葡萄VvIQD10果形相關基因定位及其互作研究

余 欣，董 陽，劉 靜，農(nóng)慧蘭，鄭 煥，陶建敏

(南京農(nóng)業(yè)大學 園藝學院， 南京 210095)

葡萄(VitisL.)是一種被廣泛種植的水果作物[1]，可以為人類的日常飲食提供纖維素、維生素和抗氧化劑等豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[2]。這些豐富的營養(yǎng)成分是葡萄的內(nèi)在品質(zhì)，而葡萄的外在品質(zhì)對于水果作物葡萄來說也格外重要，果實形狀就是葡萄重要的外在品質(zhì)之一。多種多樣的葡萄果形，在一定程度上影響了葡萄的經(jīng)濟價值及消費選擇[3]。根據(jù)葡萄不同果形特性，將葡萄果粒形狀分為11種：扁圓形(obloid)、圓形(round)、近圓形(nearly round)、橢圓形(broad lipsoid)、長橢圓形(narrow lipsoid)、卵圓形(ovoid)、倒卵圓形(obovoid)、雞心形(heart-shape)、束腰形(waist shape)、彎形(curved shape)和圓柱形(cylindric)[4]。其中，彎形和束腰形品種屈指可數(shù)[4]，如‘美人指’為束腰形，‘金手指’為彎形[5]；而長橢圓形、倒卵圓形、扁圓形和雞心形等果形的品種數(shù)量較少，最為常見的是橢圓形[4]。果實是植物器官之一，而植物器官的形狀主要受單個細胞的幾何形狀及其細胞分裂和生長軸的方向控制，所有這些過程都高度依賴于微管(microtubules, MT)動力[6]。

IQ67結構域(IQ67 domain, IQD)蛋白家族是一種古老的鈣調(diào)素結合蛋白(calmodulin binding proteins, CaMBPs)，起源于陸地植物的早期進化過程[7]。擬南芥和水稻的IQD基因系統(tǒng)發(fā)育分析表明，主要的IQD基因譜系起源于單子葉和雙子葉植物分化之前[8]。IQD蛋白的顯著特征是具有較高的等電點和絲氨酸殘基頻率[8]，且編碼的IQD蛋白中包含67個保守氨基酸殘基的植物特異性結構域——IQ67結構域。IQ67結構域的特征是3種不同鈣調(diào)素募集基序(IQ、1-5-10和1-8-14)的獨特和重復排列。IQD蛋白家族被認為是潛在的控制微管動態(tài)性、穩(wěn)定性和組織性的微管相關網(wǎng)絡蛋白(microtubule-associated network protein, MAP)家族，對環(huán)境的適應性和植物的發(fā)育起重要作用。微管是細胞骨架的重要組成部分，微管相關蛋白網(wǎng)絡控制微管的動態(tài)性、穩(wěn)定性和組織性以生成各種微管陣列[9-10]，從而使細胞骨架形成一個高度動態(tài)的網(wǎng)絡。微管陣列作為結構支撐附著在質(zhì)膜(plasma membrane, PM)上[11]，并通過引導纖維素合成酶復合物(cellulose synthase complex, CSCs)來確定細胞擴張的方向[12]。微管細胞骨架還介導了不同物質(zhì)的胞內(nèi)運輸[13-14]，并且有助于胞吐作用[15-18]。研究表明，Ca2+信號的傳導可以激活細胞骨架組織相關蛋白鈣調(diào)蛋白/鈣調(diào)蛋白類蛋白(calmodulin/calmodulin-like proteins, CaM/CML)從而調(diào)節(jié)翻譯后的IQD功能[19]。Ca2+-CaM/CML信號參與了對細胞骨架組織的控制過程[20]。IQD蛋白可以在發(fā)育中的植物組織中根據(jù)環(huán)境變化解析相應激素(如生長素)水平和Ca2+水平變化，從而使微管分支和細胞骨架結構發(fā)生變化，指導細胞的伸長和擴張，最終驅(qū)動器官形狀變化[21]。在葡萄中，通過研究微管相關蛋白以解析果形變化分子機制的相關研究較少。

