日本鲺(Argulus japonicus)寄生大口黑鱸的首次報道及分子系統(tǒng)發(fā)育研究

楊浩，顧澤茂

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/湖北省水生動物病害防控工程技術(shù)研究中心,武漢 430070

鲺(Argulus)是一類世界分布的甲殼動物寄生蟲，可感染多種淡水魚類，引發(fā)鲺病，造成宿主的大量死亡[1-2]。目前，鲺屬內(nèi)已報道的物種有129個[3]。其中，日本鲺(ArgulusjaponicusThiele 1900)是最常見的種類之一，最早由Thiele在日本發(fā)現(xiàn)并命名，之后隨著漁業(yè)貿(mào)易的全球化，在世界各流域均有發(fā)現(xiàn)和報道[4-5]。日本鲺在我國分布的首次記載是在1939年[6]，遺憾的是該研究未對宿主進行說明。之后，王耕南[7]、黃琪琰等[8]分別在顯微和亞顯微水平上詳細描述了日本鲺的形態(tài)學(xué)特征。2014年，Alsarakibi等[9]調(diào)查了廣東地區(qū)青魚、鰱、虹鱒和鱖等日本鲺的寄生情況，發(fā)現(xiàn)在8種淡水魚上均存在寄生和感染，且池塘養(yǎng)殖條件下日本鲺的感染率和感染強度顯著高于野生環(huán)境，提出在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中應(yīng)尤其重視日本鲺病。

大口黑鱸(Micropterussalmoides)，俗稱加州鱸，隸屬于鱸形目(Perciformes)、太陽魚科(Centrachidae)、黑鱸屬(Micropterus)，原產(chǎn)于北美洲的密西西比河流域，20世紀(jì)80年代引入我國[10]。近年來，大口黑鱸已成為我國重要的特色淡水養(yǎng)殖品種之一。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大、集約化程度的提高，大口黑鱸病害頻發(fā)，嚴(yán)重限制了其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。2020年5月，湖北省武漢市某養(yǎng)殖場的大口黑鱸發(fā)生了一種鲺病，并造成大口黑鱸大量死亡。本文采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法，研究了鲺的種類和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，將其鑒定為日本鲺，這是日本鲺寄生大口黑鱸的首次報道。

1 材料與方法

1.1 病魚采集與寄生蟲分離

2020年5月，湖北省武漢市某養(yǎng)殖場的大口黑鱸發(fā)病，取4尾病魚(全長30～40 cm，體質(zhì)量750～850 g)，肉眼觀察并記錄病魚體表癥狀，吸管吸取少量蒸餾水浸濕病魚體表，用鑷子輕輕夾取體表寄生蟲轉(zhuǎn)移至裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，用于后續(xù)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。

1.2 寄生蟲形態(tài)學(xué)觀察

挑選形態(tài)完整的蟲體于1.5 mL的離心管中，加入4%多聚甲醛于-4 ℃固定24 h。用鑷子將固定好的蟲體轉(zhuǎn)移到干凈的載玻片上，使用Olympus BX53顯微鏡和Olympus DP72數(shù)碼成像系統(tǒng)從低倍鏡到高倍鏡依次觀察并記錄蟲體的形態(tài)特征。

1.3 基因組DNA提取，SSU rDNA擴增、測序及系統(tǒng)發(fā)育分析

1)基因組總DNA提取。將本文“1.1”中的蟲體收集到1.5 mL的離心管中，滴加95%的乙醇于-4 ℃下固定24 h。取出蟲體置于新的1.5 mL的EP中，待乙醇揮發(fā)后，用基因組提取試劑盒(康為世紀(jì)，北京)提取蟲體基因組總DNA，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2)PCR擴增SSU rDNA基因序列。選用SSU rDNA通用引物，上游引物：5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′，下游引物：5′-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3′[11]，以材料與方法“1.3 1)”中提取的總DNA為模板，進行PCR擴增。50 μL的PCR反應(yīng)體系包括：2 × EsTaqMasterMix(25 μL)、游引物(2 μL)、下游引物(2 μL)、模板DNA(2 μL)、ddH2O(19 μL)。PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

3)基因克隆與測序。對本文“1.3 2)”中PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Omega，美國)純化回收PCR產(chǎn)物，將純化后的PCR產(chǎn)物連接至pMDTM-19T載體中，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α，接于含有Amp的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h后挑取單克隆于LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)5 h，經(jīng)PCR驗證后，將陽性菌株送北京奧科鼎盛生物科技有限公司進行測序。

