑樹品種‘德果1號(hào)’，由四川省德昌縣桑樹種質(zhì)資源圃提供，該品種為德昌縣桑樹種植主推品種，其果實(shí)品質(zhì)好，果葉兼用具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

干旱脅迫處理：將桑樹種子播種于含營養(yǎng)土的10 L種植盆中，每盆種植4株，于25 ℃、相對(duì)濕度20%～30%溫室自然光下培養(yǎng)。待桑苗長(zhǎng)至株高約45 cm左右時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗進(jìn)行干旱處理。依據(jù)土壤含水量的差異共設(shè)置4個(gè)處理組，分別為：輕度干旱脅迫(相對(duì)含水量為65%～75%)、中度干旱脅迫(相對(duì)含水量為50%～65%)、重度干旱脅迫(相對(duì)含水量為35%～40%)及重度干旱脅迫后復(fù)水組，每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)生物重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3盆桑苗。具體操作為：將盆栽苗澆透水后進(jìn)行自然干旱，每天傍晚取距盆表土10～15 cm處的土樣，采用烘干稱重法測(cè)定土壤含水量，土壤含水量達(dá)到脅迫處理要求后，于次日早晨8點(diǎn)取植株相同部位幼嫩葉片，用于干旱脅迫下的基因表達(dá)分析。復(fù)水組于重度干旱取材后立即給予充足水分，2 d后取樣用于后續(xù)試驗(yàn)。

試驗(yàn)所用的高保真DNA聚合酶TopTaqDNA Polymerase、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物有限公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京天根生物公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A)、T載pMD19-T購自TaKaRa生物公司。RNA提取試劑盒RNAprep Pure Plant Kit(DP441)購自北京天根生物公司，引物合成和測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，SsoFastTMEvaGreen Supermix購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 基因克隆桑樹葉片總RNA的提取按照RNAprep Pure Plant Kit說明書進(jìn)行，cDNA第一鏈合成按照PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書進(jìn)行。根據(jù)桑樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的序列信息，設(shè)計(jì)引物(表1)，以桑樹cDNA為模板，對(duì)MaPP2C8基因的cDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板2 μL, 上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，10×TopTaq緩沖液2.5 μL，dNTPs 1.5 μL，TopTaq酶0.2 μL，最后使用ddH2O補(bǔ)足至終體積25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，26個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，將純化后的產(chǎn)物連接至PMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)菌液PCR鑒定后送生工測(cè)序。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物及用途

1.2.2 啟動(dòng)子克隆桑樹基因組DNA的提取采用改良CTAB法進(jìn)行[15]。以NCBI數(shù)據(jù)庫中報(bào)道的桑樹基因組序列中MaPP2C8啟動(dòng)子序列為參考序列設(shè)計(jì)引物(表1)，以‘德果1號(hào)’基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系及程序采用1.2中所介紹的體系及程序，擴(kuò)增程序依據(jù)引物的退火溫度和擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度略作改動(dòng)。

1.2.3 生物信息學(xué)分析利用OFR Finder在線分析工具分析MaPP2C8 cDNA序列的開放閱讀框，利用BioEdit 7.2分析MaPP2C8 CDS序列所編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，采用Mega7.0構(gòu)建MaPP2C8的系統(tǒng)進(jìn)化樹；使用WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)及SoftBerry ProtComp9.0(http://linux1.softberry.com/ berry.phtml)對(duì)MaPPCC-8進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)[16-17]；使用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/cgi-bin/ webface2. fcgi? jobid=600E2532000021E01EC0E49B& wait=20)對(duì)MaPP2C8蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)。采用在線分析軟件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)MaPP2C8啟動(dòng)子順勢(shì)作用元件進(jìn)行分析。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析桑樹MaPP2C8在干旱脅迫處理下的表達(dá)特性。以桑樹MaPP2C8 cDNA序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)1對(duì)MaPP2C8定量PCR引物，以桑樹Maβ-actin為內(nèi)參基因(表1)。qRT-PCR反應(yīng)在伯樂BioRad CFX96Touch實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，所有qRT-PCR反應(yīng)均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。qRT-PCR反應(yīng)總體系為10 μL：SsoFastTMEvaGreen?Supermix 5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，cDNA 0.5 μL，無RNA酶水H2O 3.5 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火5 s，40個(gè)循環(huán)。利用Bio-Rad ManagerTMSoftware (Version 1.1)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用2-ΔΔCT法計(jì)算MaPP2C8的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 MaPP2C8基因的克隆及序列分析

