高羊茅細(xì)胞色素FaP450基因克隆及其在非生物脅迫下表達(dá)分析

陳 瑩 陳 錫 吳佳海 王 茜 王小利

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/貴州省草業(yè)研究所，貴州貴陽(yáng) 550006)

細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450，CYP450)是一個(gè)古老的超基因家族，廣泛存在于動(dòng)植物、細(xì)菌及真菌等細(xì)胞內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)P450 蛋白可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體與線粒體等細(xì)胞器的膜相結(jié)合，是一類(lèi)含有疏基和血紅素的結(jié)合蛋白，參與植物代謝的最大酶家族[1－3]，同時(shí)也是P450 羥基化酶電子傳遞鏈的組成部分，在生物體內(nèi)起著重要的電子傳遞作用[4－5]。P450 基因家族主要參與苯丙烷類(lèi)、生物堿與激素等植物代謝途徑，對(duì)植物的代謝產(chǎn)物的功能化修飾具有重要作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育及提高植物在逆境下的適應(yīng)能力[6－8]。目前在擬南芥[6]、人參[1]、水稻[9－10]、蓖麻[11]、蘋(píng)果[12]等植物中相繼發(fā)現(xiàn)該基因家族，證明P450 家族具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，可將這些功能大致分為兩大類(lèi):一類(lèi)是代謝產(chǎn)物的功能化修飾，如在植物激素、萜類(lèi)、苯丙烷類(lèi)與生物堿的合成中起到重要作用。這些代謝產(chǎn)物部分可以作為殺蟲(chóng)劑，使植物對(duì)昆蟲(chóng)、病原菌產(chǎn)生抗性。第二類(lèi)是代謝解毒功能，它可以催化外源物質(zhì)如除草劑、殺蟲(chóng)劑及其他環(huán)境污染物的代謝。P450 蛋白具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，因而P450基因成為近年的研究熱點(diǎn)。如Zhou 等[13]從擬南芥中克隆得到的CYP71B15，該基因所產(chǎn)生的植保素在作物抵抗病菌侵染過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。楊杰等[14]研究表明白樺細(xì)胞色素P450 具有組織特異性以及激素誘導(dǎo)表達(dá)特性，可能在白樺生長(zhǎng)發(fā)育、抵御脅迫及代謝物合成中發(fā)揮重要作用。單睿陽(yáng)等[15]研究發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)CYP71A26 與CYP71B34 基因均參與了生物(害蟲(chóng))與非生物(溫度)的脅迫響應(yīng)。雖然已經(jīng)分離的植物細(xì)胞色素P450 基因達(dá)7 000 多個(gè)，但大部分基因功能還未被發(fā)現(xiàn)，因此對(duì)其功能的探索仍然是今后的研究熱點(diǎn)。

高羊茅(Festuca arundinaceaSchreb.)為禾本科多年生植物，可作為觀賞性草坪草，也可作為牧草飼養(yǎng)牲畜，是我國(guó)主要草品種之一。高羊茅具有很強(qiáng)的抗逆性，耐貧瘠耐寒，并在草坪建植與水土保持方面發(fā)揮著巨大的作用。目前已有很多學(xué)者對(duì)細(xì)胞色素P450 基因在植物生物脅迫下的響應(yīng)進(jìn)行了大量的研究[16－17]，包括抗病抗菌抗蟲(chóng)防衛(wèi)反應(yīng)等，但是關(guān)于P450 基因抵御非生物逆境脅迫相關(guān)功能研究較少。本研究利用cDNA 末端快速擴(kuò)增技術(shù)獲得高羊茅逆境脅迫蛋白FaP450 基因全長(zhǎng)，并進(jìn)一步對(duì)其編碼蛋白的序列特征與FaP450 在不同非生物脅迫條件下的表達(dá)進(jìn)行分析。通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化，使FaP450 基因在擬南芥中過(guò)量表達(dá)，研究在低氮脅迫下野生型與過(guò)量表達(dá)FaP450擬南芥生長(zhǎng)特征，以期為P450 基因在抗逆功能中的研究提供理論基礎(chǔ)與應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究采用的高羊茅品種黔草1 號(hào)來(lái)自貴州省草業(yè)研究所2005年育成的國(guó)家牧草新品種(登記號(hào):299)。