4)序列比對與分析。將測序結(jié)果進行Blast比對，下載BLASTn相似序列以及鲺屬中已收錄的小亞基核糖體序列。經(jīng)MAFFT(v7.273)[12]軟件比對后，使用G-blocks(v0.91b)[13]刪除模糊比對片段，利用IQ-TREE (v1.6.12)[14]軟件構(gòu)建ML系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病魚癥狀

病魚沿池塘四周漫游，呈缺氧狀態(tài)，活力不強，易捕捉，死亡率達30%。肉眼可見鰭條處有出血癥狀，體表有淡黃色的圓盤狀寄生蟲吸附或移行(圖1)。鏡檢鰓部無寄生蟲，剖檢內(nèi)臟器官無明顯病變。

A.患病大口黑鱸的整體圖，箭頭指示寄生在體表的鲺； B.大口黑鱸體表病灶圖，箭頭指示病灶周圍的鲺； C.寄生大口黑鱸的鲺(箭頭指示)。A. Holistic view of the largemouth bass,arrowheads indicated the parasites; B.The focus of the parasitic infection,arrowheads indicated the parasites; C.Holistic view of the fish louse.

2.2 寄生蟲形態(tài)特征

鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)蟲體背部有馬蹄形背甲，長度略大于寬度，兩側(cè)葉上有明顯的樹狀色素條，側(cè)葉末端鈍圓，伸達第三游泳足的后緣(圖2A)；腹面觀蟲體背甲前緣和兩側(cè)覆蓋有尖端向后的小刺(圖2B)，由前向后依次為第一觸角、第二觸角、復(fù)眼、吸盤、口器、顎足、游泳足。腹部呈對稱的兩橢圓狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)腹部中是否含卵或者對稱的紡錘狀精巢可判斷蟲體性別(圖2A～D)。形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)顯示，雌性蟲體體長1.93±0.46(1.42～2.54)(n=13) mm，背甲大小為(1.17～2.09) mm× (1.00～1.78) mm；雄性蟲體體長2.18±0.49(1.57～2.87)(n=11) mm，背甲大小為(1.18～2.08) mm× (1.00～1.96) mm。

A.雌性背面觀； B.雌性腹面觀； C.雄性背面觀； D.雄性腹面觀。A. Dorsal view of the female; B. Ventral view of the female; C. Dorsal view of the male; D. Ventral view of the male.

寄生蟲各部位形態(tài)描述如下：

第一觸角(Fa)的基節(jié)由2節(jié)組成。第1節(jié)和第2節(jié)的基部各著生1根刺。第2節(jié)的基部外側(cè)有一凸起。第2節(jié)末端著生1個尖端向腹面的鉤狀刺。鞭由2節(jié)組成，末端著生5根剛毛(圖3A)。

第二觸角(Sa)由5節(jié)組成。在第1節(jié)基部有1根刺，在第1到第4節(jié)的末端各著生3～4根剛毛。第5節(jié)末端著生5根剛毛(圖3B)。

小顎特化為吸盤。雌性吸盤幾丁質(zhì)條數(shù)為44～52，每條幾丁質(zhì)條由1枚長基片和4～5枚圓形幾丁質(zhì)片組成。雄性吸盤幾丁質(zhì)條數(shù)為46～47，每條幾丁質(zhì)條由1枚長基片和6～7枚圓形幾丁質(zhì)片組成(圖3C)。

顎足：共5節(jié)，第1節(jié)基部有3根粗壯的刺，在第1節(jié)的腹面有一橢圓狀的突起，凸起的表面分布有尖端向后的小刺，在凸起的后緣著生有中間的3根長剛毛和兩側(cè)的5根短剛毛。第2節(jié)至第5節(jié)長度逐漸減小，在第2節(jié)的前端至第4節(jié)，表面有分叉的倒刺。在第5節(jié)末端，著生有2根倒刺和1個指狀凸起(圖3D)。

A： 觸角，無尾箭頭示第一觸角鞭，有尾箭頭示第二觸角； B：第二觸角； C：吸盤； D：顎足； E：口管； F：游泳足(雄性)； G： 雄性腹部； H：雌性腹部。Eg：卵； Fa：第一觸角； Ll：下唇； Sa：第二觸角； Sv:精囊； Te：精巢； Ul：上唇。A：Antenna,arrowhead showed the scourge of first antenna,arrow indicated the second antenna; B：Second antenna; C：Sucker,which supportedby sclerites; D：Maxilla; E：Mouth tube; F：Male swimming legs; G：Male abdomen; H：Female abdomen. Eg:Egg; Fa:First antenna; Ll:Lower lip; Sa:Second antenna; Sv:Seminal vesicle; Te:Testis; Ul:Upper lip.

