種蛋孵化信息的無損檢測研究進展

祝志慧，葉子凡，楊凱，華俊杰,何昱廷

華中農業(yè)大學工學院，武漢430070

我國是雞蛋生產與消費大國，近幾十年來隨著我國農業(yè)自動化進程加速，雞蛋生產也從散戶的小作坊生產模式逐漸轉型為孵化工廠的車間流水化作業(yè)模式。據(jù)國家統(tǒng)計局相關報表統(tǒng)計，2020年全國禽蛋產量達3 467.76萬t[1]。種蛋胚胎發(fā)育率為86%～95%[2]，這意味著每年都有大量的種蛋不能孵化。無精蛋和死胚蛋混雜在活胚蛋中會對孵化率產生不利影響。如果在孵化早期檢測并清除不能孵化的種蛋，能夠節(jié)省資源，提高孵化質量及避免滋生細菌造成交叉感染。另外，家禽繁育中雛禽的性別與經濟效益密切相關，雞種蛋在孵化過程中，雄性和雌性胚胎比例約為1∶1，大部分剛孵出的雄雛會被攪碎用于生產飼料，這不僅增加了人工成本，而且還造成了禽蛋資源高質低用及違反動物福利等問題[3]。因此，有必要在孵化期早期乃至孵化之前檢測出雞蛋內部的孵化信息，包括受精檢測、成活性檢測、雌雄鑒別，這不僅有利于孵化工廠有計劃地進行孵化生產配置，而且對于合理利用種蛋資源、提高我國禽蛋產業(yè)經濟效益具有重大意義。

雞蛋的孵化過程需要21 d，分為早期(第1至7天)、中期(第8至14天)和后期(第15至21天)。目前國內的孵化工廠一般在孵化后期使用照蛋器人工識別受精蛋、無精蛋和死胚蛋，這種檢測方法效率低、勞動強度大、成本高。而雞蛋孵化期的雌雄性別鑒定尚為空白狀態(tài)。自20世紀末起，美國率先開始采用機器視覺檢測技術進行蛋品的孵化信息檢測和分級[4]。近10多年來，隨著人工智能技術的快速發(fā)展，國內外研究人員陸續(xù)提出了一系列基于生產實際的種蛋孵化信息無損檢測方法，主要包括光電檢測方法、機器視覺法、光譜法等，進一步推動了種蛋孵化信息檢測技術向高精度和智能化方向發(fā)展。本文對國內外近十多年來的雞種蛋孵化信息檢測研究情況進行綜述，按照雞種蛋孵化時間和檢測目標將檢測任務歸為三類，即孵前受精無損檢測、孵化期成活性檢測和孵化期性別檢測。

1 孵前受精無損檢測

雞種蛋受精后的卵子形成合子，最后形成受精蛋，未受精的次級卵母細胞則形成無精蛋[5]。孵化前，解剖受精蛋與未受精蛋后觀察發(fā)現(xiàn)，受精蛋的胚盤附著在卵黃上(圖1)。圖1A中受精蛋的紅圈標記區(qū)域中的白色圓盤是受精蛋的胚盤，呈同心圓狀，顏色濃、面積略大；圖1B中無精蛋的紅圈標記區(qū)域中的白色小點是無精蛋的胚珠，顏色相對較淺、面積略小，為一個形狀不規(guī)則的小白點。一般情況下，受精蛋的胚盤大小是無精蛋胚珠的1.5～2倍[6]。由于孵前種蛋發(fā)育程度較低以及蛋殼和雞蛋內容物的阻擋，照蛋檢測無法對受精蛋和無精蛋進行有效區(qū)分。近年來，隨著檢測技術的進步和人們對孵前檢測關注的增加，有不少學者對種蛋孵前受精信息開展了無損檢測研究。

A.受精蛋 Fertile egg; B.無精蛋 Infertile egg.

