圓柚酮生物轉(zhuǎn)化菌種篩選及培養(yǎng)基組分優(yōu)化

彭芷芊，曹婷，范剛，李曉，任婧楠，張璐璐

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院/環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.武漢食品化妝品檢驗(yàn)所，武漢 430040

圓柚酮((+)-nootkatone)是一種雙環(huán)倍半萜酮，是瓦倫西亞橘烯((+)-valencene)的同類衍生物。圓柚酮是柑橘類水果的典型香氣物質(zhì)，具有非常低的氣味閾值[1]，有葡萄柚氣味[2]，因此被廣泛應(yīng)用于商業(yè)香精和香料領(lǐng)域[3]。圓柚酮除了商業(yè)用途外，有多項(xiàng)研究證明其在醫(yī)學(xué)防治[4]、驅(qū)蟲防治[5]、抑菌[6]等方面也具有很高的價(jià)值。

圓柚酮在天然產(chǎn)物中含量很低，而且分離提純難度高，提取成本大[7]。工業(yè)上常通過化學(xué)合成[8-10]的方法來(lái)生產(chǎn)圓柚酮。然而根據(jù)歐洲食品法規(guī)，通過化學(xué)合成法得到的圓柚酮不能作為天然香料進(jìn)行銷售和使用，這使得合成的圓柚酮在市場(chǎng)流通中受到限制[11]。采用生物合成法或生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)制備的圓柚酮被認(rèn)為是天然的，可以添加到食品、化妝品中。

目前已有多項(xiàng)研究利用真菌、細(xì)菌和生物酶等將前體物質(zhì)瓦倫西亞橘烯生物轉(zhuǎn)化生成圓柚酮，但轉(zhuǎn)化技術(shù)還有所限制，且圓柚酮產(chǎn)量較低。天然圓柚酮主要存在于柑橘類水果果皮提取物中，推測(cè)柑橘果樹土壤中有豐富的具有多種降解作用的菌株，故本研究以柑橘果園土壤為樣本，旨在篩選出具有圓柚酮高轉(zhuǎn)化量的菌株，為后續(xù)圓柚酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種篩選自湖北省華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘果園土樣。

圓柚酮(>97.0%)，購(gòu)于日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社(TCI)；瓦倫西亞橘烯(>70.0%)，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：6 g/L Na2HPO4、0.50 g/L NaCl、3 g/L KH2PO4、1 g/L NH4Cl，溶于0.85%生理鹽水中。初篩培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+1%瓦倫西亞橘烯(0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃保存)。LB培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl，溶于蒸餾水。

萃取纖維頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)、固相微萃取頭，美國(guó)Supelo公司；6890N/5975B氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司； THZ-C-1全溫振蕩器，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS高壓滅菌鍋，購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 圓柚酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取1 g圓柚酮標(biāo)準(zhǔn)品，以無(wú)水乙醇為溶劑，分別配制終質(zhì)量濃度為100、150、200、300 mg/L的圓柚酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，于相同的GC-MS條件下測(cè)定圓柚酮峰面積，設(shè)置3次平行。

1.3 菌種篩選

取適量土樣于滅菌生理鹽水中混勻，接種于初篩培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min下培養(yǎng)2～7 d后，稀釋涂布分離菌株。

初篩：挑取單菌落接種于初篩培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min下培養(yǎng)，每隔12 h測(cè)1次菌液OD600值，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線，選取生長(zhǎng)良好的菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

復(fù)篩：將初篩菌株轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min下培養(yǎng)，待菌液OD600值達(dá)到0.6～0.7后添加0.1%瓦倫西亞橘烯，繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，取培養(yǎng)24、48、72 h的發(fā)酵液進(jìn)行SPME-GC-MS檢測(cè)，測(cè)定產(chǎn)物圓柚酮的含量。

選擇圓柚酮產(chǎn)量高的菌株活化后轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min下培養(yǎng)，待菌液OD600值達(dá)到0.6～0.7后添加0.1%瓦倫西亞橘烯，繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，取培養(yǎng)24、48、72 h的發(fā)酵液進(jìn)行SPME-GC-MS檢測(cè)，對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定分析。

根據(jù)對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分析，最終選擇圓柚酮轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)量最高的菌種進(jìn)行菌種鑒定。

