敲降LncRNA MALAT1在保護(hù)銅綠假單胞菌致大鼠肺炎中的作用

張世微 徐章 張志海 何煥然

(1湖北職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北 孝感 432000；2孝感市中心醫(yī)院；3漢川市血防辦公室；4孝感市孝南區(qū)血防辦公室)

銅綠假單胞菌是一種常見的機(jī)會(huì)致病菌，是肺炎的常見病原菌，尤其是在醫(yī)院獲得性肺炎中極為常見〔1〕。銅綠假單胞菌肺部感染后極易誘發(fā)全身性炎癥反應(yīng)，甚至有可能發(fā)展成為多器官功能障礙綜合征，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致死亡〔2〕。LncRNA MALAT1是最早鑒定出與人類疾病相關(guān)的LncRNA之一〔3〕。研究表明。LncRNA MALAT1與人類多種肺部疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，有研究報(bào)道LncRNA MALAT1參與了脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷〔4〕，同時(shí)LncRNA MALAT1還可以作為預(yù)測非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物〔5〕。核因子(NF)-κB是一種廣泛存在的多效應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，參與了大鼠銅綠假單胞菌肺炎的發(fā)生和發(fā)展〔6〕。LncRNA MALAT1作為NF-κB的前體調(diào)控因子〔7〕，有可能參與了銅綠假單胞菌導(dǎo)致肺炎的發(fā)展過程。本研究通過構(gòu)建銅綠假單胞菌大鼠肺炎模型，探討LncRNA MALAT1在銅綠假單胞菌大鼠肺炎中作用及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與菌種 清潔級(jí)SD大鼠30只，雌雄各15只，周齡8～12 w，體重180～230 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào)：12910371116)。銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株(ACTT27853)購于北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑及主要儀器 SD大鼠C反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞介素(IL)-8和腫瘤壞死因子(TNF)-α定量酶聯(lián)免疫試劑盒購于上海滬震實(shí)業(yè)有限公司；SD大鼠超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒購于上海研啟生物科技有限公司；TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司；PCR Master Mix試劑盒和qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；SD大鼠NF-κB免疫組化試劑盒購于上海雅吉生物科技有限公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購于福州奧研實(shí)驗(yàn)器材有限責(zé)任公司。大鼠固定臺(tái)；XFA6130全自動(dòng)動(dòng)物血液細(xì)胞分析儀；光學(xué)顯微鏡；分光光度儀；酶標(biāo)儀。

1.3動(dòng)物模型構(gòu)建及樣本收集 采用隨機(jī)數(shù)字法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對(duì)照組、模型組和敲降LncRNA MALAT1模型組，每組10只。敲降LncRNA MALAT1模型組使用10%水合氯醛(0.1 ml/100 g)腹腔注射麻醉后將含有sh-MALATA1-RNA的PFU聚合酶經(jīng)鼻吸入大鼠肺內(nèi)，繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)72 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在模型構(gòu)建前1 d將銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株接種于MH瓊脂平板上，置于恒溫培養(yǎng)中培養(yǎng)24 h，肉眼可見綠色銅綠假單胞菌生長后進(jìn)行滅菌，配制成2個(gè)麥?zhǔn)蠁挝粷舛?6×1011cfu/L)的菌液待用。使用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠完全麻醉后將其固定在固定臺(tái)上，使用止血鉗拉出大鼠舌頭后固定于外部。使用注射器抽取0.4 ml菌液并插入大鼠氣管內(nèi)，注菌完成后立即豎立大鼠并固定，左右搖晃固定臺(tái)1 min。對(duì)照組采用同樣的方法注入0.4 ml滅菌生理鹽水。

接種24 h后處死各組大鼠，使用EP管從眼窩處收集各組大鼠1.5 ml血液。分離大鼠氣管后使用1.0 ml生理鹽水進(jìn)行灌洗并收集灌洗液。將大鼠血液和支氣管肺泡灌洗液在4℃條件下3 000 r/min離心5 min，收集上清液后凍存于-80℃冰箱中待用。在無菌條件下剖取各組大鼠肺組織，凍存于-20℃冰箱中待用。

1.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定大鼠血清CRP水平 取0.5 ml大鼠血液，在4℃條件下3 000 r/min離心5 min后收集上清，使用大鼠CRP定量酶聯(lián)免疫試劑盒，參照試劑盒說明書檢測各組大鼠血液中CRP水平。

