互利素與白蛾周氏嚙小蜂氣味結(jié)合蛋白的分子對接

韓佳怡，郭美琪，王 靜，金 欣，劉新宇，覃東玉，王永輝，潘麗娜，李 敏

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津師范大學(xué)天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387；3.天津師范大學(xué)天津動物多樣性保護與利用重點實驗室，天津300387；4.漯河市豫中南林業(yè)有害生物天敵繁育研究中心，河南漯河462300）

在自然界中，植食性昆蟲取食植物，天敵又寄生或捕食植食性昆蟲，三者構(gòu)成了微妙的三級營養(yǎng)結(jié)構(gòu).除因營養(yǎng)需要而建立的食物網(wǎng)外，植物、植食性昆蟲和天敵三者之間還存在著通過信息化合物（infochemical或semiochemicals）傳遞而建立起來的信息化合物網(wǎng)[1].近年來國內(nèi)外對植物-害蟲-天敵三級營養(yǎng)之間的化學(xué)通訊進行了大量研究[2]，其中，利它素（kairomones）和互利素（synomone）是目前研究較多的兩類信息化合物[3].互利素是當植物遭受機械損傷或植食性昆蟲的攻擊時釋放的一系列復(fù)雜的揮發(fā)性物質(zhì)，這些揮發(fā)性物質(zhì)可作為植食性昆蟲天敵的引誘劑，為其提供有價值的信息，主要組分有綠葉性氣味化合物（醛、醇及其酷類）、蔽類化合物（主要是單蔽、倍半路及其衍生物）、含氮化合物等[4].探明信息化合物的組成是研究化學(xué)通訊的先決，也是三級營養(yǎng)關(guān)系領(lǐng)域研究的熱點[3].在自然條件下，大量混合化合物中往往只有一種或少數(shù)幾種被證實對于寄生性天敵具有引誘活性[5].通過鑒定對寄生性天敵有引誘作用的利它素的化學(xué)成分，可為明確天敵尋找和定位寄主的機制奠定基礎(chǔ)，為進一步研制誘劑提供支持.通過設(shè)置誘劑招引寄生性天敵到林間并使之滯留于生境內(nèi)，將有利于寄生性天敵分散產(chǎn)卵、增強天敵寄生率，從而使其在蟲害綜合治理中發(fā)揮更大的作用[6-7].

分子對接技術(shù)是通過構(gòu)建蛋白質(zhì)與小分子化合物的三維結(jié)構(gòu)并將其優(yōu)化，再將小分子化合物匹配到蛋白質(zhì)的結(jié)合位點上，并評價其結(jié)合力強弱的一種生物分析技術(shù)[8].分子對接理論將配體與受體的結(jié)合視為剛性過程，即配體和受體的三維結(jié)構(gòu)在結(jié)合過程中不發(fā)生改變[9-10].目前，分子對接理論在昆蟲化學(xué)感受領(lǐng)域中的應(yīng)用備受關(guān)注[11]，如在中華蜜蜂（Apiscerana）[12]、蝽科（Pentatomidae）[13]、斜紋夜蛾（Spodoptera lituraFabricius）等類群內(nèi)，化學(xué)感受途徑中重要的化學(xué)感受蛋白odorant binding proteins（OBPs）與小分子信息化合物結(jié)合的功能預(yù)測.