1.4 GC-MS轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析

頂空萃取條件、氣相色譜-質(zhì)譜條件及定性分析方法參照李曉等[12]。

定量分析：圓柚酮定量采用外標(biāo)法，其他產(chǎn)物定量采用內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)為環(huán)己酮。圓柚酮轉(zhuǎn)化率及各揮發(fā)性產(chǎn)物質(zhì)量濃度的計(jì)算公式如下：

1.5 菌種形態(tài)鑒定及生理生化指標(biāo)測(cè)定

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[13]對(duì)菌株進(jìn)行多項(xiàng)生理生化指標(biāo)測(cè)定，包括氧化酶試驗(yàn)、淀粉水解、明膠液化、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、丙二酸鹽、運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)等項(xiàng)目。

1.6 16S rDNA 的擴(kuò)增和序列分析

提取細(xì)菌DNA后通過PCR技術(shù)擴(kuò)增16S rDNA，將PCR產(chǎn)物送武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序。通過NCBI網(wǎng)站的Blast搜索獲得與篩選菌株同源性最接近的菌株核苷酸序列，用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 單因素試驗(yàn)確定發(fā)酵培養(yǎng)基成分

1)菌株在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。將菌株接種于LB培養(yǎng)基中，設(shè)置3個(gè)平行，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔4 h取少量菌液測(cè)定OD600值，以無(wú)菌的LB培養(yǎng)基為空白對(duì)照，一直測(cè)定至72 h，繪制菌株在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。

2)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響?；A(chǔ)培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，分別以麥芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉、β-環(huán)糊精、甘油、α-乳糖、蔗糖作為唯一碳源，設(shè)置質(zhì)量濃度為30 g/L，待菌株培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，添加0.1%瓦倫西亞橘烯，轉(zhuǎn)化24 h，以圓柚酮轉(zhuǎn)化量及轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，考察碳源種類對(duì)Burkholderiasp. PZQ14轉(zhuǎn)化生成圓柚酮的影響。

3)發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響。蛋白胨作為有機(jī)氮源，被廣泛應(yīng)用于微生物和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中，對(duì)微生物的生長(zhǎng)發(fā)育有著重要作用。分別以20 g/L的蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、NH4Cl、(NH4)2SO4作為單一氮源，考察氮源種類對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響，轉(zhuǎn)化條件同本文“1.7 2)”。

4)發(fā)酵培養(yǎng)基中金屬離子對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響。無(wú)機(jī)鹽不僅是生物體內(nèi)酶或者輔酶的激活劑，而且在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生物大分子穩(wěn)定性方面也起著關(guān)鍵作用。分別添加0.5 g/L 的CaCl2、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、MgSO4·7H2O，考察無(wú)機(jī)鹽對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響，轉(zhuǎn)化條件同本文“1.7 2)”。

1.8 響應(yīng)面試驗(yàn)確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，結(jié)合Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以圓柚酮轉(zhuǎn)化量為響應(yīng)值，考察葡萄糖(A)、蛋白胨(B)、Fe2+(C)不同濃度組合對(duì)響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平 Table 1 Code and level of independent varlables used for Box-Behnken design g/L

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本試驗(yàn)所有測(cè)定重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Excel 2019、Orgin 2019與Design-Expert.V8.0.6.1軟件進(jìn)行分析與繪圖。用SPSS 20.0進(jìn)行ANOVA單因素方差分析，采用Duncan’s法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 圓柚酮標(biāo)準(zhǔn)曲線及初篩菌株生長(zhǎng)曲線的繪制

利用GC-MS測(cè)定不同濃度的圓柚酮峰面積，以圓柚酮濃度為橫坐標(biāo)，圓柚酮峰面積為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用Excel和Origin進(jìn)行線性回歸分析，所得的回歸方程為y=435876.89x-3109148.40，R2>0.99，表明回歸方程擬合度好，即該標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于后續(xù)試驗(yàn)定量分析。

將土樣的菌懸液在初篩培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，期間通過檢測(cè)培養(yǎng)液的OD600值來(lái)判斷是否有菌生長(zhǎng)。將培養(yǎng)液稀釋涂布平板，從稀釋比例為10-5的平板中挑取了16個(gè)單菌落，分別在初篩培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔12 h測(cè)培養(yǎng)液的OD600值，繪制16個(gè)菌株的生長(zhǎng)曲線。如圖1所示，根據(jù)生長(zhǎng)曲線，從中選出生長(zhǎng)狀況良好的菌株1、2、3、4、5、9、13、14、15進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

A：菌株1～8的生長(zhǎng)曲線；B：菌株9～16的生長(zhǎng)曲線。A:Growth curve of strains 1-8; B:Growth curve of strains 9-16.