口管呈短圓筒形，位于兩吸盤之間。口管由上、下唇組成，上唇(Ul)向腹面呈半圓形，下唇(Ll)形狀不規(guī)則，在兩側(cè)及中間有凸起(圖3E)。

游泳足4對。每對游泳足可分為4節(jié)，且表面分布有倒刺。每對游泳足在第4節(jié)出現(xiàn)2個分支，分支上著生有8根剛毛。在第1對游泳足第2節(jié)的內(nèi)側(cè)，著生有1根剛毛(圖3F)。雄性第2游泳足基節(jié)腹面有基節(jié)突，第三游泳足的內(nèi)側(cè)有一直徑約為200 μm的隆起，為精囊(Sv)。雌、雄蟲體在第四游泳足的基節(jié)內(nèi)側(cè)均有一乳頭狀凸起，在凸起以及第3節(jié)上均著生許多剛毛(圖3F)。

腹部長度與全長的比值為0.21～0.29，長度略大于寬度(長0.36～0.83 mm，寬0.31～0.65 mm)。中央裂深度為腹長的1/2～1/4。尾叉基位，其上著生4根剛毛。雄性腹部中可見兩對稱的卵圓形的精巢(T)(圖3 G)，雌性成蟲腹部中可見未孵化的卵(E)(圖3H)。

本研究采集到的物種與鲺屬內(nèi)其他物種的形態(tài)測量學(xué)指標(biāo)比較見表1。

表1 本研究物種與鲺屬其他物種的形態(tài)測量學(xué)數(shù)據(jù) Table 1 Measurements of Argulus sp. in this study with other species of Argulus

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

獲得SSU rDNA基因片段長度1 800 bp，經(jīng)BLAST比對發(fā)現(xiàn)，本研究中日本鲺株系(MW866569)與Arguluscoregoni(JQ740820)、Argulusfoliaceus(JQ740819)、Argulussp. (JN558648)的相似度均為99.84%，與日本鲺(JN558647)和Argulusnobilis(MH458748)的相似度為99.77%，與鲺屬內(nèi)其他物種的相似度在94.00%～99.70%?；赟SU rDNA序列構(gòu)建ML系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示，鲺屬內(nèi)物種存在3個支系(Clade)，除JN558647株系外，日本鲺已報道株系均聚為一支(CladeⅠ)，本研究采集的日本鲺(Argulussp.)位于CladeⅠ基部，與日本鲺KF747859和KF747860株系親緣關(guān)系最近(圖4)。同時，A.foliaceus(KF747861)和A.rhipidiophorus(747862)也聚于CladeⅠ中，與日本鲺在進化樹中呈并系關(guān)系。

圖4 基于SSU rDNA序列構(gòu)建的ML系統(tǒng)進化樹(本研究物種標(biāo)星號表示)

3 討 論

日本鲺引起的鲺病常導(dǎo)致多種水產(chǎn)動物的大量死亡，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[21-23]。大口黑鱸是我國重要的淡水養(yǎng)殖品種，然而，在其寄生蟲病的研究中，鮮有鲺病的相關(guān)報道。Bauer[24]、Angelina等[25]、Ingham等[26]以及鄧國成等[27]開展了大口黑鱸的寄生蟲病調(diào)查，報道了單殖吸蟲、復(fù)殖吸蟲、絳蟲、棘頭蟲、線蟲以及其他甲殼動物寄生蟲，但均未發(fā)現(xiàn)鲺的寄生。Troxel[28]在加利福利亞州13尾大口黑鱸中檢測到1只鲺，并將其鑒定為A.flavescens。Cloutman[29]和Mcalister等[30]分別調(diào)查了阿肯色州大口黑鱸的寄生蟲感染情況，前者發(fā)現(xiàn)并報道了A.mississippiensis的寄生和感染，后者分離到一種形態(tài)有所差異的鲺，遺憾的是他們未對該鲺作進一步的鑒定。在我國，梁芝源等[31]在300份患病大口黑鱸樣本中檢測1種鲺的寄生和感染，但該研究僅限于發(fā)現(xiàn)報道，尚未對病原在種級階元上作出鑒定。本研究在湖北省武漢市的大口黑鱸體表分離到1種鲺，并采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法，將其鑒定為日本鲺(A.japonicus)，通過檢索資料發(fā)現(xiàn)，這是日本鲺寄生大口黑鱸的首次報道。