研究表明，受精蛋和無精蛋在外形特征上存在一定差異，一般來說，無精蛋外形短而粗，偏圓，受精蛋外形則細而長[7-8]。另一方面，黃鑫[9]及樊銀珍等[10]提出受精蛋和無精蛋的氣孔數(shù)及超微結構存在顯著差異，可以利用透射光和反射光將這種差異反映在光譜圖上。因而，現(xiàn)有雞種蛋孵前無損檢測方法研究主要圍繞著種蛋的外形特征和光譜特征兩方面展開。

祝志慧等[11]基于近紅外漫反射技術對孵前種蛋進行無損檢測，通過對譜區(qū)范圍進行篩選，比較不同預處理方法和主成分因子數(shù)的判別精度，最后獲得基于馬氏距離法的最佳判別模型，對孵前種蛋識別正確率達到91.67%。2015年，祝志慧等[5]從種蛋孵前透射高光譜圖像中提取圖像外形特征(長短軸之比、伸長度、圓度、蛋黃面積與整蛋面積之比)，并融合高光譜信息進行建模,通過對比發(fā)現(xiàn)，基于圖像-光譜融合信息的相關向量機模型的分類精度表現(xiàn)最好(93%)，檢測時間最短。該研究為孵前無損檢測受精蛋和無精蛋提供了一種可行的方案。李慶旭等[12]提出了基于可見/近紅外光譜和卷積神經網絡模型的鴨蛋孵前受精檢測方法，測試集精度為97.41%。深度學習是近年來的熱門研究領域之一，它對部分經典機器學習模型無法解決的問題往往也能較好地解決。鑒于鴨蛋與雞蛋具有類似的生理結構和發(fā)育特性，該研究給雞蛋孵前受精檢測提供了一種有益的思路。由于受精蛋和無精蛋在上孵前區(qū)別尚不明顯，目前該階段種蛋受精信息檢測的研究成果仍以光譜技術為主，其他無損檢測技術如機器視覺、光電檢測法的應用未見報道。

2 孵化期成活性檢測

孵化期成活性的無損檢測主要包括兩部分，即孵化早期受精蛋和無精蛋檢測，以及孵化期活胚蛋和死胚蛋檢測。孵化開始后，受精蛋內部活性物質的新陳代謝加速并發(fā)生一系列生理變化，而無精蛋內部則相對較穩(wěn)定，它們主要在兩方面存在明顯的差異，其一，受精蛋內部在孵化期第2 天開始出現(xiàn)血液[13]，血液中的紅細胞在卵黃囊處形成“血島”，“血島”經過發(fā)育形成最初的血管[14](圖2A)；其二，受精蛋發(fā)育過程中，離子泵變得活躍并將鈉離子從蛋清運輸?shù)铰涯覂萚15]，此時蛋白中的水分隨之流動積累到卵黃囊，從而使得蛋白變黏稠、殼膜變干燥[16-18]。從雞蛋中血管的形成和種蛋內部生理結構變化兩方面，能夠檢測到孵化早期種蛋的受精信息。另一方面，受精蛋中包含一部分弱精蛋，隨著孵化時間延長會逐漸轉化為死胚蛋。在照蛋檢測中，無精蛋透光性較強且沒有血線(圖2B)，死胚蛋則會形成血環(huán)(圖2C)，同時由于血管退化，蛋黃顏色會變成乳黃色[19-20]。綜上，對孵化期成活性的檢測主要基于光學方法，包括但不限于光電檢測法、機器視覺法、光譜方法等。

A.活胚蛋 Fertile egg; B.無精蛋 Infertile egg; C.死胚蛋 Dead egg.

雞蛋內部結構發(fā)生變化時，最直觀的表現(xiàn)之一就是內容物含量發(fā)生改變，因此可以采用感光元件(如光敏電阻等)與光源配合，根據(jù)透光量變化的差異對受精蛋、無精蛋和死胚蛋進行鑒別。朱垓[21]研發(fā)出一種基于發(fā)光二極管(light-emitting diode,LED)和光敏元器件的檢測裝置與方法。研究人員采用相對吸收率指標反映雞蛋的透光性，對LED的光色和光強進行優(yōu)化，結果顯示在種蛋孵化期第6天，暖白光LED的檢測效果最好，該方法對“梅嶺”品種粉殼蛋的無精蛋與死胚蛋的識別率達到100%。張穎萍等[22]提出的一種針對粉殼和綠殼蛋的成活性檢測裝置，在孵化期第5到第7天期間可以判斷種蛋能否孵化，準確率達到93.3%～94.2%。光電檢測法借助種蛋透光量反映內部孵化信息，檢測裝置結構簡單、成本低廉，是一種有效的無損檢測技術。

