復(fù)方血栓通膠囊對(duì)老年糖尿病腎病維持性血液透析的治療效果及作用機(jī)制

陳拉斯 王婷婷 李來(lái)梅

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1血液凈化科，海南 海口 570102；2腎內(nèi)科；3海南省兒童醫(yī)院兒科)

糖尿病腎病(DN)是導(dǎo)致終末期腎病的重要原因之一，維持性血液透析雖然能夠作為一種代替療法，提高未進(jìn)行腎臟移植的終末期腎病患者的長(zhǎng)期生存率，但終末期腎衰竭患者的致死率仍然很高，特別是對(duì)于老年DN患者而言，由于腎功能及免疫功能降低使得其病死風(fēng)險(xiǎn)較年輕群體更高〔1〕。迄今為止，DN的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，可能是多因素參與并作用的結(jié)果，持續(xù)高糖環(huán)境所造成的血管新生、氧化應(yīng)激反應(yīng)、免疫應(yīng)答紊亂、持續(xù)慢性炎癥反應(yīng)等均與其發(fā)病有關(guān)〔2〕。中醫(yī)觀點(diǎn)指出，氣陰兩虛兼血瘀證是DN的主要證型，治療宜充足氣陰，即化瘀活血、養(yǎng)陰益氣；緩解痰瘀停滯，即強(qiáng)盛脾腎，保氣血通暢。復(fù)方血栓通主要成分為三七、丹參和黃芪，主要功效為祛濕化瘀，補(bǔ)益脾腎氣陰兼顧，使全身臟腑功能得到活動(dòng)，從而具備抗菌、消炎、抗氧化、降低炎癥復(fù)合物沉積及改善腎小球硬化等作用〔3〕?，F(xiàn)階段，在DN早期治療中常應(yīng)用復(fù)方血栓通，而在DN患者維持性血液透析中應(yīng)用該藥物，目前暫無(wú)報(bào)道，尤其是對(duì)于65歲以上老年群體的研究更為罕見(jiàn)。基于此，本研究通過(guò)觀察老年DN維持性血液透析患者在復(fù)方血栓通治療前后氧化應(yīng)激、血管新生因子、Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子及核因子(NF)-κB信號(hào)通路的變化，初步研究復(fù)方血栓通的作用及相關(guān)機(jī)制，將為更多DN患者的治療奠定相關(guān)實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 取2017年10月至2019年1月于海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院接受維持性血液透析治療的老年DN患者78例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①西醫(yī)診斷符合《實(shí)用內(nèi)科學(xué)》中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)〔4〕；②中醫(yī)診斷符合《糖尿病腎病診斷、辨證分型及療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》中的氣陰兩虛型〔5〕；③無(wú)合并其他嚴(yán)重軀體及精神疾患者；④年齡≥65歲；⑤透析時(shí)間>6個(gè)月，病情穩(wěn)定；⑥患者及家屬均自愿參加并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①病情進(jìn)展需要緊急終止者；②入組1個(gè)月前曾接受過(guò)降脂、抗凝藥物治療者；③合并嚴(yán)重神經(jīng)、代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者；④不良反應(yīng)程度重，如對(duì)藥物過(guò)敏、出現(xiàn)嚴(yán)重的消化道反應(yīng)難以控制；⑤同時(shí)伴有惡性腫瘤或其他血液系統(tǒng)疾病的患者；⑥患者重要臟器存在功能障礙，如心、肝、肺。78例患者隨機(jī)分為治療組及對(duì)照組，每組各39例。治療組男21例，女18例；對(duì)照組男23例，女16例。治療組年齡65～80歲，平均年齡為(71.12±8.59)歲；對(duì)照組65～82歲，平均年齡為(70.51±8.39)歲。治療組體重45.50～68.39 kg，平均體重為(59.20±8.87)kg；對(duì)照組體重44.68～69.29 kg，平均體重為(58.12±8.169)kg。透析時(shí)間，治療組1～14個(gè)月，平均時(shí)間為(8.20±1.29)個(gè)月；對(duì)照組1～13個(gè)月，平均時(shí)間為(8.30±1.19)個(gè)月。兩組數(shù)據(jù)間無(wú)顯著差異(P>0.05)，因此該數(shù)據(jù)符合繼續(xù)研究要求。

