不同直徑艾條懸灸改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠 TNF-α、IL-6和IL-2表達(dá)的比較

蔣志明,趙麗娜,吳立斌,王敏君,劉磊,胡玲,吳子建

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué),合肥 230012;2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院,合肥 230038)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種未明原因的自身免疫性疾病,以主要關(guān)節(jié)滑膜炎病變?yōu)橹?。在我國類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的患病率為0.24%～0.5%[1],女性多于男性。作為一種致殘率較高且易反復(fù)發(fā)作性疾病[2],該病預(yù)后不良,當(dāng)前還沒有很好的治療方式。RA屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇,又稱“歷節(jié)風(fēng)”“鶴膝風(fēng)”等,多因先天不足、后天失養(yǎng)至肝脾腎虧虛、正氣不足,受風(fēng)寒濕熱之邪侵襲經(jīng)絡(luò)而致機(jī)體氣血不通,關(guān)節(jié)屈伸不利。

目前,臨床針對RA的治療主要包括非類固醇類藥、抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素、生物制劑、基因治療及造血干細(xì)胞移植等[3],但是長期的藥物使用會損傷肝腎功能、引起骨髓抑制及胃腸道反應(yīng),為患者帶來二次傷害[4]。針灸治療 RA有著良好的效果,且無毒副作用被廣泛認(rèn)可[5]。已有研究[6-7]表明艾灸治療RA療效取決于施灸面積和溫度,不同的灸溫對 RA療效有著顯著差異,45 ℃灸溫的條件可以顯著提高艾灸的療效。本實驗以課題組前期工作[8]為基礎(chǔ),在控制溫度(45±1) ℃條件下,通過觀察不同直徑艾條懸灸對RA模型大鼠關(guān)節(jié)狀態(tài)和血清腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細(xì)胞介素(interleukine,IL)-6和白細(xì)胞介素(interleukine,IL)-2濃度的影響,探討不同直徑艾條的施灸面積在治療RA療效方面的差異,為艾灸治療RA的動物實驗研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康成年雄性SD大鼠48只,體質(zhì)量(170±10) g,購自安徽省實驗動物中心,許可證號為 SCXK(皖)2017-001。所購大鼠在動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)進(jìn)行分組。除正常組外,其余大鼠進(jìn)行RA造模,成功后隨機(jī)分為模型組、0.5 cm直徑艾條懸灸組(0.5 cm組)、0.9 cm直徑艾條懸灸組(0.9 cm組)、1.2 cm直徑艾條懸灸組(1.2 cm組)、1.8 cm直徑艾條懸灸組(1.8 cm組)。實驗大鼠均采用獨立送風(fēng)隔離籠具飼養(yǎng),每籠 4只,室溫為(27±1) ℃,濕度(55±5)%,每日更換墊料、補充飼料及飲用水。實驗過程嚴(yán)格遵循《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》[9]。

1.2 主要試劑與儀器

IL-2、IL-6、TNF-α ELISA檢測試劑盒(武漢基因美科技有限公司,貨號 JYM0648Ra,JYM0646Ra,JYM0635Ra);完全弗氏佐劑(Sigma,SLBW7430);蘇木素染色液(Baso,貨號 BA-4041);中性樹膠(國藥,貨號 10004160);伊紅染色液(Baso,貨號BA-4022);5年陳純艾絨條(湘香艾生物科技有限公司,Q/JXFF001-2015);非接觸式紅外測溫儀(優(yōu)德利科技有限公司,型號 UT302A),酶標(biāo)儀(雷社,型號 T-6000),光學(xué)顯微鏡(日本 OLYMPUS,型號 BX53),離心機(jī)(安徽嘉文,型號JW3021HR),切片機(jī)(Leica公司,RM2016),漩渦混合器(其林貝爾儀器制造公司,型號 GL-88B),生物組織包埋機(jī)(湖北亞光,型號 YB-7LF);電熱恒溫箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司,DNP-9162AE)。

