煙草赤星病菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

謝中玉，王曉強(qiáng)，沈 宏，孫光軍，李 斌，崔志燕，，張永峰，冉 茂，陳海濤，張 帥，汪代斌，陳德鑫*，孫現(xiàn)超

1.西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶市北碚區(qū)天生路2號(hào) 400716 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草科學(xué)研究所，山東省青島市嶗山區(qū)科苑經(jīng)四路11號(hào) 266101 3.中國(guó)煙草總公司貴州省公司，貴陽市云巖區(qū)瑞金北路146號(hào) 550000 4.中國(guó)煙草總公司四川省公司，成都市武侯區(qū)世紀(jì)城路936號(hào) 610000 5.陜西省煙草公司商洛市公司，陜西省商洛市商州區(qū)北新街155號(hào) 726000 6.重慶煙草科學(xué)研究所，重慶市北碚區(qū)天生路2號(hào) 400715 7.重慶市煙草公司酉陽分公司，重慶市酉陽土家族苗族自治縣桃花源中路99號(hào) 409800

煙草赤星病是由鏈格孢菌（Alternaria alternata）引起的葉斑類病害，一般在煙株成熟后期發(fā)病較嚴(yán)重，在世界各產(chǎn)煙區(qū)均有發(fā)生，對(duì)煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)造成了較大影響。赤星病的發(fā)病和煙葉成熟衰老程度密切相關(guān)，隨著煙葉成熟度的增加，煙葉抗病性下降，一旦病害發(fā)生就會(huì)給煙葉生產(chǎn)帶來較大損失［1]。煙草赤星病的田間病癥及往年發(fā)病規(guī)律是診斷該病害的主要依據(jù)。在病害癥狀顯現(xiàn)之前，感染煙草鏈格孢菌的較幼嫩的煙草植株葉部不表現(xiàn)癥狀或只表現(xiàn)出輕微癥狀，此時(shí)無法判斷病原菌的種類，也無法對(duì)癥下藥進(jìn)行防治，極易錯(cuò)過最佳的防治時(shí)期，不利于該病害的控制［2-4]。因此，對(duì)煙草赤星病的定量檢測(cè)，確定病害發(fā)病的最低病原菌量，實(shí)現(xiàn)分子快速檢測(cè)預(yù)警具有重要意義。

針對(duì)煙草赤星病菌的檢測(cè)技術(shù)方法已有較多報(bào)道，如常規(guī)組織分離方法、血清學(xué)酶聯(lián)免疫吸附法和基于PCR的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等［5]。唐承成等［6]通過分子生物學(xué)鑒定及柯赫氏法則，鑒定出2種不同的病原菌，一個(gè)為鏈格孢菌（A.alternata），另一個(gè)為長(zhǎng)柄鏈格孢菌（Alternaria longipes）。組艷青等［7]通過分離病原菌并進(jìn)行致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)鑒定及rDNA-ITS序列分子鑒定，發(fā)現(xiàn)1個(gè)煙草赤星病的致病新種為鴨梨鏈格孢（Alternaria yaliinficiens）。然而這些常規(guī)的分子生物學(xué)方法操作過程較繁瑣，需要分離培養(yǎng)病原菌并進(jìn)行后續(xù)的普通PCR檢測(cè)鑒定。而目前的q-PCR不僅可以大大簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，而且可以提高檢測(cè)的靈敏度和有效性，從而實(shí)現(xiàn)病菌的定量分析。同普通PCR、巢式PCR相比，q-PCR具有更加快速、靈敏、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)［8-9]。q-PCR既可以進(jìn)行定性分析又可定量分析，且無須在擴(kuò)增后進(jìn)行一些常規(guī)操作，如電泳檢測(cè)，大大降低了污染的可能性，同時(shí)提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性［10]。利用q-PCR的方法對(duì)病原菌進(jìn)行快速檢測(cè)已有較多報(bào)道。杜清春等［11]建立了基于q-PCR方法的炭疽桿菌快速檢測(cè)體系。張海燕等［12]通過q-PCR對(duì)土壤中的茄科雷爾氏菌進(jìn)行檢測(cè)并已實(shí)際應(yīng)用。余鵬舉等［13]建立了SYBR Green I q-PCR方法用于檢測(cè)核桃感病組織內(nèi)膠胞炭疽菌。Guo等［14]在保守性好的tubB基因序列基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了針對(duì)谷物根瘤菌（Rhizoctonia cerealis）的特異性引物，并成功構(gòu)建出q-PCR檢測(cè)體系，不但可以快速發(fā)現(xiàn)存在的病菌，還可以確定病原菌的積累量，為確定病害的防治時(shí)期提供了依據(jù)。但目前q-PCR檢測(cè)在煙草葉片病害上的研究報(bào)道還較少，特別是在煙草赤星病上尚鮮見報(bào)道，因此針對(duì)煙草赤星病菌設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，對(duì)其特異性和靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)建立一種高效快速的q-PCR檢測(cè)體系，以期為該病害的有效防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