1.2方法 兩組患者給予同樣的常規(guī)治療，包括：藥物維穩(wěn)血糖、血脂、血壓，糾正電解質(zhì)紊亂、改善貧血等，同時(shí)進(jìn)行血液透析，高通量透析設(shè)備為B.Braun Avitum AG的聚砜膜透析器，透析液為含135～145 mmol/L鈉離子、2.0 mmol/L鉀離子、1.25～1.50 mmol/L 鈣離子的碳酸氫鹽溶液。全部透析器配備內(nèi)毒素過(guò)濾器，所有設(shè)備不得重復(fù)使用。對(duì)于透析設(shè)備試劑質(zhì)控如下：透析液細(xì)菌菌落數(shù)<100 CFU/ml，內(nèi)毒素<0.25 EU/ml。透析過(guò)程設(shè)置如下：透析液流量500 ml/min，血流量200～300 ml/min，4 h/次，3次/w。治療組在此基礎(chǔ)上額外加以口服復(fù)方血栓通膠囊(廣東眾生藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z20030017，規(guī)格0.5 g/粒)，每次3粒，每日3次。每組均治療8 w。

1.3觀察指標(biāo) ①抽取患者治療前與治療后晨起空腹外周靜脈血3 ml，血液靜置后，以3 000 r/min離心5 min，提取血清并低溫環(huán)境凍存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)患者腎功能指標(biāo)水平進(jìn)行以下檢測(cè)：24 h尿蛋白定量(Pr)、血清白蛋白(ALB)、血肌酐(Scr)等，采用美國(guó)貝克曼CX7+型全自動(dòng)生化儀。②提取血清方法同上，檢測(cè)血清中血管新生因子〔血管生成素(Ang)1、Ang2、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)〕和Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子〔白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-6、IL-10、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α〕等水平，氧化應(yīng)激相關(guān)產(chǎn)物原花青素(PC)、8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(OHdG)的含量等，以上均應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行檢測(cè)。丙二醛(MDA)的含量采用硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)比色法試劑盒測(cè)定，全部試劑盒購(gòu)自上海哈靈生物科技有限公司。③取上述靜脈血離心沉淀，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)測(cè)定血漿中p50、p65、人核因子κB抑制蛋白α(IκBα)mRNA、Iκβ激酶β(IKKβ)等NF-κB信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)基因表達(dá)。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為樣本應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，管家基因β-actin作為內(nèi)參，引物設(shè)計(jì)由Primer軟件完成，計(jì)算2-ΔΔCt即為目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平，引物由生工生物工程股份有限公司合成。見(jiàn)表1。④對(duì)患者均保持6個(gè)月有效隨訪，并關(guān)注其不良反應(yīng)發(fā)生情況。

表1 Real time-PCR引物序列

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組腎功能指標(biāo)水平比較 兩組治療前Pr、Scr、ALB無(wú)顯著差異(P>0.05)；治療后，兩組Pr、Scr均明顯下降，ALB均明顯升高，且相較于對(duì)照組，治療組Pr、Scr下降水平顯著更低(P<0.01)，ALB升高水平顯著更高(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 兩組腎功能指標(biāo)水平比較

2.2兩組氧化應(yīng)激相關(guān)產(chǎn)物水平比較 兩組治療前PC、8-OHdG、MDA水平無(wú)顯著差異(P>0.05)；治療后，兩組PC、8-OHdG、MDA均明顯下降，且相比于對(duì)照組，治療組下降程度更顯著(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 兩組氧化應(yīng)激相關(guān)產(chǎn)物水平比較

2.3兩組血管新生因子表達(dá)情況比較 治療前，兩組Ang1、Ang2、VEGF的表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)；兩組治療后Ang1、Ang2、VEGF水平均明顯下降，治療組相較于對(duì)照組上述因子降低趨勢(shì)更為顯著(P<0.01)。見(jiàn)表4。