迄今為止，已經(jīng)在多個物種(擬南芥、水稻和番茄等)中鑒定出IQD基因家族，并報道了IQD基因家族中多個成員的功能[8, 22-28]。IQD家族基因不僅在果實等器官形狀的調(diào)控中起作用[29-32]，還在干旱和鹽脅迫等逆境響應[26-27]、赤霉素反應的負反饋調(diào)節(jié)[33]以及通過脫落酸信號通路調(diào)節(jié)種子的萌發(fā)[34]中起著重要作用，AtIQD1基因還被報道可以影響與硫代葡萄糖酸鹽代謝相關的多個基因的表達，起到對生物攻擊進行防御反應的作用[35]。據(jù)報道，在擬南芥和水稻中，IQD家族成員可以與CaM、CML和微管結合蛋白(KLCR1)及微管相關蛋白SPIRAL2(SPR2)相互作用，根據(jù)外源生長素和鈣離子轉(zhuǎn)運來調(diào)節(jié)微管結構[29, 36-37]。

番茄SUN/SlIQD12是IQ67結構域(IQD)蛋白質(zhì)家族成員[31, 38]。SUN/SlIQD12是控制番茄(Solanumlycopersicum)果實伸長的主要基因之一[30]，對果形的影響比OVATE基因要顯著[39]。張亞光等[3]利用番茄SUN基因，在美國國家生物信息中心(NCBI)中查找葡萄基因組中序列相似性最高的同源序列，命名為VvSUN。本研究在前人研究[31-32]基礎上，選擇葡萄IQD基因家族中與葡萄VvSUN基因以及番茄SUN基因具有較高同源性的VvIQD10基因，通過比較6個不同葡萄果形品種VvIQD10基因的表達量推測該基因可能和葡萄果形相關，從橢圓形品種葡萄‘天山’中克隆出VvIQD10基因，對其進行序列分析，并利用煙草瞬時表達技術對VvIQD10蛋白進行亞細胞定位，對VvIQD10蛋白及其靶蛋白鈣調(diào)素類蛋白(VvCML)互作關系進行研究，以期能夠從基因角度解析VvIQD10基因促進細胞伸長，進而導致葡萄果形變化的分子機理。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料采于南京農(nóng)業(yè)大學湯山葡萄試驗基地，以束腰形品種葡萄‘美人指’、彎腰形品種葡萄‘金手指’、長橢圓形品種葡萄‘天山’和‘魏可’、近圓形品種葡萄‘陽光玫瑰’和‘紅環(huán)’(圖1)開花期花序為試驗材料，采用平棚架避雨栽培，常規(guī)田間管理，以圓錐花序穗肩頂端小穗上一半的花開放為盛花期，分別在盛花期采集小穗，液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆?；煙草為本氏煙草，生長于22～24 ℃長日照條件(光照16 h/黑暗8 h)的溫室中。

圖1 不同果形的葡萄品種Fig.1 Grape varieties with different fruit shapes

實驗所需pCAMBIA1302-GFP植物表達載體、pGBKT7和pGADT7酵母載體、nEYFP和cEYFP雙分子熒光互補試驗(bimolecular fluorescence complementation test, BiFC)載體均為南京農(nóng)業(yè)大學果樹生物技術實驗室現(xiàn)有保存材料；酵母菌株誘餌菌株Y2H Gold和捕獲菌株Y187購自南京酶普利斯生物公司；大腸桿菌DH5α和根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105購于上海吐露港生物科技有限公司；中間載體pClone007 Blunt Simple購于北京擎科生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒和重組克隆試劑盒(ClonExpress?UltraOne Step Cloning Kit)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；金擔子素A(AbA)和α-半乳糖苷酶顯色底物(X-α-gal)購自翊圣生物科技(上海)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1VvIQD10基因表達分析利用植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN)分別提取‘美人指’、‘金手指’、‘天山’、‘魏可’、‘陽光玫瑰’和‘紅環(huán)’葡萄盛花期花序總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)進行cDNA合成。以cDNA為模板，使用Beacon Designer 7.0軟件(Premier Biosoft Internaition, USA)設計的引物(表1)進行熒光定量PCR分析。反應體系按SYBR Green PCR Master Mix (TaKaRa)說明書進行。以VvUbiquitin為內(nèi)參，由ABI 7300 system軟件完成試驗程序的操作和數(shù)據(jù)的導出，試驗數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法進行分析[40]，用Excel 2010和SPPSS 20.0軟件進行作圖和顯著性分析。