可見/近紅外光可以穿透種蛋，其透射光譜包含大量有用信息，相較于光電檢測法，光譜方法往往具有更高的檢測精度。張偉等[23]基于高光譜透射圖像，針對400～1 000 nm波段檢測種蛋是否發(fā)育，在孵化期第1、2、3天的判別準確率分別達到78.8%、90.3%、98.6%。秦五昌等[24]采集可見/近紅外透射光譜并建立基于Fisher算法的無精蛋判別模型，該模型在孵化24 h時識別準確率達到87.18%，孵化120 h時識別準確率則達到了96.58%。由于能夠在種蛋仍保持較好新鮮度(孵化24 h)時就可以及時檢測出無精蛋，因此該方法具有一定商業(yè)推廣價值。

孵化工廠一般采取機電一體化的流水線生產模式，這對種蛋檢測精度和速度都提出了更高的要求。機器視覺方法通常直接獲取、分析種蛋在光照下的機器視覺圖像，通過機器學習方法建模，從而實現(xiàn)單個種蛋乃至群蛋的孵化信息檢測。國外，Hashemzadeh等[25]提出一種自動照蛋裝置，在接收到待測蛋的圖像后自動完成灰度化、特征增強等一系列圖像處理流程，單次可完成6枚雞蛋的受精信息檢測，判別準確率在孵化期第4 和第5天分別達到97.73%和98.25%。Koodtalang等[26]訓練的卷積神經網絡將種蛋孵化期第7 天的識別準確率提升到100%，能夠實現(xiàn)單次48枚雞蛋的受精信息檢測。國內方面，吳林峰等[27]研發(fā)的針對群蛋的孵化信息在線檢測裝置，在孵化期第7 天對褐殼種蛋的受精信息判別率達到96.7%，可以滿足孵化工廠一次性檢測6行7列共42枚蛋的需求。顏廷玉[28]針對孵化期第5 天和第9 天雞種蛋設計了2種成活性檢測模型，分別是雙通道卷積神經網絡(TB-CNN)以及結合聯(lián)合監(jiān)督與通道加權的卷積神經網絡(SJ-CNN)，試驗結果表明這2種模型泛化能力較強，準確率均達到98%以上。李慶旭等[29]基于Alexnet神經網絡改進，搭建了種鴨蛋受精信息識別網絡，對孵化3 d的種鴨蛋判別精度高達98.87%，平均每枚蛋檢測耗時0.24 s。與傳統(tǒng)機器視覺方法不同，深度學習將圖像特征選取環(huán)節(jié)融入了訓練過程，避免了圖像特征不明顯、提取難度較大的問題，同時能更好地抵抗噪聲。近年來，機器視覺技術與物聯(lián)網、大數(shù)據(jù)以及深度學習結合，在種蛋檢測方面展現(xiàn)出較高的準確率和穩(wěn)定性，迎合了未來孵化工廠高通量、智能化的生產趨勢。

作為一種應用廣泛的無損檢測技術，熱成像技術在孵化期成活性檢測領域也得到了一定的應用。研究表明，受精蛋和無精蛋的表面溫度存在差異，Danno等[30]就曾指出，孵化期內受精蛋表面溫度比無精蛋高0.3～1.3 ℃。2013年，Lin等[31]提取孵化14 d種蛋的熱成像信息，運用灰度共生矩陣計算種蛋特征值并建立種蛋成活性檢測模型，該檢測系統(tǒng)在2～3 s內可一次性完成36枚蛋的識別，準確率達到96%。在此基礎上，國內相關研究成果將檢測時間進一步提前。蔡健榮等[32]將孵化4 d的種蛋從38.5 ℃的孵化箱轉移到22 ℃恒溫箱進行自然冷卻，并基于熱成像技術采集群蛋的時間序列圖像。研究發(fā)現(xiàn)無精蛋熱圖像灰度值小于等于150的區(qū)域面積明顯大于受精蛋，因此將該部分面積與整個感興趣區(qū)域面積之比作為種蛋活性判別特征建模，模型在5 min內即可實現(xiàn)成活性判別，總體判別率達到90.7%。