白蛾周氏嚙小蜂（Chouioia cuneaYang）是入侵害蟲美國白蛾（Hyphantria cunea）蛹期重要的寄生性天敵，在疫區(qū)通過人工釋放該蜂可以對美國白蛾的自然控制起到關(guān)鍵作用[14]，在我國很多地區(qū)都開展了利用白蛾周氏嚙小蜂的生防研究工作，均已取得較好的效果[15].目前對白蛾周氏嚙小蜂的繁育技術(shù)和林間釋放技術(shù)等方面已進行了較深入研究，但對其嗅覺機制的研究較少.本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，白蛾周氏嚙小蜂對美國白蛾取食后的泡桐（Paulownia fortunei（Seem.）Hemsl）葉片的揮發(fā)物具有顯著偏好性，經(jīng)Gas chromatography-Antennal potential（GC-EAD）和Gas chromato-graphy-Mass spectrometry（GC-MS）測定了泡桐互利素成分，發(fā)現(xiàn)正十三烷和正十四烷可以引起雌性白蛾周氏嚙小蜂顯著的觸角電位反應(yīng)（未發(fā)表數(shù)據(jù)）.為了探究白蛾周氏嚙小蜂對互利素的識別機制，本研究將2種互利素成分與白蛾周氏嚙小蜂觸角中發(fā)現(xiàn)的所有25個氣味結(jié)合蛋白[16]進行分子對接.一方面，研究結(jié)果將為寄生性天敵昆蟲的嗅覺機制，尤其是蛹寄生蜂的嗅覺機制研究積累材料；另一方面，通過探明白蛾周氏嚙小蜂的互利素識別機制，可以為研發(fā)引誘劑、提高白蛾周氏嚙小蜂的寄生率、更好地利用白蛾周氏嚙小蜂防治美國白蛾等害蟲提供技術(shù)支持.

1 材料和方法

1.1 昆蟲飼養(yǎng)

美國白蛾幼蟲2019年9月采自于天津師范大學(xué)，放置于溫度（25±1）℃、濕度55%、光照周期為16L∶8D的恒溫人工氣候箱（中儀國科北京PQX-350H人工氣候箱）中培養(yǎng)至五齡幼蟲.每天于8：00、16：00分別檢查1次，以飼料喂養(yǎng)，并清理剩余飼料和糞便.白蛾周氏嚙小蜂為本實驗室傳代培養(yǎng)蜂種.

1.2 小分子配體和蛋白質(zhì)前提準備

互利素十三烷、十四烷的小分子配體由Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載獲得，并在Discovery Studio 4.5 Visualizer（bioviaInc，San Diego，CA，USA）軟件中合并配體結(jié)構(gòu).在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中查找25個OBPs的FASTA序列.將FASTA序列導(dǎo)入Swiss-Model（http：//swissmodel.expasy.org/）建模，并下載蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型存為PDB格式.建模后利用Ramachandran plot進行模型評價.落在允許區(qū)和最大允許區(qū)的氨基酸殘基占蛋白總體氨基酸殘基的比例高于90%，即可認為同源建模所得模型的構(gòu)象合理[17].

1.3 蛋白質(zhì)結(jié)合位點的搜索

在Discovery Studio 4.5中打開蛋白質(zhì)的PDB文件，蛋白質(zhì)晶體中含有氫原子即可不必加氫，否則點擊Chemistry/Hydrogens/Add進行加氫.Receptor-Ligand Interactions/Define and Edit Binding Site，選擇Define Site/From Receptor Cavities，搜尋蛋白質(zhì)可與小分子配體結(jié)合的“口袋”.

1.4 蛋白配體復(fù)合物的構(gòu)象搜索

采用Discovery Studio 4.5確定蛋白與配體相互作用的對接模型中蛋白與配體的結(jié)合坐標，將蛋白質(zhì)結(jié)合空間的三點坐標輸入Schrodinger Suites 2015-2（Schrodinger Software Inc，Cambridge，MA，USA）中Maestro壓縮包程序，并導(dǎo)入小分子配體結(jié)構(gòu).選擇Task/Conformational search/Bioactive search/Standard，搜索小分子配體所有同分異構(gòu)體的可能性，利用Maestro程序觀察對接過程.

1.5 分子對接結(jié)果的評估

對接結(jié)束后，以Docking-score評價對接結(jié)果.負數(shù)的絕對值越大代表結(jié)合效果越明顯.選擇結(jié)合效果最明顯的小分子配體與蛋白進行結(jié)合，選擇Show receptorligand interactions on a 2Ddiagram下的Show 2DDiagram，即可得到蛋白質(zhì)-配體二維互作平面圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)建模結(jié)果

在NCBI上搜索白蛾周氏嚙小蜂全部25個CcOBPs的序列，并在Swiss-Model中建立25個蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型，建模結(jié)果如圖1所示.