2.2 復(fù)篩菌株轉(zhuǎn)化生成圓柚酮產(chǎn)量的對(duì)比

將初篩選出的菌株進(jìn)行富集培養(yǎng)，加入底物瓦倫西亞橘烯，利用GC-MS檢測(cè)產(chǎn)物中圓柚酮的含量，并設(shè)置不接菌株僅加入底物的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。由圖2可知，轉(zhuǎn)化24 h時(shí)，轉(zhuǎn)化生成圓柚酮產(chǎn)量較高的是菌株3、14；轉(zhuǎn)化48 h時(shí)，轉(zhuǎn)化生成圓柚酮產(chǎn)量最高的是菌株3、5、9、14；轉(zhuǎn)化72 h時(shí)，轉(zhuǎn)化生成圓柚酮產(chǎn)量最高的是菌株3、5、9、14。根據(jù)圓柚酮的產(chǎn)量，最后選擇菌株3、5、9、14進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖2 復(fù)篩菌株轉(zhuǎn)化生成圓柚酮產(chǎn)量的比較

2.3 菌株的GC-MS轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析

對(duì)菌株3、5、9、14進(jìn)行富集培養(yǎng)，待菌液的OD600值達(dá)到0.6～0.7后，加入底物瓦倫西亞橘烯，再繼續(xù)培養(yǎng)72 h，并分別取培養(yǎng)24、48、72 h的發(fā)酵液，利用GC-MS對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的種類及含量進(jìn)行檢測(cè)分析，其中圓柚酮作為目標(biāo)產(chǎn)物，其含量是通過外標(biāo)法計(jì)算，其他產(chǎn)物均采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。結(jié)果如表2所示，這4株菌株生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物種類及含量大致相同，包括α-松油醇、二氫香芹醇、(+)-二氫香芹酮、(+)-p-薄荷-1-烯-9-醇、芹子烯、β-紫羅酮、圓柚酮等7種物質(zhì)，其保留指數(shù)(RI)分別為1 101.44、1 105.81、1 114.19、1 203.96、1 382.14、1 387.61、1 705.19。

表2 篩選所得菌株在24、48、72 h對(duì)瓦倫西亞橘烯的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量 Table 2 Concentration of valencene biotransformation products obtained during different periods (24 h，48 h，72 h) mg/L

對(duì)于菌株3，在最初的24 h，主要產(chǎn)物有α-松油醇、二氫香芹醇、(+)-二氫香芹酮、(+)-p-薄荷-1-烯-9-醇、芹子烯、β-紫羅酮、圓柚酮，目標(biāo)產(chǎn)物圓柚酮含量為48.40±9.43 mg/L。轉(zhuǎn)化48 h后，圓柚酮含量增加(58.81±7.33 mg/L)；轉(zhuǎn)化72 h后，圓柚酮含量繼續(xù)增加(67.17±1.64 mg/L)，其他大部分產(chǎn)物含量隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間延長(zhǎng)而減少。

對(duì)于菌株5，在最初的24 h，主要產(chǎn)物有α-松油醇、(+)-二氫香芹酮、(+)-p-薄荷-1-烯-9-醇、芹子烯，目標(biāo)產(chǎn)物圓柚酮含量為50.60±4.33 mg/L。轉(zhuǎn)化48 h后，圓柚酮含量增加(67.29±5.07 mg/L)；轉(zhuǎn)化72 h后，圓柚酮含量略有下降(59.15±9.81 mg/L)。每個(gè)時(shí)間段都沒有檢測(cè)出二氫香芹醇，且(+)-二氫香芹酮的含量相比菌株3檢測(cè)出的更高，推測(cè)二氫香芹醇被完全氧化生成(+)-二氫香芹酮。

對(duì)于菌株9，在最初的24 h，主要產(chǎn)物有α-松油醇、(+)-二氫香芹酮、(+)-p-薄荷-1-烯-9-醇、芹子烯、β-紫羅酮、圓柚酮，目標(biāo)產(chǎn)物圓柚酮含量為50.95±7.86 mg/L。轉(zhuǎn)化48 h后，圓柚酮含量增加(74.24±8.80 mg/L)；轉(zhuǎn)化72 h后，圓柚酮含量略有下降(66.43±21.26 mg/L)，其他大部分產(chǎn)物含量隨轉(zhuǎn)化時(shí)間延長(zhǎng)有所減少。