1.3 模型制備與鑒定

采用模擬自然風(fēng)、寒、濕環(huán)境與生物因子弗氏完全佐劑(CFA)結(jié)合造模[10],將鼠籠置于自制造模箱內(nèi),應(yīng)用超聲霧化器調(diào)控箱內(nèi)濕度,并在箱內(nèi)添加適量冰塊,使其環(huán)境濕度、溫度分別維持在 80%～90%、(6±2) ℃,風(fēng)力定于高檔,時間持續(xù)12 h。所有需要造模的大鼠均放入上述風(fēng)、寒、濕環(huán)境中20 d(12 h/d)。第21天用0.5%碘伏消毒大鼠右后足跖關(guān)節(jié)部位,注射完全弗氏佐劑溶液0.15 mL致炎,建立RA大鼠模型。隨后對大鼠進(jìn)行為期3 d的觀察,以24 h大鼠足踝部出現(xiàn)急性炎癥腫脹,48 h后前肢或?qū)?cè)肢體甚至耳、尾部紅腫或炎性結(jié)節(jié)為造模成功,此間共23 d。

1.4 干預(yù)方法

課題組前期實驗研究[8]表明,在實驗艾條中選取市面相應(yīng)的艾條規(guī)格直徑分別為(0.5 cm、0.9 cm、1.2 cm、1.8 cm),施灸距離(小于1 cm、1～2 cm、2～3 cm、3～5 cm)可以實現(xiàn)穴區(qū)表面溫度為(45±1) ℃。參考《實驗針灸學(xué)》[11]中動物穴位圖譜大鼠右下肢足三里穴區(qū)作為施灸穴位。

實驗中各組大鼠做同樣抓取,并放置在懸空木架上,正常組、模型組不做干預(yù),各艾條懸灸組用5年陳艾條在距離大鼠足三里穴區(qū)進(jìn)行懸灸,并根據(jù)大鼠的避讓適時地調(diào)整施灸距離,使用紅外測溫儀監(jiān)控穴區(qū)表面溫度,控制在(45±1) ℃,每日1次,每次20 min,連續(xù)干預(yù)15 d。

1.5 樣本處理

在連續(xù)干預(yù) 15 d后,檢測大鼠足跖容積,稱重后10%水合氯醛溶液(0.3 mL/100 g)腹腔麻醉。暴露腹腔,腹主動脈處采血2 mL,放置4 ℃冰箱20 min后,在低溫離心機(jī)離心5 min,3 000 r/min,取其上清液。將取血后大鼠移至超凈工作臺,在冰上剪開大鼠膝關(guān)節(jié)皮膚,暴露膝關(guān)節(jié),沿髕骨向下使用鑷子完全分離呈淺淡黃色的滑膜組織,取下右后肢滑膜組織后固定在4%多聚甲醛中。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 關(guān)節(jié)腫脹度測量

在致炎前1 d、致炎后3 d及15 d對大鼠進(jìn)行足跖容積測量,通過足跖容積測量儀測量各組大鼠右后肢足跖容積。用記號筆在大鼠足踝關(guān)節(jié)處標(biāo)記劃線,固定住大鼠右后膝關(guān)節(jié)處使其后足伸直,緩慢放入測量杯內(nèi),當(dāng)測量杯水平面與鼠足上的測量標(biāo)線重疊時,啟動測量開關(guān)并讀取測量數(shù)據(jù),計算大鼠足跖腫脹度[12]。

1.6.2 組織病理學(xué)觀察

將取下的各組大鼠部分關(guān)節(jié)固定在 4%多聚甲醛中進(jìn)行石蠟包埋,切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,經(jīng)過烤片和脫蠟、水化、蘇木素染色、伊紅染色、透明和封片,后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀測拍照,觀察大鼠右后肢關(guān)節(jié)滑膜常規(guī)病理變化,并在高倍鏡下利用直尺對大鼠右后肢關(guān)節(jié)滑膜厚度進(jìn)行測量統(tǒng)計。

