結(jié)核桿菌抗酸染色與實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測效果比較

史運(yùn)林

摘要：目的：探討結(jié)核桿菌抗酸染色與實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測效果比較。方法：統(tǒng)計(jì)分析我院2019年10月至2020年12月期間結(jié)核門診398例影像檢查疑似結(jié)核患者，同時(shí)進(jìn)行涂片抗酸染色和實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)核菌DNA檢測進(jìn)行效果比較。結(jié)果：實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)核菌DNA檢測敏感度、特異性對比與抗酸染色涂片法較高，P<0.05，數(shù)據(jù)指標(biāo)之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算意義。作為肺結(jié)核的有效診斷方法，可以為臨床治療提供依據(jù)，值得推廣使用。

關(guān)鍵詞：結(jié)核桿菌;抗酸染色;實(shí)時(shí)熒光PCR

結(jié)核病及時(shí)準(zhǔn)確的診斷，對結(jié)核病預(yù)防與治療，至關(guān)重要。結(jié)核病是結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染病。實(shí)驗(yàn)室檢測手段有細(xì)菌學(xué)檢查、免疫學(xué)檢測、分子生物學(xué)檢測。我科開展的檢測手段有抗酸染色、實(shí)時(shí)熒光PCR法結(jié)核分枝桿菌核酸檢測?？顾崛旧科ㄒ笤O(shè)備簡單、實(shí)驗(yàn)時(shí)間短、操作簡便、成本低廉等臨床優(yōu)勢。結(jié)核桿菌核酸檢測法（實(shí)時(shí)熒光PCR法）對實(shí)驗(yàn)室人員要求高，特異性強(qiáng)，敏感性高，大大地提高了檢測的準(zhǔn)確度資料與方法。

1.1資料? 在2019年10月至2020年12月期間來院結(jié)核門診就診，影像學(xué)懷疑為結(jié)核病的398例患者，作為這次的分析對象。最大年98歲，最小年齡13歲。男性279例，女性119例。

1.2方法

抗酸染色：收集患者3份痰標(biāo)本（即時(shí)痰、夜間痰和晨痰）進(jìn)行痰涂片，痰涂片大小10mm x20mm，厚薄剛好透過報(bào)紙的5號字體，鏡下每個(gè)視野20個(gè)左右細(xì)胞。在痰片自然干燥后，用臘筆將涂面局部隔開，滴加石炭酸復(fù)紅染液，酒精燈上加熱至出現(xiàn)蒸氣。切勿沸騰，亦不可使染液干涸。如有干涸的趨勢，應(yīng)及時(shí)補(bǔ)加染液。持續(xù)染色5-8分鐘，待冷后流水漂去多余的染液。用3%鹽酸酒精清脫色，脫至涂面無色為止，約1-3分鐘，自來水沖洗，滴加呂氏美蘭染液復(fù)雜30秒～1分鐘，自來水沖洗，自然干燥后油鏡觀察100個(gè)視野 ，查見有抗酸桿菌即為陽性。儀器使用奧林巴斯顯微鏡。

實(shí)時(shí)熒光PCR法結(jié)核分枝桿菌核酸檢測：收集患者3份痰標(biāo)本（即時(shí)痰、夜間痰和晨痰），加入標(biāo)本體積1-2倍的4%氫氧化鈉震蕩30分鐘左右完全液化，將液化后3份標(biāo)本混合在一起，槍頭或吸管混勻后吸取0.5ml至1.5ml離心管中， 15000rpm離心5分鐘; 去上清，沉淀加無菌生理鹽水1ml打勻，15000rpm 離心5分鐘;再重復(fù)洗滌一次; 去上清，沉淀中加50μl DNA提取液充分混勻，沸水浴10 分鐘;12000 rpm 離心5分鐘，備用。實(shí)時(shí)熒光PCR? TB-DNA檢測是用一對結(jié)核分枝桿菌特異性引物和一條結(jié)核分枝桿菌特異性熒光探針，配以PCR反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、四種核苷酸 v0123單體（dNTPs）等成分，用PCR體外擴(kuò)增法檢測結(jié)核分枝桿菌DNA。試驗(yàn)嚴(yán)格遵守試劑盒說明書實(shí)驗(yàn)室SOP文件操作，如果Ct 值<30，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性。儀器使用eppendoye? centrifuge 5430 R低溫高速離心機(jī)，SLAN-96、熒光定量PCR擴(kuò)增儀。試劑廠家是中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本次統(tǒng)計(jì)分析的來我院結(jié)核門診就診，影像學(xué)X光疑似為結(jié)核病的398例患者痰檢數(shù)據(jù)均率入到SPSS19.0 for Windows 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件實(shí)施處理，痰涂片抗酸染鏡檢法與結(jié)核桿菌DNA檢測符合率比較用率（%）的形式表示，采用卡方檢驗(yàn)P<0.05，數(shù)據(jù)指標(biāo)之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算意義。

