不同處理對蛭石栽培的微型薯瘡痂病防控效果及其微生態(tài)效應(yīng)分析

胡洪濤，朱志剛，周榮華，楊靖鐘，蔡興奎，顏冬冬

1.湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢 430064； 2.華中農(nóng)業(yè)大學園藝林學學院， 武漢 430070；3. 中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，北京 100193

馬鈴薯是世界第三、中國第四大糧食作物，隨著我國馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的實施，馬鈴薯種植面積快速增加，我國已成為世界馬鈴薯生產(chǎn)和消費第一大國，年種植面積約560萬hm2，年產(chǎn)量9 000多萬t[1]，占世界馬鈴薯種植面積和產(chǎn)量的1/4左右，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展對我國糧食安全至關(guān)重要。馬鈴薯不僅是我國第四大糧食作物，同時也是我國大多數(shù)山區(qū)經(jīng)濟欠發(fā)達縣的主要栽培作物[2]，因此，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展不僅關(guān)系到我國糧食安全，而且對國家鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略順利實施也至關(guān)重要。馬鈴薯瘡痂病作為危害馬鈴薯重要病害之一，幾乎在我國所有馬鈴薯產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，發(fā)生程度呈逐年加重趨勢，尤其是在以蛭石為基質(zhì)的脫毒微型薯生產(chǎn)基地，連作地種薯患病率高達50%以上，種薯商品價值喪失殆盡。但截至目前，我國尚無正式登記針對瘡痂病的防治藥劑，說明我國馬鈴薯瘡痂病的防控措施嚴重缺乏[3]，亟待研究馬鈴薯瘡痂病的防控方法和技術(shù)。

馬鈴薯瘡痂病(potato common scab)最早于1890年在美國康涅狄格州被發(fā)現(xiàn)[4]，現(xiàn)在已成為世界性土傳病害[5]，是馬鈴薯四大重要病害(晚疫病、粉痂病、瘡痂病、病毒病)之一，感染該病的薯塊表面會出現(xiàn)近圓形至不定形木栓化瘡痂狀淡褐色病斑或斑塊，呈凹陷、凸起或平狀，被害薯塊品質(zhì)、產(chǎn)量均顯著降低，種薯失去商品價值。目前，馬鈴薯瘡痂病在我國幾乎所有馬鈴薯產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，一般田塊發(fā)病率在30%左右，部分田塊發(fā)病率高達50%以上[6]，連作田、干旱地區(qū)、溫室種植的馬鈴薯發(fā)病更為嚴重。馬鈴薯由于易感病毒病，生產(chǎn)上多采用脫毒苗繁育而來的微型薯作為種子，而微型薯的生產(chǎn)多在以蛭石為基質(zhì)的溫室中進行，由于蛭石價格昂貴，為節(jié)約成本種薯繁育單位多將蛭石重復(fù)使用，導致瘡痂病在種薯基地發(fā)生更為嚴重，發(fā)病率甚至高達80%以上[7-8]。由于無經(jīng)濟有效的防控措施，馬鈴薯瘡痂病發(fā)生面積和程度不斷加大，這不僅嚴重威脅著馬鈴薯種質(zhì)資源安全，也阻礙了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的綠色健康發(fā)展。

馬鈴薯瘡痂病由鏈霉菌(Streptomyces)侵染引起，目前報道導致馬鈴薯瘡痂病的鏈霉菌有20多種，但大多數(shù)地區(qū)的致病菌以普通瘡痂鏈霉菌為主[9-10]。瘡痂鏈霉菌屬于放線菌科鏈霉菌屬、革蘭氏陽性菌，此類菌大部分營腐生生活，也能感染除馬鈴薯外的多種根莖類作物，如甜菜、胡蘿卜、花生等[11]。瘡痂鏈霉菌能產(chǎn)生孢子并依靠孢子進行擴散、感染寄主，土壤pH 5.5～7.5、相對濕度小于60%～70%、溫度20～22 ℃最有利于病原菌入侵[5]，而且馬鈴薯發(fā)病程度與塊莖生長時間密切相關(guān)，生長2～3周的幼薯最為感病[12]，當塊莖表面木栓化后，發(fā)病程度大為減輕。土壤微生物是土壤環(huán)境重要成分，在養(yǎng)分循環(huán)和植物生長中起著關(guān)鍵調(diào)控作用，而最近的研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯瘡痂病的發(fā)生程度與土壤微生物組成和功能緊密相關(guān)[13]，尤其是與土壤致病性的瘡痂鏈霉菌的豐度相關(guān)，說明降低土壤病原菌數(shù)量是控制馬鈴薯瘡痂病的關(guān)鍵。土壤消毒是采用物理、化學等方法來殺滅土壤中的有害生物，從而控制土傳性病害、害蟲或者雜草的為害，其中以化學藥劑溴甲烷消毒效果最好，但由于溴甲烷對臭氧層的破壞作用而被全球禁用。棉隆是近年來在全國大面積推廣的消毒藥劑，實踐表明棉隆消毒對土傳性真菌病害[14]、細菌病害[15]、線蟲病害[16]、根腫病[17]等均有較好的防效，而采用棉隆土壤消毒對以蛭石為基質(zhì)種植的馬鈴薯瘡痂病的防控效果尚未見報道，同時也不清楚土壤消毒對蛭石中微生物的影響。為解決蛭石種植的馬鈴薯種薯繁育中瘡痂病防控難題，我們進行棉隆土壤消毒聯(lián)合生物菌劑試驗，并利用16S核糖體高通量測序技術(shù)研究其對蛭石微生態(tài)影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