1.6.3 血清IL-6、IL-2和TNF-α水平檢測

大鼠全血離心后取上清液,采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法測定各組大鼠血清 IL-6、IL-2和TNF-α含量,按試劑盒說明書中的步驟進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品制備、加樣、抗體孵育等操作,加入終止液后酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測每孔吸光度值(OD值)。繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)方程,將每孔OD值代入標(biāo)準(zhǔn)方程求出每個樣本的濃度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,重復(fù)測量資料比較選用重復(fù)測量方差分析,根據(jù)球形檢驗結(jié)果采用 Sphericity Assumed法分析組間差異,后選用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較。多組比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間兩兩比較采用LSD法,若方差不齊者采用Games-Howell法;若不符合正態(tài)分布,采用 Cruskal Wallis秩和檢驗進(jìn)行分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況及不同直徑艾條灸足三里穴位穴區(qū)溫度的觀察

在模擬(風(fēng)、寒、濕)環(huán)境對大鼠進(jìn)行20 d飼養(yǎng)后各造模大鼠飲食量減少、精神不振、皮毛光澤度下降,注射弗氏完全佐劑后次日觀察到模型大鼠右足跖部腫脹明顯呈紅紫色,注射弗氏完全佐劑 3 d各造模組大鼠關(guān)節(jié)腫脹蔓延至踝部關(guān)節(jié),伴有步態(tài)改變、活動障礙,隨后對模型大鼠隨機(jī)分組進(jìn)行艾灸治療,通過調(diào)整不同直徑艾條施灸距離以保持穴區(qū)表面溫度在(45±1) ℃。詳見圖1。

圖1 不同直徑艾條灸足三里穴位穴區(qū)的觀察

2.2 各組大鼠足跖容積比較

結(jié)果顯示造模前1 d各組大鼠足跖容積比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。致炎后3 d,與正常組比較,模型組、0.5 cm組、0.9 cm組、1.2 cm組、1.8 cm組大鼠足跖與踝部急劇紅腫,足跖容積明顯增粗,提示造模成功(P＜0.01),模型組與各艾灸組大鼠之間足跖容積差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),表明在此造模條件下各組有可比性。在致炎后15 d,與模型組比較,各艾灸組大鼠足跖容積明顯減小(P＜0.01),其中 1.8 cm組效果最佳,低于 0.5 cm組(P＜0.05);而0.9 cm、1.2 cm、1.8 cm組間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠足跖容積比較 (±s,mL)

表1 各組大鼠足跖容積比較 (±s,mL)

注:與正常組比較1)P＜0.01,2)P＜0.05;與模型組比較3)P＜0.01;與0.5 cm組比較4)P＜0.05

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2.3 各組大鼠右后肢滑膜組織病理變化比較

組織病理學(xué)染色顯示正常組大鼠關(guān)節(jié)中滑膜細(xì)胞多呈單層且細(xì)胞分布整齊有規(guī)則,滑膜組織無炎性浸潤。模型組大鼠滑膜表面粗糙且增生嚴(yán)重,滑膜細(xì)胞排列紊亂無規(guī)則,滑膜組織中有大量炎性細(xì)胞浸潤。詳見圖2。

圖2 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織病理比較(HE,×200)

與正常組比較,模型組滑膜厚度增加差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較,0.5 cm、0.9 cm、1.2 cm、1.8 cm組滑膜組織炎性浸潤與滑膜增生情況均有改善(P＜0.01);0.9 cm、1.2 cm、1.8 cm組較0.5 cm組滑膜增生情況改善明顯(P＜0.01)。詳見表2。

表2 各組滑膜厚度量化比較 (±s,cm)

表2 各組滑膜厚度量化比較 (±s,cm)

注:與正常組比較 1)P＜0.01;模型組比較 2)P＜0.01;與0.5 cm組比較3)P＜0.01

組別 n 大鼠滑膜厚度正常組 8 0.065±0.1502)3)模型組 8 1.088±0.1951)0.5 cm組 8 0.600±0.1001)0.9 cm組 8 0.110±0.0.0201)2)3)1.2 cm組 8 0.082±0.0071)2)3)1.8 cm組 8 0.070±0.0081)2)3)