1.2 材料處理

選取飽滿的高羊茅種子，播種于花盆中，置于溫度23±2℃、光照時(shí)間12 h·d－1、濕度70%的光照培養(yǎng)箱中，定期澆水，待生長(zhǎng)一段時(shí)間后進(jìn)行干旱、高溫、低氮與高鹽脅迫處理。

干旱處理:將生長(zhǎng)14 d 的高羊茅幼苗放于30%的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)溶液中處理24 h，對(duì)照組為正常Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液。

高溫處理:將生長(zhǎng)30 d 的高羊茅植株轉(zhuǎn)入42℃條件下持續(xù)處理24 h，對(duì)照組的生長(zhǎng)條件為23℃。

低氮處理:將生長(zhǎng)30 d 的高羊茅幼苗分別轉(zhuǎn)移到Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液與無(wú)氮水培液中(營(yíng)養(yǎng)液中NO3－被Cl－取代)處理24 d。

高鹽處理:將生長(zhǎng)14 d 的高羊茅幼苗分別放置于含有400 mmol·L－1NaCl 的Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液和正常Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液中處理24 h。

分別取0、0.5、1、2、6、12 和24 h 時(shí)共7 個(gè)點(diǎn)，以正常生長(zhǎng)的高羊茅為對(duì)照組，取樣后液氮速凍，保存在－80℃冰箱中待用。

1.3 RNA 提取

采用北京寶生物公司的TaKaRa RNAiso Reagent試劑盒進(jìn)行高羊茅葉片的RNA 提取，mRNA 的反轉(zhuǎn)錄參照加拿大Fermentas 公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒說(shuō)明，以總mRNA 為模板合成cDNA 第一鏈。

1.4 FaP450 基因的克隆

參考高羊茅轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中P450 相關(guān)基因片段，采用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)PCR 擴(kuò)增特異引物(表1)。采用5′RACE 試劑盒(5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version2.0，美國(guó)Invitrogen 公司)與3′RACE 試劑盒(SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit，美國(guó)Clontech Laboratories 公司)擴(kuò)增獲得FaP450 基因的5′端與3′端，PCR 產(chǎn)物回收純化后送至上海生工公司測(cè)序。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)

以反轉(zhuǎn)錄成的高羊茅cDNA 為模板，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)檢測(cè)干旱、高溫、低氮與高鹽脅迫下高羊茅葉片中FaP450 基因的表達(dá)量，引物見(jiàn)表1。反應(yīng)體系共20 μL:6 μL ddH2O、2 μL cDNA、1 μL 上游引物、1 μL 下游引物、10 μL 2 × SYBR Premix Ex Taq，置于Mastercycler ep realplex 熒光定量PCR 儀(德國(guó)EPPENDORF)上進(jìn)行反應(yīng)，擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性3 min，94℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸30 s，45 個(gè)循環(huán)，內(nèi)參基因?yàn)閁BI(表1)。每個(gè)取樣點(diǎn)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3 個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.6 生物信息學(xué)分析

使用NCBI 網(wǎng)站(https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索進(jìn)行Blast 比對(duì)，并進(jìn)行FaP450 基因編碼蛋白功能域分析。使用SOPMA 網(wǎng)站(https:/ /npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsaautomat.pl? page ＝npsa _ sopma.html)預(yù)測(cè)FaP450 蛋白的基本性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用MEGA6.0 軟件進(jìn)行氨基酸序列同源性分析，構(gòu)建FaP450 的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。在ExPASY 網(wǎng)站(http:/ /www.expasy.ch/tools/proscale.html)分析FaP450 蛋白的相對(duì)分子量、等電點(diǎn)及疏水性。

