烏鱧水泡病毒L蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體制備

張艷維，張永安，涂加鋼

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430070

彈狀病毒是與人類疾病及工業(yè)、農(nóng)業(yè)密切相關(guān)的一種重要病毒，其宿主范圍廣泛，主要包括哺乳動(dòng)物、鳥類、昆蟲、魚類、爬行動(dòng)物及植物等[1]，導(dǎo)致宿主患病或死亡，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。彈狀病毒是一類不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，具有包膜，病毒粒子長(zhǎng)100～430 nm，直徑45～100 nm[2]。目前已經(jīng)分離出來的魚類彈狀病毒有十幾種[3]。烏鱧水泡病毒(snakehead vesiculovirus,SHVV)是仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院林蠡教授在2014年從廣東順德市的一個(gè)烏鱧養(yǎng)殖場(chǎng)中分離得到的1株彈狀病毒，其基因組全長(zhǎng)約11 kb，主要編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白：核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA依賴性RNA聚合酶蛋白(L)，屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、Perhabdovirus屬。感染SHVV的魚會(huì)出現(xiàn)典型的彈狀病毒病癥狀，主要包括出血、水腫等[4]。

L蛋白是彈狀病毒的一種結(jié)構(gòu)蛋白，同時(shí)也是分子質(zhì)量最大的彈狀病毒蛋白，約240 ku，具有RNA聚合、mRNA封端和封端甲基化等功能[5-7]。據(jù)報(bào)道β微管蛋白、延伸因子1和鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶均與水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)的L蛋白相互作用，并合成VSV RNA的必要因子[8-10]。DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶1與埃博拉病毒L蛋白相互作用，是L蛋白聚合酶活性所必需的[11]。動(dòng)力蛋白輕鏈 1作為轉(zhuǎn)錄因子，通過與病毒L蛋白結(jié)合促進(jìn)狂犬病毒的初級(jí)轉(zhuǎn)錄[12]。雖然L蛋白的功能在人類或其他哺乳動(dòng)物彈狀病毒感染中已得到廣泛研究[11-13]，但其在魚類彈狀病毒感染中的作用尚無報(bào)道。

由于SHVV是一種新的魚類彈狀病毒，目前還沒有有效的防治SHVV感染的措施?；贚蛋白在病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中的重要作用，本研究將L基因前900個(gè)堿基構(gòu)建在原核表達(dá)載體pET-32a(+)上，進(jìn)行表達(dá)及純化，并將純化的蛋白免疫新西蘭大白兔，制備SHVV L蛋白多克隆抗體，以期為后續(xù)SHVV的致病機(jī)制和L蛋白的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料來源

SHVV由林蠡教授分離并在筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。斑點(diǎn)叉尾鮰卵巢細(xì)胞系(CCO)、質(zhì)粒pET-32a(+)和pCDNA-L由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。試驗(yàn)所用Trans 5ɑ大腸桿菌克隆菌株和BL21大腸桿菌表達(dá)菌株均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和限制性內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化回收、膠回收試劑盒購(gòu)自廣州美基生物科技有限公司。

1.2 引物合成

根據(jù)GenBank上發(fā)表的序列(登錄號(hào)：KP876483.1)，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，引物序列如下：

L-FW:5′ -TGGGATCCGGTACC
AAGCTTATGGATTATTCTCAGGAATA-3′;
L-BW:5′ -TGGTGGTGGTGGTGCTCGAG
AGATAATTGAAGATTACACA-3′

其中，下劃線為酶切位點(diǎn)(HindⅢ和XhoⅠ)，送至武漢擎科生物有限公司進(jìn)行合成。

1.3 pET32a-L重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1)PCR擴(kuò)增目的基因。以含有SHVVL基因的質(zhì)粒pCDNA-L為模板，L-FW和L-BW為引物，PCR擴(kuò)增L基因的前900 bp。擴(kuò)增程序如下：98 ℃變性10 s、55 ℃退火5 s、72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，PCR擴(kuò)增結(jié)束后，產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

2)酶切、連接和轉(zhuǎn)化。將原核表達(dá)載體pET-32a(+)用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，1 h后將酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后使用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收、純化。并采用Clone Express One Step Cloning Kit將純化回收的L片段和酶切后的載體pET-32a(+)進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans 5ɑ感受態(tài)細(xì)胞中。步驟為：冰浴30 min；42 ℃水浴45 s后立刻冰浴2 min；加入400 μL LB液體培養(yǎng)基后放入37 ℃搖床中培養(yǎng)1 h；吸取100 μL菌液均勻涂布在含氨芐的LB固體培養(yǎng)基中；置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。