表1 本研究中的引物序列

1.2.2VvIQD10基因及VvCML基因的克隆在NCBI中查找與番茄SUN(SlIQD12)基因和葡萄VvSUN(VvIQD7)進化關系較近的葡萄基因組IQD家族成員VvIQD10(XM_010647400)序列[31-32]；查找相關文獻[36]，在NCBI中檢索與水稻基因組IQD家族中SUN同源基因OsIQD14的靶基因OsCaM1(XM_015766855.2)在葡萄中的同源基因VvCML(XM_003632182.3)。用‘天山’葡萄花期花序cDNA為模板進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的條帶，連接到pClone007 Blunt Simple載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α后進行鑒定并測序。

1.2.3VvIQD10基因的生物信息學分析利用BioXM軟件和ProtParam(https://web.expasy.org/prot param/)在線軟件對VvIQD10基因所編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進行分析；ProtScale(https://web. expasy.org/protscale/)和SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)分別分析蛋白質(zhì)的疏水性和信號肽；TMHMM Server v. 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/)預測蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域；SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page= npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https:// swissmodel.expasy.org/)在線軟件分別預測蛋白質(zhì)二、三級結構；Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)分析蛋白質(zhì)結構域；MEGA 10.0軟件構建系統(tǒng)進化樹；ClustalX軟件比對不同物種的氨基酸序列。

1.2.4VvIQD10基因的亞細胞定位分析使用pCAMBIA 1302-GFP植物表達載體，用DNA連接酶(TaKaRa)連接目的基因和載體，構建pCAMBIA 1302-GFP-VvIQD10瞬時表達載體。以空載體為陰性對照，通過熱擊法將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105中。將PCR檢測為陽性的菌液過夜培養(yǎng)至OD600為0.6后收集菌體。用含有10 mmol·L-1MES、10 mmol·L-1MgCl2、100 μmol·L-1乙酰丁香酮(As)的懸浮液重懸菌體至OD600為0.3，室溫避光孵育4 h。選擇長勢一致的4周齡本氏煙草，用無菌注射器吸取菌液注射，置于25 ℃的環(huán)境中(黑暗48 h/光照12 h)培養(yǎng)60 h，在Zeiss LSM 700激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白信號分布。

1.2.5 酵母雙雜交實驗根據(jù)重組克隆試劑盒說明書，構建誘餌載體pGBKT7-VvIQD10/VvCML、獵物載體pGADT7-VvIQD10/VvCML。將重組載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化Y2H Gold和Y187酵母菌株，30 ℃暗培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落生長狀況，檢測重組質(zhì)粒對酵母的毒性作用；觀察Y2H Gold[pGBKT7-VvIQD10/VvCML]在不同濃度(0、50、100、150和200 μL/mL)AbA的SD/-Trp固體培養(yǎng)基上的生長狀況進行誘餌載體的抗性篩選；將Y2H Gold[pGBKT7-VvIQD10/VvCML]涂布在SD/-Trp、SD/-Trp-Leu、SD/-Trp/X-α-gal、SD/-Trp/X-α-gal/AbA固體培養(yǎng)基上，Y187[pGADT7-VvIQD10/VvCML]涂布在SD/-Leu、SD/-Trp-Leu、SD/-Leu/X-α-gal、SD/-Leu/X-α-gal/AbA固體培養(yǎng)基上，觀察菌落生長狀況以判斷重組質(zhì)粒是否具有轉(zhuǎn)錄自激活活性。在雙雜交實驗中，將誘餌質(zhì)粒和獵物質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化進Y2H Gold酵母菌株，涂布于SD/-Trp-Leu固體培養(yǎng)基，30 ℃暗培養(yǎng)3～5 d。待菌落長出后，將共轉(zhuǎn)化成功的陽性單菌落挑出，加入SD/-Trp-Leu液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)12～15 h，稀釋至OD600為0.2時再依次稀釋5倍、50倍，取2 μL點到SD/-Trp-Leu-His-Ade、SD/-Trp-Leu-His-Ade/AbA/X-α-gal培養(yǎng)基上，30 ℃暗培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落生長情況。

1.2.6 雙分子熒光互補試驗構建雙分子熒光瞬時表達載體VvIQD10/VvCML-cEYFP和VvIQD10/VvCML-nEYFP。將構建好的載體與空載兩兩組合瞬時侵染煙草表皮細胞，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化、侵染方法及觀察同VvIQD10基因的亞細胞定位實驗。