鲺的物種鑒定主要是通過比較形態(tài)學(xué)特征的差異，常用的形態(tài)特征包括腹部側(cè)葉的形狀[1]、吸盤幾丁質(zhì)條數(shù)以及幾丁質(zhì)片的數(shù)量[7]等。日本鲺腹部側(cè)葉鈍圓，可明顯區(qū)別于腹部側(cè)葉尖形的物種，如A.coregoni[21]以及喻氏鲺(Argulusyui)[7]等(表1)。另外，王耕南[7]、Wadeh等[2]發(fā)現(xiàn)日本鲺吸盤的幾丁質(zhì)條通常由3～8個數(shù)量不等的幾丁質(zhì)片組成，雄性(3～4)少于雌性(5～8)。本研究發(fā)現(xiàn)，雌性個體幾丁質(zhì)片的數(shù)量(5～6)與前人研究相符，但是雄性個體幾丁質(zhì)片數(shù)量高達7～8，這可能是由于日本鲺處于的發(fā)育階段不同，導(dǎo)致在形態(tài)上有所差異[32-33]。A.foliaceus在形態(tài)上與日本鲺相似，肉眼觀察難以將二者區(qū)分。Yildiz等[34]及Noaman等[35]經(jīng)過觀察發(fā)現(xiàn)日本鲺和A.foliaceus的區(qū)別在于前者背甲的側(cè)葉末端蓋過腹部，且腹部中央裂的深度可延伸至中部，這與本研究結(jié)果相符。另外，Soes等[5]發(fā)現(xiàn)日本鲺的雄性個體的游泳足基部有基節(jié)突，而A.foliaceus無此特征。本研究發(fā)現(xiàn)雄性個體的第二游泳足有明顯的基節(jié)凸起(圖3F)，進一步證實了Soes等[5]的觀點。日本鲺在體色方面也表現(xiàn)出較大差異，本研究中的日本鲺體色淡黃，而在Zoysa等[1]、Wadeh等[2]和王耕南[7]的研究中表現(xiàn)為乳白色，體色的差異可能與宿主的種類及養(yǎng)殖生境有關(guān)。

因此，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法鑒定鲺存在一定的難度，尤其是對處于幼體階段的鲺，幾乎無法進行準(zhǔn)確鑒定[32]。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)已廣泛用于寄生蟲的物種鑒定。Sahoo等[36]利用隨機擴增多態(tài)DNA技術(shù)分析了印度13個地區(qū)鲺的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)可以準(zhǔn)確區(qū)分日本鲺和Argulussiamensis。Patra等[37]利用SSU rDNA序列分析了鲺屬內(nèi)物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SSU rDNA序列能有效區(qū)分該屬內(nèi)的物種。本研究基于SSU rDNA序列構(gòu)建了ML系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)鲺屬內(nèi)物種主要聚為3個支系，拓撲結(jié)構(gòu)與Patra等[37]的相同。然而，日本鲺所在支系(CladeⅠ)中其株系與A.foliaceus和A.rhipidiophorus呈多系類群，日本鲺JN558647株系甚至聚于CladeⅡ中，這給確定日本鲺的系統(tǒng)進化位置帶來困難。檢索GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列信息發(fā)現(xiàn)，大部分鲺物種的SSU rDNA序列僅限于序列信息，缺乏相關(guān)文獻報道的支持，存在誤定種的可能。因此，在今后的工作中，應(yīng)補充更多鲺物種分子數(shù)據(jù)，同時，結(jié)合其他的分子標(biāo)記探究鲺屬物種的系統(tǒng)進化關(guān)系。

綜上所述，本研究首次報道日本鲺在大口黑鱸體表的寄生，豐富了日本鲺生物學(xué)特性的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，增補了大口黑鱸的寄生蟲病名錄，可為今后大口黑鱸鲺病的診斷和防治提供理論依據(jù)。