從‘德果1號(hào)’cDNA中克隆獲得一段約1 300 bp的條帶，對(duì)其進(jìn)行回收、TA克隆、PCR鑒定及測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，該條帶全長(zhǎng)為1 309 bp。將該序列與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的MaPP2C8參考序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，該序列為MaPP2C8的cDNA序列。其編碼的氨基酸與核苷酸序列對(duì)應(yīng)關(guān)系如圖1所示。MaPP2C8 CDS序列中A+T含量為44.25%，G+C含量為55.75%，共編碼350個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為37.96 kD，等電點(diǎn)為5.099。其氨基酸殘基中共含有48個(gè)帶正電氨基酸，57個(gè)帶負(fù)電氨基酸，116個(gè)疏水氨基酸，69個(gè)極性氨基酸。采用SignalP 4.1 Server對(duì)MaPP2C8蛋白信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)，該蛋白無信號(hào)肽序列，為非分泌蛋白。

圖1 MaPP2C8核苷酸序列及其氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and amino acid sequences of MaPP2C8

2.2 MaPP2C8進(jìn)化樹分析

采用Mega7.0構(gòu)建桑樹MaPP2C8及NCBI中已報(bào)道的19個(gè)PP2C蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)，結(jié)果表明，桑樹MaPP2C8與大麻、番木瓜的親緣關(guān)系較近，其中與同屬于?？频拇舐橛H緣關(guān)系最近，這進(jìn)一步明確了MaPP2C8屬于桑樹PP2C基因家族成員。

圖2 MaPP2C8與其他植物PP2C家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree analysis between MaPP2C8 and PP2C family members of other plants

2.3 MaPP2C8在PP2Cs基因家族中分支分析

在NCBI中進(jìn)一步查詢擬南芥中已報(bào)道的擬南芥AtPP2Cs家族成員，采用Mega7.0對(duì)MaPP2C8在PP2Cs基因家族中的歸屬分支進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，MaPP2C8與其他擬南芥PP2C蛋白分為12個(gè)亞族(A-L)，MaPP2C8與A亞族成員聚為一類(圖3)，這進(jìn)一步為將來研究MaPP2C8基因的功能提供了參考。

圖3 MaPP2C8蛋白與擬南芥(At)PP2C蛋白的進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of MaPP2C8 with PP2C proteins from Arabidopsis(At)

2.4 MaPP2C8亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

采用SoftBerry ProtComp9.0(Plant)對(duì)MaPP2C8蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)，MaPP2C8蛋白可能存在于細(xì)胞中的多個(gè)位置，如細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞膜，表明MaPP2C8在細(xì)胞中的作用范圍廣泛，對(duì)各種脅迫的響應(yīng)速度快。采用WoLFPSORT進(jìn)一步對(duì)MaPP2C8蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，MaPP2C8同樣定位于細(xì)胞中的多個(gè)位置。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[18-19]，推測(cè)MaPP2C8可能分布于細(xì)胞中的多個(gè)位置，如細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及細(xì)胞膜等。

2.5 MaPP2C8啟動(dòng)子克隆及序列分析

依據(jù)NCBI中報(bào)道的桑樹基因組序列為參考序列設(shè)計(jì)MaPP2C8啟動(dòng)子克隆引物，以‘德果1號(hào)’基因組DNA為模板，克隆獲得MaPP2C8起始密碼子上游一段大小為1 612 bp的序列，采用Plant-CARE在線軟件對(duì)MaPP2C8啟動(dòng)子序列中的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，MaPP2C8啟動(dòng)子序列中含有激素響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件及防御與脅迫響應(yīng)元件(表2)。激素響應(yīng)元件包括脫落酸響應(yīng)元件ABRE、茉莉酸響應(yīng)元件(CGTCA-motif和TGA-CG-motif)及水楊酸響應(yīng)元件(TCA-element)；光響應(yīng)元件包括Box 4、G-Box、Gap-box、MRE、Sp1、TCCC-motif；防御與脅迫響應(yīng)元件包括TC-rich repeats。以上結(jié)果表明MaPP2C8 基因的表達(dá)可能受到這些因素誘導(dǎo)。

不同小寫字母表示0.05水平上存在差異顯著圖4 MaPP2C8在干旱脅迫處理下的表達(dá)分析Different lowercase letters mean significant differences at 0.05 levelFig.4 The expression analysis of MaPP2C8 gene under drought stress

表2 MaPP2C8啟動(dòng)子順式作用元件

2.6 MaPP2C8對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)

采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)桑樹MaPP2C8在干旱脅迫下的表達(dá)特性。結(jié)果(圖4)顯示，MaPP2C8基因的表達(dá)受干旱脅迫強(qiáng)誘導(dǎo)，重度干旱時(shí)，MaPP2C8表達(dá)量達(dá)到最高水平。在重度干旱脅迫后，給予復(fù)水處理，并對(duì)MaPP2C8的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，MaPP2C8的表達(dá)量顯著下降。以上結(jié)果表明，MaPP2C8可能參與了桑樹對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。