此外，有研究人員通過理化方法檢測種蛋的心跳信號和氣味，也可以達到無損檢測胚胎成活性的目的。動物體的心跳會引起微動脈內血液容積變化，造成動脈血液對光的吸收量發(fā)生變化。胡玉舟[33]基于光電容積描記技術，采集第9天的雞胚脈搏信號，建立基于卷積神經網絡和深度神經網絡成活性檢測模型，準確率分別達到99.5%和99.6%。向小樂[3]借助GC-MS和電子鼻等技術檢測孵化早期種蛋的氣味，發(fā)現(xiàn)不同受精狀態(tài)雞蛋的揮發(fā)性有機物(volatile organic compounds,VOCs)組成存在差異，建立了基于典型判別分析的受精蛋檢測模，正確率達到100%。氣味檢測技術除了具備無損檢測的優(yōu)點，所獲得的檢測結果還為其機制研究提供了質譜定性信息，這有利于該方法的后續(xù)研究。然而本研究存在樣本種類單一、數(shù)量較少等缺點，因而普適性尚待提高。

相較于孵前成活性檢測，孵化期的成活性檢測往往能夠獲得更高的準確率，且在一定時間范圍內隨孵化日齡增加，檢測效果會越來越好，這是由種蛋自身發(fā)育特點決定的。光電檢測法、可見/近紅外光譜法、機器視覺法、熱成像法等無損檢測技術在該領域均有所應用，其中一部分檢測方案準確率高、檢測速度快，已成功應用到生產實際。值得關注的是，由于種蛋在孵化24 h以內時其品質還屬于新鮮狀態(tài),在孵化72 h后的種雞蛋品質變?yōu)椴豢墒秤眉墑e[24]，因此越早檢測出無精蛋和死胚蛋并分揀出來，就越有利于提高蛋品利用率、減少浪費。在保證檢測準確率的前提下，將無精蛋和死胚蛋識別時間盡可能提前是未來孵化期成活性檢測研究的一個趨勢。

3 孵化期性別檢測

雞胚的性別主要是由基因決定，但激素對其也有一定的作用。在雞胚發(fā)育過程中，性腺的發(fā)育受到基因調控的酶作用和激素的共同作用[34]。實驗室中對種蛋的雌雄檢測一般采用PCR擴增方法及雞胚尿囊液雌激素含量鑒定法等分子生物學技術，盡管這些檢測技術具備較高的準確率，但都需要進行破殼采樣，并不適用于孵化工廠生產模式?，F(xiàn)階段我國禽蛋產業(yè)在孵化期的雌雄鑒別領域尚存在技術空白，孵化場對性別檢測普遍是在幼雛階段使用翻肛法[35]、羽速法[36]和羽色法[37]。翻肛法依賴于專業(yè)人員人工檢測，耗時耗力，易造成幼雛的損傷；而羽速法和羽色法，依賴于品種改良中的專有品種，推廣性差。近十多年來，為解決種蛋孵化期的無損性別檢測難題，研究人員主要采用機器視覺、光譜技術、氣味法等檢測方法。

3.1 機器視覺檢測種蛋的雌雄性別

機器視覺檢測種蛋主要是針對外形識別和血線識別。首先，蛋形指數(shù)是受到較多關注的一個雌雄鑒別因素。王家培等[38]研究發(fā)現(xiàn)，黔東南小香雞蛋形指數(shù)與性別具有顯著相關性。進一步，王茗祎等[39]提出一種基于蛋形特征參數(shù)的雞胚性別鑒定方法及裝置，通過提取雞蛋輪廓圖像的長短軸、蛋形面積和小頭端距離進行建模來判別種蛋性別，準確率達到80.21%。然而，曹智等[40]研究表明，玫瑰冠雞種蛋的蛋形指數(shù)對受精率和孵化率均有顯著性影響，和性別比例則并無明顯關系。目前，研究人員對蛋形指數(shù)與種蛋性別是否存在相關性尚有爭議，但鑒于部分檢測方法在實踐中對特定品種的性別檢測具有可觀的準確度，蛋形指數(shù)方法仍不失為一種值得參考的檢測思路。