3)重組質(zhì)粒的提取及鑒定。挑取單克隆菌落接種到含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，將其置于37 ℃的搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，按照質(zhì)粒抽提試劑盒操作步驟提取重組質(zhì)粒。以載體pET-32a(+)的通用測(cè)序引物(T7-FW 5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′和T7-BW 5′ -GCTAGTTATTGCT CAGCG -3′)對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，將陽性質(zhì)粒送至武漢擎科生物有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank中SHVVL基因序列(登錄號(hào)：KP876483.1)進(jìn)行核苷酸序列比較分析。

1.4 重組His-L蛋白的表達(dá)和純化

將測(cè)序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，并將PCR鑒定為陽性的菌落接種在含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃、180 r/min的搖床中震蕩培養(yǎng)。當(dāng)菌液OD值達(dá)到0.6時(shí)加入IPTG至其終濃度為1 mmol/L。并在16 ℃、150 r/min的搖床中過夜誘導(dǎo)表達(dá)。離心收集誘導(dǎo)表達(dá)的菌液，并用PBS重懸洗滌2次后進(jìn)行高壓破碎，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定分析。

通過上述分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白表達(dá)在上清中，對(duì)轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的大腸桿菌進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，離心后收集菌體，PBS重懸。4 ℃高壓破碎，離心收集上清。采用Ni-NTA His-Band 樹脂親和層析柱試劑盒(Qiagen，德國(guó))純化重組蛋白，參照生工生物Ni-NTA純化樹脂預(yù)裝柱操作說明進(jìn)行純化。再使用蛋白質(zhì)濃縮管通過離心方法濃縮重組蛋白。濃縮后的重組蛋白通過SDS-PAGE電泳鑒定。

1.5 多克隆抗體的制備

將純化后的重組His-L蛋白免疫新西蘭大白兔，分3次進(jìn)行免疫，第1次免疫時(shí)將蛋白抗原與等量的弗式完全佐劑混合，充分乳化，采用皮下多點(diǎn)注射法免疫新西蘭大白兔。第2次和第3次免疫分別在第1次免疫后第2、4周后進(jìn)行，采用蛋白抗原與等量的弗式不完全佐劑混合，乳化后進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射。在第3次免疫7 d后經(jīng)心臟取血，4 ℃隔夜靜置，5 000 r/min離心30 min，收集血清。檢測(cè)多克隆抗體的效價(jià)，并將血清保存在-80 ℃冰箱備用。

1.6 Western blot 檢測(cè)

使用T25細(xì)胞瓶在含有10%熱滅活胎牛血清(Gibco,New Zealand)、青霉素(100 μg/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)的MEM(HyClone,USA)培養(yǎng)基中培養(yǎng)CCO細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后感染SHVV，并把未感染SHVV的CCO細(xì)胞作為對(duì)照。24 h后收集細(xì)胞樣品，加入SDS上樣緩沖液，將樣品放置在金屬浴中煮沸10 min，進(jìn)行Western blot分析。具體步驟如下：配制6%的聚丙烯酰胺；點(diǎn)樣后80 V進(jìn)行電泳；待溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)分離膠底部時(shí)，結(jié)束電泳，并用轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)印裝置將蛋白條帶電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，以9 V恒壓電轉(zhuǎn)印60 min；5%脫脂奶粉封閉2 h，將一抗(L多抗1∶1 000稀釋；GST標(biāo)簽抗體1∶5 000稀釋)4 ℃過夜孵育，TBST緩沖液清洗3次，每5 min清洗1次；HRP標(biāo)記的兔抗或者鼠抗作為二抗孵育1 h；TBST緩沖液清洗3次，每次10 min。將PVDF膜置于ECL發(fā)光液中，采用化學(xué)發(fā)光法顯色、拍照分析。

1.7 間接免疫熒光檢測(cè)

將長(zhǎng)滿單層狀況良好的CCO細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，感染SHVV，并用未感染SHVV的CCO細(xì)胞作為對(duì)照。孵育1 h后換成5% FBS的MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次，加入4%多聚甲醛室溫固定15 min；PBS洗滌3次后，加入0.5% Triton，室溫孵育15 min；PBS洗滌3次后，加入5% PBSA封閉1 h；加入L蛋白多克隆抗體，37 ℃孵育2 h；PBS洗滌3次后，加入FITC標(biāo)記的熒光二抗(1∶100～1∶200)，37 ℃避光孵育1 h；PBS洗滌3次后，用DAPI核染15 min，再用PBS洗滌3次。用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 SHVV L基因的克隆

用含有SHVVL基因的質(zhì)粒pCDNA-L為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約為900 bp的特異性條帶(圖1)，與目的片段大小一致。

M：DNA marker 2000；1：L基因。M:DNA marker 2000; 1:Target gene of L.