2 結果與分析

2.1 不同葡萄品種的VvIQD10基因PCR分析

以‘美人指’、‘金手指’、‘天山’、‘魏可’、‘紅環(huán)’和‘陽光玫瑰’葡萄盛花期花序cDNA為模板，分別進行實時熒光定量PCR分析。結果(圖2)顯示，VvIQD10基因在不同果形葡萄品種中均有表達。果形相對較長的‘美人指’、‘金手指’、‘天山’和‘魏可’表達量較高，近圓形品種‘陽光玫瑰’和‘紅環(huán)’的基因表達量明顯較低。

Sm.陽光玫瑰;Rr.紅環(huán);Gf.金手指;Wi.魏可;Ti.天山;Mf.美人指。不同字母表示品種間差異顯著(P<0.05)圖2 不同葡萄品種中VvIQD10基因的表達Sm. Shine muscat; Rr. Red ring; Gf. Gold finger; Wi. Wink; Ti. Tianshan; Mf. Manicure finger. Different letters mean significant differences in different grape varieties at 0.05 levelFig.2 Expression of VvIQD10 gene in different grape varieties

2.2 葡萄VvIQD10、VvCML基因的克隆和VvIQD10基因序列分析

以‘天山’葡萄為材料，擴增出VvCML，片段長度為450 bp(圖3，A)。進一步克隆出了VvIQD10(圖3，B)，測序并通過DNAMAN 8.0軟件將得到的序列與預測序列(XM_010655617.1)進行比對，結果顯示CDS區(qū)序列長度一致，長度為1 401 bp。起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG(圖4)。與NCBI中相比，第354位、510位、799位、814位核苷酸發(fā)生突變，分別由CAT、AGT、ATC、GAA突變成AAT、GGT、GTC、CAA，前兩者編碼的氨基酸并沒有發(fā)生變化，而后兩者編碼的氨基酸分別由異亮氨酸、谷氨酸轉(zhuǎn)變成纈氨酸和谷氨酰胺(圖4)。

M.DL2000；1. VvIQD10；2-4. VvCML 圖3 VvCML基因和VvIQD10基因克隆結果Fig.3 The result of VvCML and VvIQD10 gene cloning

ATG. 起始密碼子；TAG. 終止密碼子；方框內(nèi)為突變位點圖4 VvIQD10基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列ATG. Start codon；TAG. Stop codon；The mutation sites are in the boxFig.4 Nucleotide sequence and amino acid sequence of VvIQD10 gene

2.3 葡萄VvIQD10蛋白分析

VvIQD10基因編碼蛋白質(zhì)由466個氨基酸組成，其中酸性氨基酸有56個，堿性氨基酸有85個。預測編碼產(chǎn)物分子量為52.94 kD，等電點為10.64，不穩(wěn)定系數(shù)為80.25，為不穩(wěn)定親水性蛋白。SignalP 4.0預測結果顯示該蛋白無信號肽。用TMHMM Server V. 2.0在線軟件對跨膜結構進行預測發(fā)現(xiàn)該蛋白不具有跨膜區(qū)域。Pfam數(shù)據(jù)庫分析顯示，VvIQD10蛋白第136～154、160～174氨基酸位點為IQ基序，第354～428位點為未知功能的DUF4005結構域，第381～426位點和第236～326位點分別為具有類IQ基序的融合蛋白IQCJ-SCHIP1 和NADH泛醌氧化還原酶亞單位NDUFA12。結合相關文獻[3,8]查找分析相關基序，發(fā)現(xiàn)其具有包含2個IQ基序、3個1-5-10基序以及2個1-8-14基序的IQ67結構域(圖6)。二級結構預測結果顯示VvIQD10蛋白由46.78%的α螺旋，50.21%的隨機卷曲，2.58%的β折疊和0.43%的β轉(zhuǎn)角組成。三級結構預測顯示該蛋白由一個PDB號為2dfs.1.A的結構為模板建立，序列的相似性為0.3，范圍為134～194 aa，在IQ67結構域所包含的區(qū)域內(nèi)。

圖5 葡萄和其他物種IQD蛋白的氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of amino acid sequences of IQD protein in grape and other species

圖6 VvIQD10基因中IQ67基序分析Fig.6 Analysis of IQ67 motif in VvIQD10 gene

用MEGA 10.0制作進化樹，將VvIQD10蛋白和其他物種的IQD蛋白進行比對，發(fā)現(xiàn)該蛋白與獼猴桃同源蛋白的親緣關系最近，和擬南芥、豌豆及甜橙等植物的親緣關系較遠(圖5)。ClustalX比對分析后得出VvIQD10編碼的氨基酸序列與多種植物的相似度在43.29%～62.34%之間，IQ67結構域在不同物種間較為保守(圖7)。