2.4 各組大鼠血清IL-6、IL-2、和TNF-α含量比較

與正常組比較,模型組血清中IL-6、TNF-α含量升高,IL-2含量下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較,各艾灸組治療后 IL-6、TNF-α含量下降,IL-2含量升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與0.5 cm組比較,0.9 cm組、1.2 cm組、1.8 cm組TNF-α、IL-6含量降低(P＜0.01),IL-2含量均有所上升(P＜0.01)。詳見表3。

表3 各組大鼠血清IL-6、IL-2、和TNF-α含量比較 (±s,pg/mL)

表3 各組大鼠血清IL-6、IL-2、和TNF-α含量比較 (±s,pg/mL)

注:與正常組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01;與0.5 cm組比較3)P＜0.01

組別 n IL-2 IL-6 TNF-α正常組 6 90.305±1.130 12.417±1.024 60.691±1.247模型組 6 51.181±0.6771) 29.248±1.4571) 93.122±2.2651)0.5 cm 組 6 59.911±1.5021)2) 25.258±0.0861)2) 71.872±1.7781)2)0.9 cm 組 6 68.841±2.9771)2)3) 19.912±0.9611)2)3) 67.096±1.4281)2)3)1.2 cm 組 6 69.853±1.2961)2)3) 19.900±1.1721)2)3) 67.363±2.2841)2)3)1.8 cm 組 6 70.851±1.0071)2)3) 19.753±0.6141)2)3) 67.699±2.0501)2)3)

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)多因先天不足、后天失養(yǎng),而致肝脾腎不足、氣血虧虛,而又復(fù)感風(fēng)寒濕邪,濕、熱、瘀相互蘊結(jié),阻于經(jīng)脈,使得機(jī)體肌肉、筋骨不得溫養(yǎng),致使關(guān)節(jié)痹阻、屈伸不利,出現(xiàn)疼痛、活動不利等癥狀。本實驗采取“病證”結(jié)合方式,通過模擬自然風(fēng)、寒、濕環(huán)境,結(jié)合CFA造模,符合中醫(yī)證候的特點,結(jié)果滿意。有研究表明艾灸療法有抗炎、鎮(zhèn)痛、提高機(jī)體免疫力的功效,對 RA治療有著良好的效果[13-15]。其作用機(jī)制主要與艾灸過程中光、熱、煙及生成物對機(jī)體表皮穴位刺激有關(guān),其中光、熱刺激被認(rèn)為是最主要的效應(yīng)因素[16-18],在治療過程中艾灸療效的發(fā)揮還與施灸的方法、灸量的多少、穴位的功效有關(guān)[19-21]。朱兵[22]證實了艾灸療效的發(fā)揮主要取決于施灸溫度、光熱輻射面積。喻曉春等[23]科學(xué)詮釋了腧穴的動態(tài)觀念,體表腧穴大小和功能強(qiáng)弱是隨著機(jī)體內(nèi)臟功能轉(zhuǎn)變而變化的。筆者認(rèn)為在艾灸過程中要根據(jù)患者的個人情況發(fā)揮艾灸效應(yīng)的最大化,故要根據(jù)不同患者情況選擇合適規(guī)格直徑的艾條,然而在對于實驗與臨床中關(guān)于艾條的直徑規(guī)格及對腧穴施灸過程中的距離、溫度、艾灸光熱輻射面積沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。有研究表明當(dāng)灸溫達(dá)到45 ℃時可以提高艾灸療效[7]。課題組前期實驗證實[8]使用不同直徑艾條在距離大鼠足三里穴區(qū)懸灸,可通過調(diào)節(jié)艾條與穴區(qū)的距離使灸溫達(dá)到45 ℃。本實驗在不燙傷大鼠條件下,通過適當(dāng)調(diào)整施灸距離以控制穴區(qū)表面溫度在(45±1) ℃,觀察不同直徑艾條施灸對RA大鼠的影響,進(jìn)而為探討艾灸療效與艾條灸輻射范圍的關(guān)系提供初步的實驗支持,為實驗中不同直徑艾條規(guī)格的選取等進(jìn)行探索。