1.7 遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建與擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

農(nóng)桿菌菌株使用GV3101，過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建及擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化參考李小冬等[18]的方法，構(gòu)建過(guò)量表達(dá)載體后采用花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥，收獲種子為T(mén)0 轉(zhuǎn)基因擬南芥。

1.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選與陽(yáng)性鑒定

將T1 轉(zhuǎn)基因擬南芥種子用75%乙醇表面消毒3 min，用無(wú)菌水清洗種子3 次，均勻懸浮于0.1%的瓊脂糖，然后鋪布于1/2MS ＋300 mg·L－1特美?。?0 mg·L－1潮霉素培養(yǎng)基，4℃放置3 d 轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中篩選15 d，挑選陽(yáng)性植株。

1.9 低氮脅迫下過(guò)量表達(dá)FaP450 擬南芥的根長(zhǎng)與鮮重

將野生型以及過(guò)量表達(dá)FaP450 基因的擬南芥消毒后播種于Hoagland 固體培養(yǎng)基中，挑選整齊一致的幼苗分別移栽到已滅菌的Hoagland 全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基與Hoagland 缺氮培養(yǎng)基(Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液中NO－3被Cl－取代)，10 g·L－1瓊脂，pH 值6.0，在23℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照12 h·d－1，生長(zhǎng)15 d，分別取對(duì)應(yīng)植物測(cè)定鮮重與根長(zhǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高羊茅FaP450 基因的克隆與核酸序列分析

本研究以高羊茅cDNA 為模板，經(jīng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)拼接的序列設(shè)計(jì)特異引物，擴(kuò)增得到目的片段條帶，序列長(zhǎng)度為227 bp (圖1)，膠回收測(cè)序后得到高羊茅FaP450基因的核心片段。利用合成的3′RACE 與5′ RACE 引物(表1)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將PCR 產(chǎn)物切膠回收測(cè)序得到3′端931 bp 與5′端的801 bp 的cDNA 片段。利用DNAMAN 軟件將以上3 段序列進(jìn)行拼接，得到總長(zhǎng)度為1 737 bp 的基因全長(zhǎng)cDNA 序列(圖2)，含1 437 bp的開(kāi)放閱讀框，共編碼478 個(gè)氨基酸，該基因包含91 bp 的5′端非編碼區(qū)、207 bp 的3′端非編碼區(qū)，命名為FaP450。保守結(jié)構(gòu)域分析表明(圖3)，該基因編碼的蛋白屬于P450 家族。經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，高羊茅與禾本科植物小麥、山羊草的P450 蛋白親緣關(guān)系較近(圖4)，同源性均在80%以上。

圖1 FaP450 基因的RACE 擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of FaP450 cDNA

圖2 FaP450 保守功能域的預(yù)測(cè)分析Fig.2 Prediction of conserved domains of FaP450

圖3 FaP450 保守功能域的預(yù)測(cè)分析Fig.3 Prediction of conserved domains of FaP450

圖4 植物P450 同源基因氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of amino acid seqences of plant P450 homologous gene

2.2 高羊茅FaP450 基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

通過(guò)在線軟件ExPASY 預(yù)測(cè)FaP450 基因編碼蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為54.337 kDa，理論等電點(diǎn)為8.97，不穩(wěn)定系數(shù)為29.53，對(duì)其進(jìn)行疏水性分析(圖5) 發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)aP450 蛋白疏水性最大值為2.756，最小值為－ 2.767，為親水蛋白。利用SOPMA 軟件預(yù)測(cè)FaP450 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，F(xiàn)aP450 蛋白結(jié)構(gòu)域主要由 α － 螺旋(48.12%)、延伸鏈(12.76%)、β－轉(zhuǎn)角(5.65%)、無(wú)規(guī)則卷曲(33.47%)組成。