供試病原菌：煙草赤星病菌（Alternaria alternata），煙草黑脛病菌［Phytophthora parasiticavar.nicotianae（Breda de hean）Tuker]、煙草棒孢霉菌（CorynesporaGüssow）、葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinumOwen）、花生鐮刀病菌（Fusarium roseum）、番茄晚疫病菌（Phytophthora infestans）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum schw）、棉花枯萎病菌［Fusarium oxysporumSchl.f.sp.vasinfectum（Atk.）Snyder&Hansen]均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所病害實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

十六烷基三甲基溴化銨（2×CTAB）、2%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和25 mmol/L EDTA（北京博遠(yuǎn)泰隆生物科技有限公司），2.0 mol/L NaCl（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），100 mmol/L Tris-HCl（北京索萊寶科技有限公司）。V（酚）∶V（氯仿）∶V（異戊醇）=25∶24∶1、醋酸鈉、異丙醇、10×PCR Buffer、dNTPS和Taq DNA（北京索萊寶科技有限公司），SYBR Green I（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。

1.1.3 儀器

Q5000超微量核酸蛋白測(cè)定儀（美國(guó)QUAWELL公司）；Ge-neAmp PCR Syetem 9700基因擴(kuò)增儀、ABI 7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（賽默飛世爾科技有限公司）；DYY-12型電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌DNA的提取

采用CTAB法提取病原菌總DNA，根據(jù)陳鋒菊等［15]、Tendulkar等［16]的方法稍做改動(dòng)。①取1～2 g病原菌菌絲在液氮中快速研磨，加入1 mL CTAB裂解1 h，于4℃條件下12 000 r/min離心15 min；②吸取上清液800μL，加入等體積的V（酚）∶V（氯仿）∶V（異戊醇）溶液抽提2次，顛倒混勻，于4℃條件下12 000 r/min離心15 min；③取上清液600μL，先在離心管中加入1/10體積的醋酸鈉，再加入上清液，最后加入2/3體積的異丙醇，于-20℃放置40 min；④于4℃條件下12 000 r/min離心15 min，去掉上清液，沉淀物用80%的乙醇洗滌兩次，12 000 r/min離心1 min，加入30～50μL ddH2O溶解沉淀。提取的DNA用Q5000超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)DNA濃度，并置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI GenBank中的煙草鏈格孢菌的ITS基因序列，利用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物，共5對(duì)，其中獲得對(duì)煙草赤星病菌具有特異性的一對(duì)引物AS1F（5′-TGCAATCAGCGTCAGTAACAAAT-3′）和AS2R（5′-ATGGATGCTAGACCTTTGCTGAT-3′）。

1.2.3 常規(guī)PCR特異性及靈敏度檢測(cè)

以煙草赤星病菌（A.alternata）標(biāo)準(zhǔn)菌株為模板，煙草黑脛病菌（P.parasiticavar.Nicotianae）、煙草棒孢霉菌（C.Güssow）、葡萄炭疽病菌（C.gloeosporioides）、黃瓜枯萎病菌（F.oxysporumf.sp.cucumerinumOwen）、花生鐮刀病菌（F.roseum）、番茄晚疫病菌（P.infestans）、棉花枯萎病菌（F.oxysporumSchl.f.sp.vasinfectum）、小麥赤霉病菌（F.graminearum schw）為陰性對(duì)照，ddH2O為空白對(duì)照，用引物AS1F/AS2R進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，檢測(cè)引物特異性。

用超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)煙草赤星病菌基因組DNA的濃度，稀釋至100 ng/μL，然后按10倍梯度進(jìn)行稀釋，先取10μL濃度為100 ng/μL的DNA加入到90μL ddH2O中，將DNA濃度稀釋成1×10 ng/μL，然后取10μL濃度為1×10 ng/μL的DNA加入到90μL ddH2O中，即為1×1 ng/μL，依次類推稀釋為1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6ng/μL，以ddH2O為空白對(duì)照，每個(gè)濃度梯度取1.0μL進(jìn)行普通PCR靈敏度的檢測(cè)。25μL常規(guī)PCR擴(kuò)增體系：模板DNA 1μL，上下游引物各1μL，10×PCR buffer 2.5μL，dNTP 2μL，Taq酶0.5μL，ddH2O 17μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，吸取2μL Loading buffer與產(chǎn)物混合均勻，吸取10μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，150 V電泳20 min后，在凝膠電泳成像系統(tǒng)下，讀取帶形并拍照。