實驗中經(jīng)過造模后大鼠急性炎癥紅腫、活動不便。通過艾條懸灸治療后,觀察到大鼠的一般情況、足跖腫脹程度、活動都有明顯的好轉(zhuǎn)。說明艾灸大鼠足三里穴區(qū)對RA大鼠具有一定的治療作用。通過對比各組足跖容積變化,發(fā)現(xiàn)0.9 cm、1.2 cm、1.8 cm較0.5 cm組大鼠足跖容積均有所下降,1.8 cm組RA大鼠足跖容積下降較0.5 cm組更為明顯,說明1.8 cm直徑的艾條在減輕RA大鼠足跖腫脹度方面更優(yōu)。

在病理形態(tài)改變上,RA大鼠關(guān)節(jié)滑膜增生及血管翳的形成,使關(guān)節(jié)軟骨與關(guān)節(jié)滑液的正常接觸被阻斷,影響骨質(zhì)營養(yǎng)的吸收,并進(jìn)一步破壞軟骨及韌帶造成關(guān)節(jié)腔的功能性損傷[24]。在經(jīng)過艾灸治療后各艾灸組RA大鼠滑膜增生、炎癥反應(yīng)情況均有所改善。而0.9 cm、1.2 cm、1.8 cm組大鼠在經(jīng)過治療后滑膜增生較0.5 cm組大鼠改善較為明顯。

RA大鼠足跖腫脹度與其炎性反應(yīng)及大鼠關(guān)節(jié)滑膜增生有相關(guān)性[25],在RA進(jìn)程中免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)[26-27],其中TNF-α、IL-6、IL-2在RA發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用[28-29]。有研究表明在RA患者血清中TNF-α、IL-6含量升高,IL-2含量下降,經(jīng)過有效治療后TNF-α、IL-6含量下降、IL-2含量上升[30]。本實驗表明,經(jīng)過造模后RA大鼠血清中炎性因子IL-6、TNF-α含量升高,IL-2含量減少,提示 RA大鼠免疫功能受損,全身炎性因子網(wǎng)絡(luò)平衡被打破[31-32],與臨床研究結(jié)果一致。通過15 d艾灸干預(yù)后各艾灸組較模型組 IL-6、TNF-α含量均有所降低,IL-2含量升高。在0.9 cm、1.2 cm、1.8 cm組大鼠血清中IL-6、TNF-α較0.5 cm組含量顯著下降,IL-2均上升明顯。說明0.9 cm、1.2 cm、1.8 cm直徑艾條在抗炎方面要優(yōu)于0.5 cm艾條。

由此可以說明,在不燙傷大鼠情況下,使用直徑0.5 cm、0.9 cm、1.2 cm、1.8 cm艾條,并適當(dāng)調(diào)節(jié)各組施灸距離使灸溫控制在(45±1) ℃,可以顯著減輕大鼠足跖腫脹程度及滑膜增生,減低血清中 IL-6、TNF-α的含量,增加IL-2的含量,在抗炎、抑制滑膜增生等方面有著明顯的療效;而直徑0.9 cm、1.2 cm、1.8 cm艾條在抗炎及抑制滑膜增生效果要明顯優(yōu)于0.5 cm直徑艾條。

本實驗初步研究了在相同穴區(qū)溫度條件下,懸灸的艾條直徑與艾灸療效之間的關(guān)系,為今后艾灸動物實驗中施灸艾條規(guī)格的選擇和臨床艾灸標(biāo)準(zhǔn)化提供了一定的參數(shù)意義。在實驗中存在著不可避免的人為因素和對不同直徑艾條在施灸過程中灸火在 RA大鼠體表穴區(qū)面積、溫度輻射等參數(shù)的觀察方面的不足,對實驗結(jié)果有一定的影響,需在今后實驗中進(jìn)行改進(jìn),以期得到更為標(biāo)準(zhǔn)化的艾灸方法。