圖5 FaP450 蛋白疏水性分析Fig.5 Predicted hydrophobicity for FaP450 protein

2.3 在非生物脅迫下高羊茅FaP450 基因的表達(dá)模式分析

采用qPCR 檢測(cè)高羊茅葉片中FaP450 基因在干旱、高溫、低氮與高鹽脅迫處理下的時(shí)空特異性的表達(dá)規(guī)律。由圖6可知，在干旱脅迫下，脅迫早期(0～0.5 h)FaP450 基因的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，脅迫1～6 h 時(shí)，F(xiàn)aP450 基因的表達(dá)與CK 相比升高，脅迫6 h 時(shí)達(dá)到峰值；在高溫脅迫下，F(xiàn)aP450 基因的表達(dá)在脅迫2 h后被誘導(dǎo)上升，6 h 達(dá)到峰值；在低氮脅迫下，與CK 相比，F(xiàn)aP450 基因的表達(dá)在脅迫0～1 h 上升，脅迫6～24 h 后被抑制；在高鹽脅迫下，脅迫0～1 h 時(shí)FaP450 基因表達(dá)與CK 相當(dāng)，脅迫2～24 h 時(shí)FaP450 基因表達(dá)被誘導(dǎo)上升，脅迫2 h 時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值。說(shuō)明高羊茅FaP450 基因受干旱、高溫、低氮及高鹽脅迫的誘導(dǎo)，該基因可能與抗性相關(guān)。

圖6 非生物脅迫下FaP450 基因在高羊茅中的轉(zhuǎn)錄水平Fig.6 Relative transcript levels of FaP450 in tall fescue under abiotic stresses

2.4 低氮脅迫下過(guò)量表達(dá)FaP450 基因擬南芥的根長(zhǎng)與鮮重

為了進(jìn)一步研究低氮脅迫條件下細(xì)胞色素FaP450 基因?qū)χ参锔档挠绊?，本研究通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化得到FaP450 過(guò)量表達(dá)擬南芥。觀察FaP450 過(guò)量表達(dá)與野生型(WT)擬南芥根系長(zhǎng)度發(fā)現(xiàn)，在正常情況下，F(xiàn)aP450 的根長(zhǎng)顯著高于野生型；在低氮脅迫條件下，F(xiàn)aP450 過(guò)量表達(dá)植株的根顯著長(zhǎng)于野生型，并且根系生長(zhǎng)更加健壯(圖7，圖8－A)。說(shuō)明細(xì)胞色素FaP450 能在低氮脅迫下促使擬南芥根系生長(zhǎng)，以獲得更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)適應(yīng)低氮的生長(zhǎng)環(huán)境。

圖7 FaP450 在低氮脅迫條件下的表型Fig.7 Morphological observation of FaP450 under deficent nitrogen stress

圖8 FaP450 在低氮脅迫條件下的根長(zhǎng)與鮮重Fig.8 Root length and raw weight of FaP450 under deficent nitrogen stress

生物量是衡量植物對(duì)逆境脅迫耐受性的一個(gè)重要指標(biāo)。正常條件下，F(xiàn)aP450 過(guò)量表達(dá)植株鮮重顯著高于野生型，低氮脅迫下野生型與FaP450 過(guò)量表達(dá)植株鮮重較正常條件下顯著下降，F(xiàn)aP450 過(guò)量表達(dá)植株根系長(zhǎng)勢(shì)較野生型更加健壯。說(shuō)明低氮顯著影響了高羊茅的生長(zhǎng)發(fā)育，細(xì)胞色素FaP450 過(guò)量表達(dá)植株與野生型相比更為耐低氮。