相較于外形識別方法，血線紋理特征是對種蛋內部血管等組織發(fā)育狀況的具體表征。一般地，種蛋在孵化期第3 天開始出現(xiàn)血線，通過照蛋可觀察到蛋胚中血線呈蛛網狀分布。研究表明，血線的形狀分布與性別有一定關系，唐劍林等[41]提出，雄胚主血管明顯，血管較粗，分布均勻；雌胚血管纖細，粗細均勻，分支較多，呈不規(guī)則狀?；诜N蛋孵化早期血線特征和機器學習手段，湯勇等[42]采集孵化期第4 天的種蛋機器視覺圖像，從種蛋圖像提取11維特征用于構建反向傳播神經網絡模型(BPNN)以檢測種蛋性別，模型通過遺傳算法優(yōu)化，對雌雄種蛋的識別率達到82.80%。同年，祝志慧等[43]通過對血線特征進行強化、提取、建模，構建基于全信息特征的深度置信網絡模型，將模型準確率提升至83.33%。由于在圖像處理過程中，提取特征中的噪聲對模型存在一定干擾，降低了雞胚性別鑒定的準確率，因而，如果能夠在保留血線特征信息的同時運用更有效的去噪方法，將有機會進一步提高模型性能。

3.2 光譜技術檢測種蛋的雌雄性別

近年來，光譜和高光譜方法在雞胚性別鑒定領域有較多應用。其中，以國外學者Steiner等[44-45]、Galli等[46-48]團隊研究成果較為顯著，提出了一系列檢測精度高的侵入式檢測手段。Steiner等[44]從種蛋胚盤細胞中提取DNA，用紅外光譜方法成功檢測出未孵化種蛋性別；2014年，他們改用顯微探針技術進行DNA采樣，進一步減小蛋殼的創(chuàng)口，降低了對孵化的影響[45]。Galli等[46-48]采集胚蛋的拉曼及熒光光譜并基于雌雄光譜的差異建模，在孵育期84 h對種蛋性別鑒定準確率達到90%以上。然而，這些方法均需要對種蛋破殼采樣，一定程度上會影響雞胚發(fā)育。G?hler等[49]利用無損檢測技術采集孵化中后期種蛋的可見/近紅外波段的高光譜圖像并進行主成分分析和線性判別，綜合準確率在孵化第14 天達到了97%。該方法為避免宰殺雄雛提供了一種可行的解決方案，但檢測時間集中在孵化后期。

目前也有一些國內學者提出針對孵化期種蛋性別的光譜無損檢測技術。由于光照能夠透過雞蛋外殼被內部物質部分吸收，進而將孵化信息反映到光譜圖中，當前基于無損檢測的雞胚性別檢測研究多采用透射光譜。潘磊慶等[50]利用高光譜采集孵化期第10天雞蛋中間部位的圖像，建立了基于人工神經網絡的檢測模型，精度達到82.86%，但是該方法容易受到種蛋個體差異，如蛋殼厚度、蛋殼顏色，以及雞蛋擺放方向等因素的干擾。祝志慧等[51]在探究基于紫外-可見-近紅外透射光譜進行雞胚性別鑒定的過程中，利用極限學習機建模，比較了雞蛋橫放和豎放2種放置方式，試驗結果表明，豎向放置且孵化期第7天的模型識別效果最好，預測集準確率達到87.14%，單個樣本平均判別時間達到0.08 ms。上述光譜方法均已具備一定的識別精度和速度，后續(xù)研究中，可通過增加樣本數(shù)量和降低光譜噪聲等方法來提高模型的通用性。