1.5ELISA測定大鼠肺組織和支氣管肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α水平 取各組大鼠肺組織(6 mm×6 mm×6 mm)在研磨器中研磨成組織勻漿，在4℃條件下12 000 r/min離心15 min，并收集組織勻漿上清液。使用大鼠IL-8和TNF-α定量免疫酶聯(lián)試劑盒，根據(jù)試劑盒說明書檢測大鼠肺組織勻漿和支氣管肺泡灌洗液中IL-8和TNF-α水平。

1.6RT-qPCR檢測大鼠肺組織內(nèi)LncRNA MALAT1表達(dá) 取各組大鼠肺組織后研磨成組織勻漿。使用TRIzol試劑提取組織中的總RNA，使用PCR Master Mix試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用qPCR SYBR Green Master Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以GAPDH為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。LncRNA MALAT1上游引物序列：5′-GCGAGCAGGCATTGTGGAGAG-3′；下游引物序列：5′-GCCGACCTCAAGAATGTTACCG-3′。GAPDH上游引物序列：5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′；下游引物序列：5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′。

1.7大鼠肺組織中SOD和MDA水平檢測 取各組大鼠肺組織后研磨成組織勻漿，在4℃條件下12 000 r/min離心15 min，并收集組織勻漿上清液。使用大鼠SOD和丙二醛檢測試劑盒，使用分光光度儀參照試劑盒說明書檢測大鼠肺組織中SOD和MDA水平。

1.8大鼠肺組織和血液中蛋白質(zhì)濃度測定 收集各組大鼠肺組織和血液。處理后使用酶標(biāo)儀測定樣本在562 nm處的吸光光度值，使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定各組大鼠肺組織和血液中的蛋白質(zhì)濃度。

1.9免疫組化染色檢測各組大鼠肺組織中NF-κB的活性 收集大鼠肺組織，4%多聚甲醛固定后進(jìn)行石蠟包埋。切片后進(jìn)行常規(guī)脫蠟入水，參照試劑盒說明書使用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物法堿性免疫組化染色。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1SD大鼠銅綠假單胞菌肺炎模型的構(gòu)建 模型組接種銅綠假單胞菌24 h后臨床表現(xiàn)為呼吸急促，雙側(cè)胸廓呼吸幅度增加，懶動(dòng)，精神狀態(tài)和食欲欠佳，蜷縮與鼠籠角落，對(duì)周圍刺激反應(yīng)較差，體毛粗糙且無光澤。對(duì)照組大鼠接種滅菌生理鹽水前后無明顯變化。接種前兩組血液中WBC、NEUT、NEUTr%和CRP水平無明顯差異(t=0.001、0.000、0.500、3.0.252,P>0.05)，接種后24 h模型組均明顯升高(t=27.893、18.434、12.926、30.929,P<0.05)，對(duì)照組接種滅菌生理鹽水24 h后血液中各指標(biāo)無明顯變化(t=0.707、0.877、0.097、0.485,P>0.05)，見表1。

表1 兩組接種前后血液中各指標(biāo)變化

2.2體內(nèi)LncRNA MALAT1和炎癥因子表達(dá)水平 RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，模型組肺組織中LncRNA MALAT1水平(1.66±0.02)明顯高于對(duì)照組(0.97±0.01，P<0.05)。ELISA檢測結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，模型組肺組織內(nèi)IL-8和TNF-α水平明顯升高(t=60.976、20.551,P<0.05)，且模型組支氣管肺泡灌洗液中IL-8和TNF-α水平也明顯升高(t=23.494、22.533,P<0.05)，敲降LncRNA MALAT1的模型大鼠肺組織和支氣管肺泡灌洗液中IL-8和TNF-α水平相較于模型組明顯降低(t=43.244、16.033,P<0.05)，支氣管肺泡灌洗液中IL-8和TNF-α水平也明顯降低(t=7.365、14.397,P<0.05)，見表2。