2.結(jié)果

2.1 比較分析抗酸染色涂片法與實(shí)時(shí)熒光PCR法結(jié)核分枝桿菌核酸檢測陽性率符合情況。

檢測數(shù)據(jù)分析可見，398名檢測者中，痰涂片抗酸染色54例，陽性率13.57%;實(shí)時(shí)熒光PCR法結(jié)核分枝桿菌核酸檢測陽性112例，陽性率28.14%。敏感性、特異性對比與抗酸染色涂片法較高，P<0.05，數(shù)據(jù)指標(biāo)之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算意義。

3.討論

結(jié)核病是人類疾病中最古老的傳染病之一，在全球傳染病中己成為成年人的首要死因。我國2019年新發(fā)結(jié)核病患者達(dá)到83.3萬例，死亡3.1萬例，從全球范圍來講，結(jié)核病問題不僅是一個(gè)健康衛(wèi)生的問題，也是一個(gè)國計(jì)民生的經(jīng)濟(jì)問題，還是一個(gè)可能牽連國家和地區(qū)能否穩(wěn)定和發(fā)展的社會(huì)問題[1]。結(jié)核病是結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染病，結(jié)核菌陽性患者是最主要的傳染源，痰檢是肺結(jié)核檢查診斷的有效手段。痰檢實(shí)驗(yàn)檢測手段有痰涂片抗酸染色、實(shí)時(shí)熒光PCR? TB-DNA檢測、痰結(jié)核桿菌培養(yǎng)。痰結(jié)核桿菌培養(yǎng)快者2-3周，慢者2-3個(gè)月，時(shí)間周期長。為結(jié)核治療提供依據(jù)，及時(shí)準(zhǔn)確的診斷結(jié)核病，有效地控制傳染源，對預(yù)防、治療結(jié)核病至關(guān)重要。

現(xiàn)階段，痰涂片抗酸染色與實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測為最常見的實(shí)驗(yàn)室檢測手段。痰涂片抗酸染色是利用結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁上的脂類不容易著色，對其延長染色的時(shí)間，細(xì)胞壁上的脂類著色后，不容易被 酸性脫色劑脫去 ，通過顯微鏡觀察視野中是否有被染成紅色的結(jié)核桿菌 ，來判斷臨床疑似肺結(jié)核的患者是否被結(jié)核分枝桿菌感染 ，這種方法具有操作方便 、價(jià)格便宜的優(yōu)點(diǎn) [2] ，但是痰涂片抗酸染色易受痰標(biāo)本的質(zhì)量、染色時(shí)間、工作人員的經(jīng)驗(yàn)情況的影響，造成漏檢。PCR技術(shù)具有高敏感性和高特異性，對標(biāo)本要求較低，結(jié)核分枝桿菌極少的情況下也可檢出，利用實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測結(jié)核分枝桿菌結(jié)果的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性及重復(fù)性大大提高。

通過用上述兩種方法進(jìn)行效果比較，結(jié)論兩種檢測方法皆是臨床上迅速檢測結(jié)核分枝桿菌的有效方法，，其中熒光定量PCR敏感度高，應(yīng)用在初篩中效果更為顯著[3]。實(shí)時(shí)熒光PCR? TB-DNA檢測作為肺結(jié)核的有效診斷方法，可以為臨床治療提供依據(jù)，值得推廣使用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 朱國峰? 關(guān)注并引領(lǐng)結(jié)核病免疫學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)理論與創(chuàng)新技術(shù)發(fā)展 結(jié)核與肺部疾病雜志 ，2020，12（3）193-194。

[2]秦 慶 胡 瑛 呂永 強(qiáng)? 痰涂片抗酸染色、結(jié)核抗體試驗(yàn)、熒光PCR、 T-SPOT.TB在肺結(jié)核診斷中的臨床意義? ?中國醫(yī)學(xué)科學(xué) 2017，11 （7） ，130-134。

[3] 梁少碧? 熒光寫量PCR和雙抗原夾心膠體免疫層析法檢測結(jié)核分枝桿菌的對比觀察 [M] 結(jié)核與肺部健康雜志 2013，6（20），112-114。