2.4兩組NF-κB信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)基因表達(dá)比較 兩組患者p50、p65、IKKβ、IκBα mRNA基因表達(dá)水平在治療前基本無(wú)異(P>0.05)；隨著兩組方案治療的進(jìn)行，患者的p50、p65、IKKβ、IκBα mRNA基因表達(dá)均明顯下降，且通過(guò)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，治療組相較于對(duì)照組上述基因表達(dá)水平降低趨勢(shì)更為顯著(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 兩組血管新生因子及NF-κB信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)基因表達(dá)比較

2.5兩組Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子比較 治療前，兩組IL-4、IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療后，兩組IL-6、IL-1β、TNF-α均明顯下降，IL-4、IL-10均明顯升高，且相較于對(duì)照組，治療組IL-6、IL-1β、TNF-α下降水平顯著更低(P<0.01)，IL-4、IL-10升高水平顯著更高(P<0.01)。見(jiàn)表5。

表5 兩組Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子比較

2.6兩組不良反應(yīng)比較 全部受試者治療過(guò)程中，納差在治療組中出現(xiàn)1例，對(duì)照組中出現(xiàn)3例；頭暈在治療組中出現(xiàn)1例，對(duì)照組中出現(xiàn)5例，對(duì)比兩組間不良反應(yīng)發(fā)生率有顯著性差異(P<0.05)，以上不良反應(yīng)在積極治療后得以緩解。

3 討 論

DN作為糖尿病患者常見(jiàn)的嚴(yán)重慢性微血管并發(fā)癥之一，具有起病隱患，并可持續(xù)數(shù)年的特點(diǎn)。早期DN患者僅表現(xiàn)出腎小球?yàn)V過(guò)功能異常和微量白蛋白尿，隨著疾病的進(jìn)展，腎小球負(fù)擔(dān)加重的患者，容易不可逆轉(zhuǎn)的損害到腎功能，最終發(fā)展為終末期腎臟疾病，嚴(yán)重威脅人類健康和生命。目前，在臨床治療中廣泛使用的維持性血液透析技術(shù)已經(jīng)提高了慢性腎臟病的存活率〔6〕。但是在DN患者中存在著透析膜和透析液之間的生物不相容，再加上細(xì)菌內(nèi)毒素的直接入侵，導(dǎo)致大量的炎癥細(xì)胞被激活，從而引起炎癥級(jí)聯(lián)擴(kuò)增反應(yīng)造成內(nèi)臟的功能障礙。炎癥細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行的“呼吸爆發(fā)”釋放出大量的氧自由基，引起機(jī)體的氧化應(yīng)激，最終使體內(nèi)的氧化和抗氧化失衡，愈發(fā)趨于氧化，脂質(zhì)過(guò)氧化損害了腎小球，誘發(fā)腎間質(zhì)水腫，并加重病情〔7〕。

NF-κB為調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄主要因子，在炎癥反應(yīng)起始及發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用〔8〕。NF-κB的激活途徑主要包含經(jīng)典途徑和旁路途徑。NF-κB在靜息狀態(tài)下，以p50/p65二聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，抑制IκB與兩個(gè)亞基形成的同源和(或)異源二聚體再進(jìn)行結(jié)合，成為無(wú)活性的三聚體。然而發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，IκB被磷酸化、泛素化，阻止NF-κB進(jìn)入胞核與DNA結(jié)合，隨后p50/p65被釋放并發(fā)生核轉(zhuǎn)位，結(jié)合于相應(yīng)靶基因上的κB位點(diǎn)，從而對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起調(diào)節(jié)作用〔9〕。而非經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路是IKKα介導(dǎo)的，當(dāng)發(fā)生腎損傷時(shí)，在相關(guān)改變的刺激下，NF-κB誘導(dǎo)激酶作用，磷酸化激活細(xì)胞內(nèi)IKKa，形成以p52為特征的信號(hào)通路，其在細(xì)胞核內(nèi)與目的基因結(jié)合，調(diào)控基因表達(dá)〔10〕。細(xì)胞因子作為炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，是DN免疫炎癥主要參與者，而NF-κB在這一過(guò)程中起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)樞紐作用，是機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控者，活性同時(shí)受到細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外反饋調(diào)節(jié)的影響。在刺激作用下，細(xì)菌內(nèi)毒素可通過(guò)正反饋調(diào)節(jié)促使炎癥反應(yīng)信號(hào)進(jìn)一步擴(kuò)散，激活NF-κB，并使得受到IL-4、IL-10等抑炎細(xì)胞因子制約的IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎細(xì)胞因子大量轉(zhuǎn)錄，而后者亦可反調(diào)節(jié)NF-κB，使其激活，形成促炎因子的放大效應(yīng)，生成更多的細(xì)胞因子，影響正常機(jī)體的Th1/Th2動(dòng)態(tài)平衡〔11〕。本研究結(jié)果顯示，老年DN維持性血液透析患者存在Th1/Th2失衡，并且失衡向免疫炎癥方向漂移，但經(jīng)復(fù)方血栓通膠囊輔助治療后，患者機(jī)體Th1/Th2動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)得到顯著改善，這可能與復(fù)方血栓通膠囊通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路活化，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的變化有關(guān)。