另外，光電檢測方法也應用到雞胚性別檢測領域中。Alin等[52]基于發(fā)育期間種蛋透光性的差異對孵化期第16至18天雌雄種蛋進行鑒別。他們通過硅光電二極管測定光透過雞蛋的平均輸出電壓，進而反映該雞蛋的透光性。結果表明，隨著孵化期胚胎發(fā)育，種蛋透光量減少，雄性種蛋較雌性種蛋表現(xiàn)出更高的不透明度(P<0.05)，線性判別模型識別率達到84%。該方法裝置成本低廉，結構簡單，容易復現(xiàn)，但模型在孵化后期才能達到相對較高的準確率，因此還需要對系統(tǒng)進行優(yōu)化以盡可能使檢測時間提前。

3.3 氣味檢測種蛋的雌雄性別

氣味能代表或反映物質的某些本質屬性[3]，在時空上具有唯一性。近年來，關于氣味所蘊含或傳遞生化信息的研究報道日益增長[53-55]，已有部分文獻關注到禽蛋氣味所反映的生化信息，如受精、發(fā)育和父代交流等[56-57]。

Webster等[56]發(fā)現(xiàn)孵化期第1天雌雄鵪鶉蛋的氣味存在顯著差異(P<0.05)，推測可能是母體對雌性和雄性胚胎資源分配不同造成的。在此基礎上，向小樂[3]發(fā)現(xiàn)對于同一品種雞蛋，孵化早期雌雄種蛋揮發(fā)性有機物的組成也存在差異。進一步，利用 SPME-GC-MS和PTR-MS 2種氣味檢測技術采集京粉 1 號雞種蛋樣本 VOCs并基于多層感知器神經網絡建模，結果顯示，這2種檢測技術對雌雄判別精度在預測集表現(xiàn)不佳，分別為59.5%和67.6%。該研究說明氣味檢測的思路是可行的，但由于受品種、飲食差異、樣本數(shù)較少等因素影響，檢測精度有待提升。后續(xù)研究可以擴大樣本容量，結合深度神經網絡對模型進行優(yōu)化。

4 展 望

經過幾十年的研究探索，種蛋孵化信息檢測任務逐漸從偏重實驗室應用的有損檢測向面向生產實際的無損檢測方向轉變。同時，隨著人工智能技術的發(fā)展，經典無損檢測技術如機器視覺法、光譜方法、光電檢測法等的檢測速度不斷上升，檢測精度和可靠性不斷提高，而檢測對象也從單一樣本向生產線上的群蛋過渡。目前，孵化期種蛋成活性檢測技術已有部分在實際生產中得到應用，效果較好，但也存在一些問題，如受精信息檢測的研究多集中在孵化早期，對孵化前的受精檢測研究仍然較少；部分受精蛋無法發(fā)育為活胚蛋，關于預測受精蛋能否存活的研究較少；孵化期的性別鑒定仍停留在實驗室探索階段，由于檢測精度和裝置成本與工業(yè)生產要求尚有距離，短期內無法在孵化工廠大規(guī)模普及。此外，由于已進行的孵化信息檢測研究采用的家雞品種參差不齊，部分研究成果可能存在普適性不強、推廣性較差的問題，一定程度阻礙了將新技術應用到孵化工廠的生產中。我們認為，從適用性、經濟性及可靠性角度出發(fā)，今后的研究可以從以下幾方面著手：一是從遺傳育種方面考慮，通過某種遺傳改良技術增加孵化期間雞胚雌雄特征差異，比如突出雞胚的羽色、脛色的差異，從而使無損檢測手段能夠更有效地進行特異性識別，達到在孵化期快速準確鑒別雞胚雌雄的目的。二是從人工智能方面考慮，融合光學、氣味、圖像學等多傳感器綜合檢測技術，利用物理、化學與生物學多學科交叉檢測手段，探討與構建基于多學科交叉綜合檢測技術，基于大數(shù)據(jù)背景下整合種蛋信息無損檢測數(shù)據(jù)庫，構建智能檢測系統(tǒng)，以提高種蛋孵化期信息檢測的可行性與準確性。