圖1 CcOBP1～CcOBP25的三維結(jié)構(gòu)模型Fig.1 Three-dimensional structure model from CcOBP1 to CcOBP25

2.2 三維結(jié)構(gòu)模型評價結(jié)果

用拉式構(gòu)象（Ramachandran）圖評價CcOBP1～CcOBP25三維結(jié)構(gòu)模型的合理性，結(jié)果如表1所示.

表1 拉氏圖評價氨基酸殘基合理性Tab.1 Rational evaluation of the amino acid residue by Ramachandran plot %

落在最佳區(qū)域的氨基酸殘基大于90%即認為所構(gòu)建的三維結(jié)構(gòu)模型是合理的，因此判定CcOBP1、CcOBP2、CcOBP3、CcOBP5、CcOBP9、CcOBP10、CcOBP11、CcOBP12、CcOBP13、CcOBP14、CcOBP15、CcOBP19、CcOBP20、CcOBP22、CcOBP23和CcOBP24的三維結(jié)構(gòu)模型是合理的，可以進行后續(xù)實驗.

2.3 分子對接結(jié)果

以Docking-score評價對接效果，所得對接結(jié)果如表2所示.由表2可以看出，十三烷與CcOBP19的結(jié)合特性最好，結(jié)合過程如圖2所示.CcOBP19的Ile-29、Met-78、Val-89、Met-96、Val-97、Val-109、Cys-112和Ile-143與十三烷通過碳碳鍵進行結(jié)合；Leu-33、Tyr-73、Met-76、Val-78、Leu-86、Gln-92、Ile-93、Met-105、Ile-108、Leu-130、Ser-131和Phe-134通過范德華力與十三烷進行結(jié)合.CcOBP23與十三烷的結(jié)合能力僅次于CcOBP19.CcOBP23的Tyr-73、Val-78、Ile-79、Ile-84、Val-89、Val-97、Leu-130和Ile-143與十三烷通過碳碳鍵進行結(jié)合.

圖2 十三烷與CcOBP19和CcOBP23分子對接結(jié)果Fig.2 Docking results of tridecane with CcOBP19 and CcOBP23

表2 氣味結(jié)合蛋白與十三烷、十四烷的分子對接系數(shù)Tab.2 Molecular docking score of odorant binding proteins to tridecane and tetradecane

十四烷與CcOBP23的結(jié)合能力最強，結(jié)合過程如圖3所示，CcOBP23中的Tyr-73通過π-π鍵與十四烷結(jié)合.CcOBP19與十四烷的結(jié)合能力僅次于CcOBP23，CcOBP19的Ile-29、Val-89、Met-96、Val-97、Val-109、Cys-112和Ile-143與十四烷通過碳碳鍵進行結(jié)合；Leu-33、Tyr-73、Met-76、Val-78、Ile-84、Leu-86、Gln-92、Ile-93、Pro-98、Met-105、Ile-108、Leu-130、Ser-131和Phe-134通過范德華力與十四烷進行結(jié)合.

圖3 十四烷與CcOBP23和CcOBP19分子對接結(jié)果Fig.3 Docking results of tetradecane with CcOBP23 and CcOBP19