表2 各組肺組織和支氣管肺泡灌洗中炎癥因子表達(dá)水平

2.3敲降LncRNA MALAT1可減輕銅綠假單胞菌引起的大鼠肺損傷 RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，敲降LncRNA MALAT1后大鼠肺組織內(nèi)LncRNA MALAT1表達(dá)水平(0.85±0.01)顯著低于對(duì)照組與模型組(1.02±0.02、1.53±0.02，P<0.05)。相較于對(duì)照組，模型組肺組織和血清中蛋白質(zhì)濃度均顯著增加(t=9.351、3.436,P<0.05)，肺組織中SOD水平明顯降低(t=13.751,P<0.05)，MDA水平明顯升高(t=7.894,P<0.05)。

敲降LncRNA MALAT1的模型大鼠肺組織和血清中蛋白質(zhì)濃度相較于模型組明顯降低(t=5.543、2.614,P<0.05)，且肺組織中SOD水平明顯升高(t=12.374,P<0.05)，MDA水平明顯降低(t=5.031,P<0.05)，見表3。

表3 各組肺損傷情況

2.4敲降LncRNA MALATA1對(duì)小鼠NF-κB活性的影響 免疫組化結(jié)果顯示，模型組肺組織中細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)較對(duì)照組(1.09±0.78)均有明顯NF-κB著色(P<0.05)，敲降LncRNA MALAT1的模型大鼠肺組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核NF-κB著色(15.13±2.13)相較于模型組(24.27±3.46)明顯減少(P<0.05)。

3 討 論

銅綠假單胞菌廣泛分布于自然界的濕潤環(huán)境中，也常定植于人體的呼吸道中。由于銅綠假單胞菌表面有抗吞噬和滲透作用的生物膜包覆〔8〕，且還具有多重耐藥性〔9〕，因此銅綠假單胞菌導(dǎo)致的肺炎在治療過程中存在諸多困難。隨著銅綠假單胞菌感染的日益增多，其發(fā)病機(jī)制、病理改變和預(yù)防治療成為了研究重點(diǎn)。

NF-κB信號(hào)通路參與了多種病原菌導(dǎo)致的肺炎〔10,11〕。本研究結(jié)果提示銅綠假單胞菌感染導(dǎo)致了大鼠肺組織中NF-κB信號(hào)通路的激活。研究顯示，NF-κB信號(hào)通路的激活能調(diào)控一系列參與肺部炎癥的炎癥因子表達(dá)〔12〕，如IL-8和TNF-α。TNF-α作為一種重要的炎性介質(zhì)，介導(dǎo)創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)，引起多器官組織損傷，同時(shí)還可刺激其他炎癥因子表達(dá)，如IL-6和IL-8等。IL-8能促進(jìn)溶酶體酶的釋放，導(dǎo)致局部血管舒張、通透性增加，進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，接種銅綠假單胞菌的模型大鼠肺組織和支氣管肺泡灌洗液中IL-8和TNF-α水平均明顯增加。

LncRNA MALAT1參與了人體多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，但在炎癥調(diào)節(jié)中的機(jī)制較為復(fù)雜。Gu等〔7〕研究顯示敲降LncRNA MALAT1可通過抑制NF-κB信號(hào)通路的活性減輕肺支原體誘導(dǎo)的肺部損傷。Cao等〔13〕研究顯示，敲降LncRNA MALAT1減輕了小鼠腦缺血后的炎癥反應(yīng)，且過表達(dá)LncRNA MALAT1加劇了腦缺血后的炎癥反應(yīng)。然而Sun等〔14〕研究顯示LncRNA MALAT1可保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，Cermer等〔15〕研究也表明LncRNA MALAT1抑制了血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，延緩了小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變的形成。LncRNA MALAT1在不同研究中不一致的作用可能是因?yàn)槠湓诓煌膊≈姓{(diào)控機(jī)制的差異所導(dǎo)致。本研究結(jié)果提示敲降LncRNA MALAT1可顯著抑制銅綠假單胞菌肺炎大鼠的炎癥反應(yīng)并減輕因其導(dǎo)致的肺損傷，其機(jī)制可能與抑制NF-κB活性有關(guān)。

總之，銅綠假單胞菌感染上調(diào)了LncRNA MALAT1在大鼠肺組織中的表達(dá)，促進(jìn)了NF-κB信號(hào)通路的激活。敲降LncRNA MALAT1后抑制了銅綠假單胞菌介導(dǎo)的大鼠肺部炎癥反應(yīng)并減輕了大鼠肺損傷，其機(jī)制可能是通過抑制NF-κB信號(hào)通路活性實(shí)現(xiàn)的。