對(duì)于菌株14，在最初的24 h，主要產(chǎn)物有α-松油醇、(+)-二氫香芹酮、(+)-p-薄荷-1-烯-9-醇、β-紫羅酮、圓柚酮，目標(biāo)產(chǎn)物圓柚酮含量為64.77±3.08 mg/L。轉(zhuǎn)化48 h后，圓柚酮含量增加(77.55±11.77 mg/L)；轉(zhuǎn)化72 h后，圓柚酮含量略有下降(76.03±7.16 mg/L)，含量趨于穩(wěn)定，其他產(chǎn)物含量變化不大。

2.4 菌株形態(tài)及生理生化特征鑒定

篩選所得的菌株為桿狀，為革蘭氏陰性菌，在平板上36 ℃培養(yǎng) 24 h，菌落呈圓形光滑狀、濕潤(rùn)、邊緣整齊、淡黃色、易挑取，在液體培養(yǎng)基中呈渾濁。生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氧化酶實(shí)驗(yàn)、明膠液化、葡萄糖、甘露醇和丙二酸鹽項(xiàng)目為陽(yáng)性，淀粉水解、麥芽糖、運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目為陰性，這些特征與伯克霍爾德菌屬極為相似。

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹的構(gòu)建

經(jīng)過16S rDNA序列分析，在NCBI網(wǎng)站上使用Blast比對(duì)，將獲得菌株的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，并構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。進(jìn)化樹結(jié)果(圖3)表明，篩選所得的菌株P(guān)ZQ14為Burkholderiasp.，屬于伯克霍爾德菌屬，將其命名為Burkholderiasp. PZQ14。

圖3 PZQ14菌株和其他菌株之間關(guān)系的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.6 單因素試驗(yàn)結(jié)果

以菌液的OD600值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制了Burkholderiasp. PZQ14在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線，如圖4所示。在37 ℃、200 r/min的培養(yǎng)條件下，菌株在4 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，24 h進(jìn)入穩(wěn)定期，52 h進(jìn)入衰亡期。

圖4 Burkholderia sp. PZQ14在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

不同碳源對(duì)Burkholderiasp. PZQ14轉(zhuǎn)化生成圓柚酮的影響如圖5所示。由圖5可見，不同碳源均能不同程度地促進(jìn)生物轉(zhuǎn)化生成圓柚酮，其中使用葡萄糖作為碳源時(shí)，生物轉(zhuǎn)化生成圓柚酮的轉(zhuǎn)化量最高，達(dá)到101.89 mg/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到11.07%。因此，選擇葡萄糖作為碳源。

圖5 不同碳源對(duì)Burkholderia sp. PZQ14轉(zhuǎn)化生成圓柚酮的影響

不同氮源對(duì)Burkholderiasp. PZQ14轉(zhuǎn)化生成圓柚酮的影響如圖6所示。本試驗(yàn)選取的5種氮源里，蛋白胨作為氮源時(shí)，生物轉(zhuǎn)化生成圓柚酮的轉(zhuǎn)化量最高，達(dá)到251.60 mg/L，轉(zhuǎn)化率為27.35%，其他氮源的轉(zhuǎn)化效果相差不大。因此，選擇蛋白胨作為氮源。

圖6 不同氮源對(duì)Burkholderia sp. PZQ14 轉(zhuǎn)化生成圓柚酮的影響

不同金屬離子對(duì)Burkholderiasp. PZQ14轉(zhuǎn)化生成圓柚酮的影響如圖7所示。由圖7可見，各金屬離子的添加都會(huì)導(dǎo)致圓柚酮的產(chǎn)量有不同程度的增加，尤其是Fe2+，說明Fe2+的添加對(duì)于其轉(zhuǎn)化具有明顯的促進(jìn)作用。因此，選擇Fe2+添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中。

圖7 不同金屬離子對(duì)Burkholderia sp. PZQ14轉(zhuǎn)化生成圓柚酮的影響

2.7 響應(yīng)面模型建立與顯著性檢驗(yàn)

響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果見表3。將表3中的數(shù)據(jù)利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行分析，建立葡萄糖(A)、蛋白胨(B)、Fe2+(C)與圓柚酮轉(zhuǎn)化量(Y)的回歸模型如下：