XP_030962527.1. 大葉櫟；XP_004229688.1. 番茄；XP_035545843.1. 胡桃；XP_017984100.1. 可可；XP_008231519.1. 梅；PSS09955.1. 獼猴桃；NP_196850.1. 擬南芥；KDO83249.1. 甜橙；KAF3653480.1. 甜椒；XP_029125524.1. 木豆；XP_016482094.1. 煙草；XP_015881920.1. 棗；黑色方框內(nèi)為IQ67結構域圖7 葡萄VvIQD10蛋白和其他物種IQD蛋白的氨基酸序列比對XP_030962527.1. Quercus lobata; XP_004229688.1. Solanum lycopersicum; XP_035545843.1. Juglans regia; XP_017984100.1. Theobroma cacao; XP_008231519.1. Prunus mume; PSS09955.1. Actinidia chinensis var. chinensis; NP_196850.1. Arabidopsis thaliana; KDO83249.1. Citrus sinensis; KAF3653480.1. Capsicum annuum; XP_029125524.1. Cajanus cajan；XP_016482094.1. Nicotiana tabacum; XP_015881920.1. Ziziphus jujuba; In the box is the IQ67 domainFig.7 Amino acid sequence alignment of grape VvIQD10 protein and other IQD proteins

Bar = 35 μm，下同圖8 VvIQD10蛋白在煙草葉片表皮細胞中的亞細胞定位Bar = 35 μm, the same as belowFig.8 Subcellular localization of VvIQD10 protein in tobacco leaf cells

2.4 VvIQD10蛋白亞細胞定位

為研究VvIQD10蛋白在細胞中的分布情況，在煙草表皮細胞中進行亞細胞定位實驗。構建表達載體pCAMBIA 1302-GFP-VvIQD10，瞬時轉(zhuǎn)化煙草。結果表明，VvIQD10蛋白在煙草表皮細胞的細胞質(zhì)和細胞膜中都有分布，在細胞中可見微管清晰的絲狀結構。而在以pCAMBIA 1302空載體轉(zhuǎn)化的對照組中，綠色熒光蛋白在細胞的各個部位都有分布(圖8)。由此可初步判定，VvIQD10蛋白主要定位于微管和質(zhì)膜。

2.5 VvIQD10和VvCML蛋白互作驗證

為驗證VvIQD10基因在植物細胞中所起的作用，構建了誘餌載體pGBKT7-VvIQD10/VvCML、獵物載體pGADT7-VvIQD10/VvCML。將重組載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵母菌株后進行重組質(zhì)粒的毒性檢測和自激活檢測，證明重組誘餌質(zhì)粒和獵物質(zhì)粒均對酵母沒有毒性作用，且pGADT7-VvIQD10、pGADT7-VvCML不具有轉(zhuǎn)錄激活活性；為抑制誘餌載體酵母生長，通過抗性篩選后選擇150 μL/mL AbA濃度為抑制誘餌載體pGBKT7-VvCML酵母生長最佳濃度，200 μL/mL AbA濃度為抑制誘餌載體pGBKT7-VvIQD10酵母生長最佳濃度。雙雜交實驗結果顯示，誘餌載體和獵物載體共轉(zhuǎn)化的Y2H Gold酵母菌株能在SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上長出白色單菌落；Y2H Gold [pGADT7-VvIQD10+pGBKT7-VvCML]、Y2H Gold [pGADT7-VvCML+pGBKT7-VvIQD10]和陽性對照在SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His、SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His/X-a-gal/AbA培養(yǎng)基上能夠生長，且在SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His/X-a-gal/AbA培養(yǎng)基上長出藍色單菌落，而陰性對照在這兩種培養(yǎng)基上不能夠生長。說明蛋白VvIQD10與蛋白VvCML之間存在互作(圖9)。

2.6 雙分子熒光互補試驗

為驗證酵母雙雜交的蛋白質(zhì)互作結果，構建重組載體VvIQD10/VvCML-cEYFP和VvIQD10/VvCML-nEYFP以進行雙分子熒光互補試驗。將重組載體和空載體兩兩組合共轉(zhuǎn)化煙草表皮細胞，利用共聚焦顯微鏡觀察黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein, YFP)熒光圖像，分別在光、明場和融合場中拍攝黃色熒光部位(圖10)。結果表明，VvIQD10和VvCML蛋白間存在互作，此結果與酵母雙雜交結果一致。并且，VvIQD10蛋白和VvCML蛋白主要在微管和質(zhì)膜中互作，這和VvIQD10基因的亞細胞定位結果相吻合。