3 討 論

桑樹雖具有強(qiáng)的適應(yīng)性，但在中國干旱給桑樹產(chǎn)業(yè)所帶來的損失僅次于病蟲害[20]。干旱脅迫下，對(duì)不同抗性桑樹品種的生理生化特性研究發(fā)現(xiàn)，抗性高的品種，其SOD、POD、CAT等酶的活性顯著高于低抗性品種，而造成這一現(xiàn)象的根本原因是基因調(diào)控層面[21]。植物PP2Cs基因家族含有多個(gè)成員，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過程的多個(gè)環(huán)節(jié)，如根系發(fā)育、葉片衰老、氣孔發(fā)育、種子萌發(fā)、花粉萌發(fā)等，且在植物應(yīng)答生物與非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用[22]。Shazadee等[23]采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)棉花30個(gè)GhPP2Cs基因進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，這些基因在棉花響應(yīng)高溫、低溫、干旱、鹽等脅迫時(shí)起到重要的作用。在模式植物擬南芥中，已鑒定出80個(gè)PP2Cs成員，研究人員依據(jù)PP2Cs蛋白結(jié)構(gòu)的不同，將其分為12個(gè)亞群(A-L)[11, 24]。Yu等[25]對(duì)小麥A亞族基因PP2C-a10進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)擬南芥中異源表達(dá)小麥PP2C-a10顯著提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的萌發(fā)率，降低了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)干旱脅迫的抗性。He等[14]對(duì)玉米A亞族基因ZmPP2C-A2和ZmPP2C-A6在多種非生物脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，并在擬南芥中對(duì)其功能進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，ZmPP2C-A2和ZmPP2C-A6在干旱、鹽、ABA等脅迫條件下表達(dá)量顯著增加，過表達(dá)ZmPP2C-A2和ZmPP2C-A6基因降低了擬南芥對(duì)干旱的抗性。以上均表明，PP2Cs基因家族成員在植物脅迫響應(yīng)中具有重要調(diào)控作用。為此，本研究克隆了桑樹MaPP2Cs家族成員MaPP2C8基因，以期為桑樹的抗性育種提供基因資源。在對(duì)桑樹MaPP2C8的分支歸屬進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，MaPP2C8歸屬于PP2Cs基因家族中的A亞族。此外，在對(duì)干旱脅迫下MaPP2C8基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，MaPP2C8受干旱脅迫的強(qiáng)誘導(dǎo)，并且有趣的是，復(fù)水處理后MaPP2C8的表達(dá)量又顯著降低，這些結(jié)果暗示著桑樹MaPP2C8基因可能和其他A亞族基因一樣參與了對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。然而，這種響應(yīng)機(jī)制還有待通過過表達(dá)MaPP2C8基因等實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步研究。

植物激素ABA在提高植物對(duì)干旱等非生物脅迫的耐受水平方面發(fā)揮重要作用[26]。研究表明，多數(shù)PP2Cs基因在植物ABA信號(hào)通路中起重要調(diào)節(jié)作用，ABA與其受體(PYR、PYL、RCAR等)結(jié)合，抑制PP2Cs活性，使得SnRK2得到釋放，釋放的SnRK2激活A(yù)BF、AREB及ABI5等轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)節(jié)ABA響應(yīng)基因的表達(dá)水平，調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)，響應(yīng)外界脅迫[8, 27-28]。啟動(dòng)子在基因表達(dá)調(diào)控過程中起重要的作用[29]。為探討MaPP2C8基因表達(dá)與ABA之間的調(diào)控關(guān)系，本研究對(duì)MaPP2C8基因的啟動(dòng)子進(jìn)行了克隆，對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，MaPP2C8啟動(dòng)子中含有3個(gè)與ABA相關(guān)的元件ABRE，這暗示MaPP2C8的表達(dá)可能受ABA的誘導(dǎo)，因此，推測(cè)ABA可能通過誘導(dǎo)MaPP2C8的表達(dá)水平，進(jìn)而對(duì)下游基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，然而有關(guān)MaPP2C8的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究克隆獲得了桑樹MaPP2C8基因及其啟動(dòng)子序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和干旱脅迫應(yīng)答分析，本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究MaPP2C8基因的功能及利用MaPP2C8基因進(jìn)行桑樹抗旱育種奠定了基礎(chǔ)。