Y=117.56+11.05A-20.10B+13.65C-8.22AB+82.16AC-5.35BC+74.58A2+86.72B2+39.24C2。顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表4。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 Table 3 Box-Behnken experimental design and results

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析 Table 4 Analysis of variance for the Box-Behnken experiment

對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。由表4可見，回歸模型極顯著(P<0.000 1)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.057 9>0.05)，說明失擬因素不存在。根據(jù)回歸方程系數(shù)(R2=0.982 7)可判斷出，該模型與實(shí)際情況具有較好的擬合度。P值和F值的大小在某種程度上可以作為判斷各因素對(duì)響應(yīng)值的影響作用強(qiáng)弱的參照，由此可得出影響圓柚酮轉(zhuǎn)化量的強(qiáng)弱關(guān)系依次為：蛋白胨(B)> FeSO4(C)>葡萄糖(A)。

根據(jù)模型得到的最佳培養(yǎng)基成分為：葡萄糖37.64 g/L、蛋白胨24.86 g/L、FeSO40.60 g/L，此條件下，圓柚酮轉(zhuǎn)化量為332.414 mg/L。參考實(shí)際操作，將優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分調(diào)整為：葡萄糖38 g/L、蛋白胨25 g/L、FeSO40.60 g/L，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，圓柚酮轉(zhuǎn)化量為328.69±17.88 mg/L，與預(yù)測(cè)值非常接近，說明該回歸模型能較好預(yù)測(cè)培養(yǎng)基最佳成分，所得優(yōu)化后的試驗(yàn)因素參數(shù)組合有較強(qiáng)的可行性。

3 討 論

已有研究報(bào)道瓦倫西亞橘烯轉(zhuǎn)化生成圓柚酮的過程分為兩步，具體為：細(xì)胞色素P450酶區(qū)域選擇性地催化瓦倫西亞橘烯烯丙基C2-羥基化，產(chǎn)生中間產(chǎn)物順式和反式-圓柚醇，隨后這2種醇被非選擇性醇脫氫酶(ADH)進(jìn)一步氧化為圓柚酮[14]。

目前有多項(xiàng)研究利用細(xì)菌、真菌以及生物組織等將瓦倫西亞橘烯轉(zhuǎn)化生成圓柚酮。Palmerin-Carreno等[15]利用解脂耶氏酵母2.2ab實(shí)現(xiàn)了瓦倫西亞橘烯到圓柚酮的生物轉(zhuǎn)化，圓柚酮產(chǎn)量約為773 mg/L，生物轉(zhuǎn)化率和體積生產(chǎn)率達(dá)到82.3%和8.06 mg/ (L·h)，然而要運(yùn)用到實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)還存在一定限制。利用生物酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化具有高效性和專一性，Girhard等[16]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌的細(xì)胞色素CYP109B1能催化瓦倫西亞橘烯的氧化，生成圓柚醇和圓柚酮，并通過建立水-有機(jī)溶劑兩相系統(tǒng)，使圓柚醇和圓柚酮產(chǎn)量達(dá)到94 mg/L，占總產(chǎn)物的97%。現(xiàn)有研究利用生物酶來(lái)生產(chǎn)圓柚酮的轉(zhuǎn)化量及轉(zhuǎn)化率都較低，本研究旨在篩選出圓柚酮高轉(zhuǎn)化量的菌株，通過條件優(yōu)化以及對(duì)轉(zhuǎn)化機(jī)制的研究進(jìn)一步提高圓柚酮的產(chǎn)量，為工業(yè)化生產(chǎn)圓柚酮提供理論基礎(chǔ)。

研究首先測(cè)得菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線，選取生長(zhǎng)良好的菌株富集培養(yǎng)后加入底物瓦倫西亞橘烯轉(zhuǎn)化72 h，以測(cè)得圓柚酮的含量為指標(biāo)，選取圓柚酮轉(zhuǎn)化量高的菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。利用SPME-GC-MS技術(shù)，對(duì)篩選所得菌株轉(zhuǎn)化瓦倫西亞橘烯生成的產(chǎn)物種類及含量進(jìn)行測(cè)定與分析。對(duì)所篩菌株進(jìn)行菌種鑒定，確定其屬于伯克霍爾德菌屬，將其命名為Burkholderiasp. PZQ14。本研究以前體物質(zhì)瓦倫西亞橘烯作為唯一碳源，初篩過程中即可以去掉不符合要求的菌株，大大縮短了菌種篩選的工作量；隨后再以圓柚酮產(chǎn)量為指標(biāo)，縮小篩選范圍。這種菌種篩選方式具有高度專一性，快速高效，工作量小，提高了篩菌效率。