1)供試品種。馬鈴薯品種為中薯5號。

2)供試藥劑及主要試劑。98%棉隆細粒劑，江蘇南通施壯化工有限公司；2×108孢子/mL青霉菌34107水劑，湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心；5%中生菌素可濕性粉劑，福建凱立生物科技股份有限公司。土壤DNA提取試劑盒，美國MP Biomedicals公司；測序文庫制備試劑盒、TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit，美國Illumina公司。

1.2 試驗方法

1)微型薯瘡痂病田間藥效小區(qū)試驗。試驗在華中農(nóng)業(yè)大學校內(nèi)的微型薯繁育溫室大棚內(nèi)進行，設(shè)6個處理，98%棉隆消毒處理(225 kg/hm2)(T1)，2×108孢子/mL青霉菌34107灌根(600 kg/ hm2)(T2)，5%中生菌素灌根(500倍液)(T3)，98%棉隆消毒(225 kg/hm2)聯(lián)合2×108孢子/mL青霉菌34107灌根(600 kg/ hm2)(T4)，98%棉隆消毒(225 kg/hm2)聯(lián)合5%中生菌素灌根(500倍液)(T5)，并設(shè)空白對照(T6)。每個處理3個重復(fù)，共18個小區(qū)，小區(qū)長5 m、寬6 m，面積為30 m2，小區(qū)隨機排列。于2020年6月18日進行棉隆土壤消毒試驗，操作方法參照文獻[17]，先將棉隆均勻撒到蛭石表面，然后采用小型旋耕機將棉隆翻入蛭石，澆水至60%左右的含水量后，蓋膜，處理21 d后，揭膜敞氣。微型薯組培苗播種時間為9月14日，播種后30 d，分別采用2×108孢子/mL青霉菌34107和5%中生菌素稀釋液灌根。馬鈴薯收獲時(11月28日)進行病害分級鑒定，分級標準和防治效果計算參照文獻[18]。田間試驗藥效試驗數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 22.0軟件、調(diào)用Duncan’s方法進行方差顯著性分析。

2)樣品采集和蛭石中基因組DNA提取。于馬鈴薯收獲時，按照五點取樣法采集蛭石樣本，放入干冰,帶回實驗室后保存于-80 ℃冰箱。蛭石微生物基因組DNA提取按照廠家說明書執(zhí)行。

3)16S 核糖體基因高通量測序和數(shù)據(jù)分析。細菌16S核糖體基因高通量測序以及數(shù)據(jù)分析參照文獻[19]所述方法進行。簡述如下，基因組DNA經(jīng)檢驗合格后，利用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCA GCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3)引物對細菌16S核糖體基因V3-V4區(qū)進行擴增，然后上機進行測序，原始數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)量過濾后，與GreenGenes數(shù)據(jù)庫中的16S rRNA基因序列進行比對，以97%的相似性作為閾值進行OTU(operational taxonomic units)劃分。采用PICRUSt軟件[19]對細菌OTU與KEGG等數(shù)據(jù)庫進行比對和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對微型薯瘡痂病防控效果及經(jīng)濟效益分析

不同處理對微型薯瘡痂病防控效果及經(jīng)濟效益分析詳見表1。相比T6處理，各處理病情指數(shù)均顯著降低(P<0.05)，以T4處理最低(1.73)，其次為T5(5.72)和T1(6.26)，隨后是T2(10.73)，以T3處理最高(22.43)。種薯瘡痂病防效以T4處理最高(93.43%)，其次為T5(88.27%)、T1(86.72%)、T2(74.51%)，這4個處理之間無顯著差異(P<0.05)，以T3處理防效最低(65.10%)。商品薯數(shù)量以T4(348.3萬個/hm2)、T5(334.1萬個/hm2)、T1(326.1萬個/hm2)最多，顯著高于T2(226.5萬個/hm2)和T3(156.6萬個/hm2)(P<0.05)。產(chǎn)值和經(jīng)濟效益也以T4、T5和T1最高，顯著高于其他處理。

表1 不同處理對種薯瘡痂病防效及產(chǎn)量、經(jīng)濟分析 Table 1 Control effects of minituber common scab by different treatments and analysis of yields and economic profits

2.2 不同處理蛭石中細菌組成分析

不同處理蛭石中細菌組成詳見圖1。各處理蛭石中細菌均以變形菌門(Proteobacteria)相對豐度最高,為0.51～0.84；其次為放線菌門(Actinobacteria)，相對豐度在0.042～0.230，以T6最高、T4最低；隨后為擬桿菌門(Bacteroidetes)，相對豐度為0.019～0.13，以T6最低、T4最高。