3 討論與結(jié)論

互利素是一種對產(chǎn)生者和接受者都有益的化學(xué)物質(zhì)，寄生性天敵和捕食性天敵在尋找寄主時會對寄主棲境進行定位和評價，使其做出抉擇的第一步中可能就是植物源互利素作為化學(xué)信號在起作用[18].因此互利素在植食性昆蟲與其天敵尋食行為中有著重要作用，如十字花科蔬菜受到小菜蛾（Plutella xylostella（Linnaeus））幼蟲侵害后大量釋放辛醛和壬醛，對天敵昆蟲腰帶長體繭蜂（Macrocentrus cingulum）、中紅側(cè)溝繭蜂（Microplitis mediator）、草間小黑蛛（Hylyphantes graminicola）、南方小花蝽（Orius similisZheng）等均有顯著吸引作用[19-21].茶樹受到灰茶尺蠖（Ectropis grisescens）害蟲脅迫時，揮發(fā)物中檢出苯甲醛、反-2-癸烯醛、4-庚烯醛、吲哚和反-2-己烯醛的含量均顯著增加，經(jīng)生物學(xué)驗證反-2-癸烯醛、4-庚烯醛和吲哚對于茶尺蠖絨繭蜂（Apantelessp.）有明顯引誘效應(yīng)，從而減少灰茶尺蠖對茶樹的危害[22].本課題組前期利用Y型嗅覺儀實驗證明了當寄主植物泡桐遭到美國白蛾幼蟲危害時，受到損害的葉片部分會釋放出對其天敵—白蛾周氏嚙小蜂有吸引作用的互利素.利用頂空采集法收集了泡桐葉片未遭遇蟲害和蟲害后葉片的揮發(fā)物，通過GC-MS結(jié)合GC-EAD對揮發(fā)物成分進行分析，結(jié)果表明，被美國白蛾取食后泡桐葉片釋放出的正十三烷和十四烷可以引起白蛾周氏嚙小蜂顯著的觸角電位反應(yīng).十三烷和十四烷多見于一些植物自然揮發(fā)物的研究報道中.如AM真菌介導(dǎo)垂穗披堿草（Elymus nutansGriseb.）釋放出十四烷趨避蝗蟲[23]；小麥揮發(fā)的十四烷對赤擬谷盜（Tribolium castaneumHerbst）成蟲起到趨避作用[24].但十四烷作為互利素的有效成分還未見相關(guān)的研究報道.

分子對接技術(shù)是基于計算機模擬技術(shù)建構(gòu)蛋白質(zhì)和小分子配體的三維模型，以此評估蛋白與配體結(jié)合能力強弱的一種方法.嗅覺系統(tǒng)在昆蟲尋找食物、躲避天敵等過程中起著重要作用，而氣味結(jié)合蛋白是嗅覺蛋白中尤為重要的一種.本研究針對泡桐揮發(fā)物中的正十三烷和十四烷，利用分子對接技術(shù)選擇與之結(jié)合的氣味結(jié)合蛋白OBPs，揭示此類化合物進入白蛾周氏嚙小蜂后的嗅覺通路.研究結(jié)果表明，CcOBP19與CcOBP23均能與十三烷和十四烷相結(jié)合.Zhao等[16]研究白蛾周氏嚙小蜂發(fā)現(xiàn)，白蛾周氏嚙小蜂中的CcOBP19主要在雌性觸角中表達，CcOBP23主要在雄性觸角中表達，2種化合物均可能與雌性尋找寄主、雄性尋找雌性進行交配相關(guān).楊忠岐[25]研究發(fā)現(xiàn)，雌雄白蛾周氏嚙小蜂在寄主蛹中完成交配后，雌性從蛹中鉆出繼續(xù)尋找寄主，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)雄性與雌性會同時從蛹中鉆出，是否還存在蛹外交配的現(xiàn)象仍需進一步研究證實.如果蛹外交配現(xiàn)象存在，那么正十三烷與正十四烷在吸引雌性小蜂的同時，也會吸引雄性小蜂完成交配.此外本研究中CcOBP19和CcOBP23均能結(jié)合十三烷與十四烷，說明CcOBPs與化合物并非專一結(jié)合.因此推測嗅覺識別機制在OBP對化合物的識別層面上具有網(wǎng)絡(luò)交叉的特性.

本研究利用分子對接技術(shù)，揭示了互利素十三烷和十四烷進入白蛾周氏嚙小蜂觸角感受器后的嗅覺通路，二者均能與CcOBP19和CcOBP23相結(jié)合.本研究為揭示白蛾周氏嚙小蜂的分子嗅覺機制積累相關(guān)數(shù)據(jù)，繼而可以為更好地利用其防治美國白蛾等害蟲奠定實驗基礎(chǔ).