隨后通過單因素試驗(yàn)，確定了生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基碳源、氮源及金屬離子種類。對(duì)于碳源，試驗(yàn)結(jié)果顯示，葡萄糖作為碳源時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)化生成圓柚酮具有更明顯的促進(jìn)作用。李紀(jì)順等[17]采用均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)探討了不同碳源對(duì)越南伯克霍爾德氏菌B418生長(zhǎng)的影響，結(jié)果也顯示葡萄糖對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響最大。對(duì)于氮源，試驗(yàn)結(jié)果選擇了蛋白胨作為最佳氮源，這與林仙菊等[18]的試驗(yàn)結(jié)果相符。同時(shí)，在研究不同金屬離子種類對(duì)生物轉(zhuǎn)化效率的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加Fe2+相比于添加Mg2+，圓柚酮的轉(zhuǎn)化量提高了186 mg/L，這可能是因?yàn)樵谕邆愇鱽嗛傧┺D(zhuǎn)化生成圓柚酮這一代謝過程中，細(xì)胞色素P450酶是起主要作用的，而CYP450酶系的成員都含有鐵血紅素和半胱氨酸組合的活性中心[19]，因此Fe2+的添加對(duì)其轉(zhuǎn)化具有顯著的促進(jìn)作用。此試驗(yàn)結(jié)果也從側(cè)面證明，Burkholderiasp. PZQ14中含有的細(xì)胞色素P450酶可能對(duì)瓦倫西亞橘烯轉(zhuǎn)化生成圓柚酮起到了關(guān)鍵作用。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定最佳培養(yǎng)基組分為：38 g/L葡萄糖、25 g/L蛋白胨、0.60 g/L FeSO4，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，圓柚酮轉(zhuǎn)化量為328.69±17.88 mg/L，相比LB培養(yǎng)基，圓柚酮轉(zhuǎn)化量提高了251 mg/L，與Girhard等[16]所得到的94 mg/L的圓柚酮產(chǎn)量相比，提高了234.69 mg/L。另外，菌株生物轉(zhuǎn)化生成圓柚酮的轉(zhuǎn)化效率還受多種因素影響，包括添加底物的時(shí)間、底物濃度、轉(zhuǎn)化時(shí)間、助溶劑種類及濃度、培養(yǎng)溫度和轉(zhuǎn)速等，后續(xù)還可以對(duì)這些轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，以進(jìn)一步提高圓柚酮的產(chǎn)量。

伯克霍爾德菌屬是一種廣泛存在于水、土壤、植物和人體中的革蘭氏陰性細(xì)菌，已有多項(xiàng)研究證明該菌屬表現(xiàn)出多種酶活性。Wu等[20]研究發(fā)現(xiàn)菌株BurkholderiacepaciaGS3C中的細(xì)胞色素P450單加氧酶對(duì)十六烷生物降解活性具有顯著的促進(jìn)作用；Matsuda等[21]從熱帶泥炭分離出1株Burkholderiasp. KTC-1，該菌在酸性條件下以(+)-兒茶素為唯一碳源生長(zhǎng)，并通過菌體中(+)-兒茶素羥化酶和白花青素脫氫酶的作用，將(+)-兒茶素生物轉(zhuǎn)化為花旗松素。而本研究則利用伯克霍爾德菌屬，實(shí)現(xiàn)了瓦倫西亞橘烯到圓柚酮的生物轉(zhuǎn)化，也為伯克霍爾德菌屬生物催化功能研究提供了參考。

后續(xù)可以對(duì)Burkholderiasp. PZQ14的基因組進(jìn)行測(cè)序，通過基因組注釋與分析，了解菌株的生物學(xué)特性，并篩選可能參與瓦倫西亞橘烯代謝的相關(guān)基因，再對(duì)其基因功能進(jìn)行研究。此外，還可以對(duì)瓦倫西亞橘烯生物轉(zhuǎn)化過程中起關(guān)鍵作用的酶進(jìn)行分離純化，為了解圓柚酮的生物合成及其相關(guān)酶的研究提供新的途徑。