有研究發(fā)現(xiàn)〔12〕，氧化應(yīng)激作用的對(duì)象是脂質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)，即當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜細(xì)胞中內(nèi)活性氧自由基的生成和消除的動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞后，可引起三者過(guò)氧化損傷，引起細(xì)胞的凋亡。其中PC是蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈發(fā)生氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，8-OHdG是核酸中鳥(niǎo)嘌呤被氧化的產(chǎn)物，脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物是MDA。本研究結(jié)果復(fù)方血栓通膠囊輔助治療可顯著抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、減少氧化產(chǎn)物的生成并增強(qiáng)抗氧化能力。分析原因可能與復(fù)方血栓通膠囊所含的黃芪、丹參均為補(bǔ)血之品，可益氣活血、化瘀通絡(luò)、走而不守，具有引經(jīng)之效，明顯改善多臟器的供血，從而起到抗氧化的作用。

相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明〔13〕，作為典型的微血管并發(fā)癥，血管內(nèi)皮損傷以及功能障礙在DN的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用，患者多表現(xiàn)為病灶局部的血管通透性顯著增加、血管生成量明顯增多。Ang家族是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性促血管生成因子，包括Ang1和Ang2，均可以通過(guò)與受體絡(luò)氨酸激酶受體(TiE)2結(jié)合而參與各種生理和病理性血管生成〔14〕。VEGF也是一種重要的促進(jìn)患者血管生成的介導(dǎo)因子。它可以加速血管生成并顯著促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管滲漏作用〔15〕。腎小球局部Ang1、Ang2、VEGF表達(dá)增加，會(huì)引發(fā)血管的細(xì)胞外基質(zhì)沉積，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，血管內(nèi)皮功能完整性破壞，共同損傷機(jī)體腎小球?yàn)V過(guò)功能。本研究對(duì)上述血管新生因子水平進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，復(fù)方血栓通膠囊輔助治療可有效調(diào)節(jié)老年DN維持性血液透析患者血清中血管活性分子表達(dá)水平，以改善微循環(huán)狀態(tài)，避免進(jìn)一步損害腎小球?yàn)V過(guò)功能。其產(chǎn)生有效作用可能是由于，在組成復(fù)方血栓通的藥物中，包含降低血液黏稠度的三七黃酮，間接減少紅細(xì)胞聚集率，改善微循環(huán)；三七皂苷，能夠有效促進(jìn)肝、腎和血清蛋白質(zhì)的合成，保護(hù)缺血組織中的微血管膜的穩(wěn)定性。

此外，比較兩組方案不良反應(yīng)發(fā)生率發(fā)現(xiàn)，治療組加以復(fù)方血栓通膠囊口服，并沒(méi)有產(chǎn)生更多不良反應(yīng)，相反還降低了患者因長(zhǎng)期血液透析所致的不良反應(yīng)發(fā)生。這可能由于復(fù)方血栓通膠囊本身對(duì)人體正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性和對(duì)組織器官毒性作用均較弱，且能夠通過(guò)提高患者機(jī)體免疫功能以改善因血液透析所引入的毒副作用。但本研究亦存在不足之處，即樣本量過(guò)小，未施盲法等因素，在后續(xù)研究中仍需行大樣本、多中心的雙盲試驗(yàn)，以更有效地探索對(duì)于老年DN維持性血液透析患者來(lái)說(shuō)，復(fù)方血栓通膠囊輔助治療的最終效應(yīng)。