3 討論

植物細(xì)胞色素P450 在高等植物的線粒體膜、微粒體、液泡膜等中廣泛存在，在植物各器官中，葉片中細(xì)胞色素P450 含量最高[19]。在所有已知結(jié)構(gòu)的P450 中都存在一個(gè)保守的血紅素結(jié)合域，含有保守的FxxGxRxCxG 序列，螺旋K 區(qū)含有保守的ExxR 序列。目前細(xì)胞色素P450 基因已分別從水稻[3]、玉米[8]、擬南芥[9]、茶樹(shù)[13]等植物中克隆與鑒定。通過(guò)保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)從高羊茅中克隆得到細(xì)胞色素FaP450 與禾本科植物小麥、山羊草的P450 蛋白親緣關(guān)系較近，同源性均在80%以上，這可能是同為禾本科的植物，與其他同科植物的家族成員具有共同的保守區(qū)。

細(xì)胞色素P450 是一種多功能氧化酶。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450 有助于植物代謝產(chǎn)物的合成修飾與有毒物質(zhì)分解代謝，還能抵御生物以及非生物脅迫[20－21]。植物細(xì)胞色素P450 有較強(qiáng)的催化活性，并具有廣泛的底物譜，所催化的反應(yīng)類(lèi)型廣泛而復(fù)雜，如氮、硫、氧位的脫烷基作用，烴基的氧化作用，過(guò)氧化作用，氧化性的碳－碳鍵斷裂，氧化性脫氨、脫鹵和脫氫等，因此細(xì)胞色素P450 被稱(chēng)為萬(wàn)能的生物催化劑。Bell－Lelong 等[22]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450 活性及其基因的表達(dá)受逆境脅迫、創(chuàng)傷與病原侵染等因素的調(diào)控。本研究qPCR 表達(dá)分析顯示，高羊茅FaP450 基因受干旱、高溫、低氮及鹽脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明該基因參與了以上4 種抗逆分子調(diào)控，且FaP450 基因能調(diào)控植物防御化合物的形成，如異類(lèi)黃酮、香豆素與呋喃香豆素等，推測(cè)FaP450 基因能提高植物抵御逆境脅迫的能力。關(guān)于高羊茅FaP450 基因的抗逆分子調(diào)控機(jī)制尚不明確，這將成為下一步研究的重點(diǎn)。

植物能夠攝入和同化NH＋4和NO－3形式的無(wú)機(jī)氮，氮是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的大量元素之一，參與植物有機(jī)體的構(gòu)成，也是氨基酸、葉綠素、核酸、脂類(lèi)以及許多中間代謝產(chǎn)物的重要組成部分[23－26]。馬欣容等[27]克隆了番茄P450 家族的CYP710A11 基因，并構(gòu)建了表達(dá)載體在煙草中進(jìn)行了功能驗(yàn)證，結(jié)果表明過(guò)量表達(dá)該基因可顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽、抗旱能力。本研究將構(gòu)建的過(guò)表達(dá)載體在擬南芥中進(jìn)行功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素FaP450 過(guò)量表達(dá)植株生長(zhǎng)狀況更好，對(duì)低氮環(huán)境的適應(yīng)性更強(qiáng)，這可能是因?yàn)樵谌鄙俚氐臈l件下，擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，而FaP450基因能調(diào)控植物激素、萜類(lèi)、黃酮類(lèi)等生物物質(zhì)的合成，在一定程度上緩解低氮對(duì)擬南芥的傷害，從而提高擬南芥對(duì)低氮環(huán)境的適應(yīng)性。

4 結(jié)論

綜上所述，當(dāng)植物受到非生物脅迫時(shí)，高羊茅色素基因FaP450 對(duì)干旱、高溫、低氮及高鹽脅迫的誘導(dǎo)響應(yīng)明顯，表達(dá)量提高，這可能是細(xì)胞色素FaP450 具有參與調(diào)節(jié)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)及抵御逆境脅迫等功能。通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化，在低氮脅迫下，過(guò)量表達(dá)FaP450 擬南芥的鮮重與根長(zhǎng)顯著高于野生型，說(shuō)明細(xì)胞色素FaP450能在低氮脅迫下減緩缺氮對(duì)擬南芥生長(zhǎng)的傷害。