1.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和序列測(cè)定

以煙草赤星病菌基因組DNA為模板，用煙草赤星病菌特異性引物AS1F/AS2F進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到340 bp的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后連接到pEASY-T1載體上，并轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，獲得陽性菌落，提取含有目的DNA片段的質(zhì)粒，由青島派森諾基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。參考宋月等［17]的方法進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化、質(zhì)粒提取等。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以10倍梯度稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為擴(kuò)增模板，采用SYBR qPCR Master Mix推薦的反應(yīng)體系進(jìn)行q-PCR擴(kuò)增。以拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，循環(huán)閾值（CT）為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得數(shù)據(jù)分析拷貝數(shù)與CT值之間的關(guān)系，并建立數(shù)學(xué)模型，檢驗(yàn)相關(guān)性。

1.2.6 煙葉中赤星病菌q-PCR檢測(cè)

赤星病接種：采用孢子懸浮液接種。參照沈奕等［18]的方法，即將赤星病菌在PDA平板上培養(yǎng)5～7 d后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的葡萄糖洗下，4層紗布過濾，將孢子懸浮液分別稀釋至濃度為1×106、1×105、1×104、1×103和1×102個(gè)/mL。選取K326煙草品種進(jìn)行試驗(yàn)，用針均勻刺傷煙草葉片，造成傷口，然后將稀釋后的不同濃度病原菌孢子懸浮液用小型噴霧器均勻地噴灑在葉片上，以無菌水噴灑葉片為對(duì)照。

q-PCR檢測(cè)：接種7 d后取樣進(jìn)行定量檢測(cè)。參照湯文開等［19]的方法進(jìn)行葉片總DNA的提取。將提取的葉片總DNA采用q-PCR體系進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 22統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。使用7500 Software v2.3軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通PCR引物特異性和靈敏度的檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)中的q-PCR體系采用SYBR Green I染料法，其前提是PCR反應(yīng)的特異性，非特異性擴(kuò)增和引物二聚體均會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性［20]。通過普通PCR技術(shù)檢測(cè)5對(duì)引物的特異性，PCR結(jié)果顯示（圖1），僅AS1F和AS2R對(duì)煙草赤星病菌（A.alternata）有特異性，可以擴(kuò)增出340 bp的特異性條帶，而煙草黑脛病菌（P.parasiticavar.nicotianae）、棒孢霉菌（C.Güssow）及其他植物病原菌均未擴(kuò)增出條帶。擴(kuò)增序列：CATTGGATGCCTAACCTTTGCTGATAGAGAGTG CGACTTGTGCTGCGCTCCGAAACCAGTAGGCC GGCTGCCAATTACTTTAAGGCGAGTCTCCAGCA AAGCTAGAGACAAGACGCCCAACACCAAGCA AAGCTTGAGGGTACAAATGACGCTCGAACAGG CATGCCCTTTGGAATACCAAAGGGCGCAATGTG CGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGC AATTCACACTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCT TCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTG AAAGTTGTAATTATTAATTTGTTACTGAGCCTGA TTGCAA。說明該引物對(duì)煙草赤星病菌具有特異性，能夠區(qū)分出其他的病原菌。

對(duì)不同濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖2）顯示，最低能夠檢測(cè)到1 ng/μL的病原菌DNA。

2.2 q-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

各條擴(kuò)增傾斜度較大、曲線光滑而且各個(gè)循環(huán)閾值間隔相等，q-PCR的檢測(cè)靈敏度為1×10-3ng/μL，比常規(guī)PCR靈敏度提高了1×103倍（圖3A）。標(biāo)準(zhǔn)品熔解曲線峰型單一，且熔點(diǎn)溫度趨于一致，均為85.9℃左右，表明擴(kuò)增產(chǎn)物單一，引物特異性好且無引物二聚體形成（圖3B）。標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.403 8x+39.265（R2=0.999 4），擴(kuò)增效率約為97%（圖3C），表明標(biāo)準(zhǔn)曲線可滿足要求。

2.3 利用q-PCR體系檢測(cè)葉片菌含量

根據(jù)q-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，葉片中鏈格孢菌接菌量為1×106、1×105、1×104、1×103和1×102個(gè)/mL時(shí)，q-PCR擴(kuò)增CT值分別為16.9、19.6、19.8、21.6和24.6，對(duì)照CT值為29.9。與對(duì)照相比，接種不同濃度孢子懸浮液的葉片中菌含量差異極顯著，隨著接菌量的增加，葉片中菌含量也顯著增加（圖4）。表明所建立的q-PCR體系較合理，可準(zhǔn)確反映葉片菌含量。

3 結(jié)論

①設(shè)計(jì)了一對(duì)用于煙草赤星病菌檢測(cè)的特異性引物，該引物特異性較好，可以有效檢測(cè)煙草赤星病菌。②建立了實(shí)時(shí)熒光定量體系，可用于煙草葉片中赤星病菌的定量檢測(cè)。③噴施不同濃度赤星病菌的煙草葉片中病原菌含量q-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，該體系可對(duì)煙葉中赤星病菌進(jìn)行定量分析，可為煙草赤星病的有效監(jiān)測(cè)提供借鑒。