2.2 誘導(dǎo)表達(dá)并純化His-L蛋白

對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的菌液進(jìn)行高壓破碎，收集上清、流穿液及洗脫下來的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析(圖2)，結(jié)果顯示，該融合蛋白在上清中表達(dá)，且在第2次洗脫下來的濃度最高，往后依次降低，蛋白分子質(zhì)量約42 ku，與目的蛋白大小預(yù)期一致。收集純化濃縮后的融合蛋白樣品，及誘導(dǎo)前的樣品用His標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)前的樣品無條帶，純化后的His-L重組蛋白樣品在42 ku左右有1條清晰的帶，與預(yù)期大小一致。

A：SDS-PAGE 鑒定純化的His-L重組蛋白。 M：蛋白 marker； 1：誘導(dǎo)后上清； 2：流穿液； 3～8：純化后洗脫的蛋白； B：His-L重組蛋白的鑒定。 1：誘導(dǎo)前蛋白樣；2：純化的His-L重組蛋白樣。A:Purified recombinant His-L protein by SDS-PAGE. M:Protein marker; 1:Supernatant of bacteria after induction; 2:Liquid flow-through; 3-8:Purified protein eluted after purification; B:Identification of His-L recombinant protein.1:Protein before induction; 2:Purified recombinant protein His-L.

2.3 Western blot驗(yàn)證L蛋白多抗

重組蛋白His-L經(jīng)純化后免疫新西蘭大白兔，收集血清獲得L蛋白的多克隆抗體。通過Western blot進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，感染SHVV的蛋白樣品有1條單一的條帶，大小約220 ku，與目的蛋白大小一致(圖3)，而未感染SHVV的CCO細(xì)胞樣品沒有出現(xiàn)條帶，表明制備的多克隆抗體能特異性識(shí)別L蛋白。

M：蛋白 marker； 1：感染 SHVV的CCO細(xì)胞樣； 2：未感染SHVV的CCO細(xì)胞樣。M:Protein marker; 1:SHVV infected CCO cell; 2:Uninfected CCO cell.

2.4 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)研究L蛋白的亞細(xì)胞定位

將SHVV感染CCO細(xì)胞，通過間接免疫熒光觀察L蛋白的定位情況。結(jié)果顯示，L蛋白多克隆抗體可以特異性地識(shí)別感染SHVV的CCO細(xì)胞中的L蛋白，且L蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中，這與SHVV在細(xì)胞質(zhì)完成基因組的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制一致。而對(duì)照組則沒有觀察到綠色熒光(圖4)。表明制備的多克隆抗體可以特異性地與L蛋白結(jié)合。

圖4 間接免疫熒光分析L多克隆抗體特異性

3 討 論

烏鱧是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種，SHVV是從發(fā)病烏鱧中分離得到的1株彈狀病毒，SHVV感染給我國(guó)烏鱧養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。彈狀病毒的L蛋白有5個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：RdRp、Cap、CD(連接器域)、MT(甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域)和CTD(C端結(jié)構(gòu)域)[14]，其中RdRp是主要的功能結(jié)構(gòu)域，發(fā)揮聚合酶的功能。Rahmeh等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，VSV P蛋白可以與L蛋白結(jié)合，并將L蛋白C端球狀結(jié)構(gòu)域(CD、MT和CTD)穩(wěn)定地錨定在N端RdRp和CAP結(jié)構(gòu)域。Qiu等[16]對(duì)VSV的L蛋白N末端結(jié)構(gòu)域進(jìn)行連續(xù)突變，表明N末端許多氨基酸對(duì)于病毒轉(zhuǎn)錄是必需的。本研究的目的是制備SHVV L蛋白的多克隆抗體，為研究其功能提供基礎(chǔ)資料。但因?yàn)镾HVV L蛋白分子質(zhì)量大(240 ku)，原核表達(dá)及純化較困難，因此，本研究在制備L蛋白多克隆抗體時(shí)選擇RdRp結(jié)構(gòu)域的前900 bp進(jìn)行克隆、蛋白表達(dá)和純化以及制備多克隆抗體。這也是本研究的不足之處，后續(xù)有待更深入地對(duì)RdRp全結(jié)構(gòu)域進(jìn)行研究，以及進(jìn)一步開展L蛋白與宿主蛋白互作、L蛋白的翻譯后修飾等深入研究。

我們用制備的L蛋白多克隆抗體檢測(cè)SHVV感染CCO細(xì)胞過程中的L蛋白，能觀察到1條清晰的目的蛋白條帶，說明L蛋白R(shí)dRp結(jié)構(gòu)域具有很好的免疫原性。但是也能觀察到一些雜帶，說明L蛋白多克隆抗體可能與細(xì)胞蛋白或其他病毒蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合。

我們利用L蛋白多克隆抗體對(duì)SHVV感染CCO細(xì)胞過程中的L蛋白的亞細(xì)胞進(jìn)行了定位研究，但是只是對(duì)SHVV感染CCO細(xì)胞24 h的L蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，沒有對(duì)病毒感染不同時(shí)間點(diǎn)開展研究，因而無法確定L蛋白在SHVV感染的早期和晚期是否發(fā)生定位的改變，后續(xù)有待進(jìn)一步深入研究。