圖10 煙草表皮細胞中VvCML蛋白與VvIQD10蛋白相互作用的BiFC分析Fig.10 BiFC analysis of the interactions among VvCML protein and VvIQD10 in tobacco epidermal cells

3 討 論

本試驗選取和葡萄VvSUN基因以及番茄SUN基因相似性較高的基因VvIQD10，通過比較6個不同葡萄果形品種VvIQD10基因的表達量推測該基因可能和葡萄果形相關，并在橢圓形葡萄品種‘天山’中克隆出該序列。與NCBI中預測基因相比，克隆出的VvIQD10基因發(fā)生了點突變，但突變位點不在功能結構域內(nèi)，這可能是由于測序品種和試驗品種不同造成的。通過分析VvIQD10蛋白的理化特性，發(fā)現(xiàn)其具有較高等電點，這和IQD家族蛋白的性質(zhì)相吻合，其具有較高等電點可能是IQD蛋白與微管和質(zhì)膜通過靜電相互作用所必須具備的條件[29]。對VvIQD10蛋白的功能域IQ67結構域分析發(fā)現(xiàn)，其所含的基序種類和數(shù)目與VvSUN相同[3]，但基序所包含的部分氨基酸種類發(fā)生了變化，這一變化可能影響蛋白的表達途徑和作用強度。多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析結果顯示，在葡萄、獼猴桃、煙草、番茄、甜椒、擬南芥、可可、梅、棗、胡桃和甜橙等十多種植物中，VvIQD10基因與獼猴桃同源基因親緣關系最近，并且在13種植物中具有相似的保守結構域，說明IQD基因功能是相對保守的。

農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化煙草細胞瞬時表達結果顯示，VvIQD10蛋白同時定位于微管(MT)和質(zhì)膜(PM)，說明此基因編碼的產(chǎn)物不僅在MT上有功能，而且在PM上起作用。前人研究表明，IQD蛋白是植物中PM子結構域的組成部分，它們可能將CaM/CML介導的Ca2+信號局部限制在PM中的特定位置，并在空間上將功能不同的CaM/CML信號模塊分開[29]。

為進一步驗證VvIQD10蛋白在微管和質(zhì)膜上的作用，對其進行蛋白質(zhì)互作實驗。酵母雙雜交和雙分子熒光互補試驗表明，VvIQD10蛋白可以和細胞骨架組織相關蛋白VvCML在微管和質(zhì)膜中發(fā)生互作。IQD蛋白可能通過S-?；饔酶街赑M上，將IQD-CaM/CML復合物錨定在Ca2+通道入口處來激活通道。通道被激活后，在通道入口處附近產(chǎn)生陡峭的游離Ca2+濃度梯度，引起Ca2+傳感器蛋白(CaM/CML)的激活。相關研究推測，與被激活的IQD信號復合物相結合的蛋白可能是驅(qū)動蛋白輕鏈相關(kinesin light chain-related, KLCR)/纖維素-微管解偶聯(lián)(cellulose-microtubule uncoupling, CMU)蛋白家族的成員[7, 41-42]。KLCR / CMU可以在MT和PM的連接處通過抵抗MT對纖維素合酶復合物(CSCs)的推動力來增加MT的穩(wěn)定性[43]，并可能間接影響纖維素沉積。

由此可以推出，葡萄VvIQD10蛋白在特定的PM子結構域中和鈣調(diào)蛋白類蛋白(CML)結合，形成VvIQD10-VvCML復合物，激活Ca2+通道后形成的Ca2+濃度梯度使VvCML被激活。隨后，VvIQD10-VvCML復合物與微管結合蛋白結合(KLCR/CMU)，來參與對細胞骨架組織的控制，從而改變微管分支和細胞骨架結構，指導細胞的伸長和擴張，最終使植物器官形狀發(fā)生變化。根據(jù)前人對葡萄VvSUN基因超表達促進番茄果形變長的研究[32]，再根據(jù)本試驗中對與VvSUN基因同一家族中同源性較高的VvIQD10基因功能的研究結果，推測VvIQD10可能也在葡萄果實形狀變化中起著至關重要的作用，但具體功能還需進行超表達和基因沉默來進一步驗證。