圖1 不同處理蛭石中細菌在門水平組成

層次聚類分析顯示(圖2)，在屬水平的細菌組成除T5和T6較為相似外，其余處理均有較大差異。在T2和T4處理中，假單胞桿菌屬(Pseudomonas)豐度較高，但相對豐度低于T4處理；T5和T6處理細菌組成較為類似，均以鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)豐度較高；T1處理中以假單胞桿菌屬、Mitsuaria、伴根瘤菌屬(Pararhizobium)等豐度較高；T3處理中以硫化細菌屬(Thiobacillus)和Saccharimonas豐度較高。

圖2 蛭石中細菌在屬水平的層次聚類分析

統(tǒng)計分析顯示，185個屬的豐度發(fā)生顯著變化(P<0.05)(圖3)。相對于T6，T1處理中112個屬豐度顯著性變化，其中38個屬顯著增加、74個屬顯著減少，豐度前三的屬分別為Mitsuaria、Cellvibrio、Acidovorax，增加倍數(shù)最大的為Mitsuaria(FC，fold changes,倍數(shù)變化)=12.6)，玫瑰色半光合菌屬(Roseateles,FC=11.6)，IMCC26134(FC=10.1)；顯著性下降有74個屬，豐度前三的是鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)、類諾卡菌屬(Nocardioides)、Pelomonas，下降倍數(shù)較大的是羅氏菌屬(Rhodanobacter，F(xiàn)C=-14.8)、unclassified-Rhodanobacteraceae細菌(FC=-13.1)、Amycolatopsis(FC=-12.8)。T2中共有112個屬顯著變化，55個屬顯著性上升、57個屬顯著下降，其中，豐度前三的是假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、德沃斯氏菌屬(Devosia)，上升倍數(shù)較大的是食酸戴爾福特菌(Delftia，F(xiàn)C=11.4)、Leucobacter(FC=10.5)、Nitrosomonas(FC=10.1)；下降倍數(shù)較大的是Phycicoccus(FC=-11.3)、Humibacter(FC=-11.2)、Mizugakiibacter(FC=-10.2)。T3處理中有88個屬豐度顯著變化，其中29個屬增加、59個屬下降；豐度前三的分別是硫化細菌(Thiobacillus)、Saccharimonas、Domibacillus，豐度增加倍數(shù)最大是硫化細菌(FC=13.0)、嗜甲基菌屬(Methylophilus，F(xiàn)C=11.9)、Parapusillimonas(FC=11.6)；下降倍數(shù)最大的是Rhodanobacter(FC=-14.8)、Pelomonas(FC=-14.4)、硝化螺旋菌(Nitrosospira，F(xiàn)C=-13.6)。T4處理中30個屬豐度顯著變化，均為顯著增加，其中，豐度最高的是假單胞桿菌、Massilia、黃桿菌(Flavobacterium)，豐度變化最大的是嗜甲基菌屬(Methylophilus，F(xiàn)C=10.4)、Pelagibacterium(FC=9.9)、Pseudacidovorax(FC=9.6)。T5處理中共58個屬顯著變化，其中25個顯著增加、33個顯著下降，豐度最高的3個屬是不動桿菌屬、Pelomonas、羅氏菌屬，以Parapusillimonas(FC=8.3)、芽孢桿菌(Bacillus，F(xiàn)C=3.8)、Effusibacillus(FC=2.9)增加最多，而Humibacter(FC=-5.3)、Pseudoxanthomonas(FC=-2.7)、Conexibacter(FC=-2.2)減少最多。

圖3 豐度發(fā)生顯著變化的前10個屬

2.3 不同處理對蛭石中細菌多樣性的影響

不同處理對蛭石中細菌alpha多樣性影響較大(圖4)。相對于對照(T6)，棉隆處理(T1)和棉隆+中生菌素復(fù)合處理(T5)的蛭石細菌Chao1指數(shù)顯著降低(P<0.05)；而青霉菌34107單獨使用有所增加，棉隆+青霉菌34107復(fù)合處理有所降低，但都沒有達到顯著水平(P>0.05)。與Chao1指數(shù)類似，青霉菌34107處理蛭石Shannon指數(shù)有所增加，而棉隆+青霉菌34107處理有所降低，但均沒有達到顯著水平(P>0.05)；棉隆單獨處理、棉隆+中生菌素復(fù)合處理蛭石細菌Shannon指數(shù)均顯著降低(P<0.05)。

圖4 不同處理蛭石細菌多樣性指數(shù)

相對于T6(表2)，T1～T5分別有112、112、88、100和58個屬顯著變化，其中T2處理上調(diào)數(shù)量最多(55)、T5上調(diào)數(shù)量最少(25)；T1中下調(diào)數(shù)量最多(74)、T4處理下調(diào)最少(0)。在這些屬當中，92個屬(49.5%)存在于所有6個處理，僅少數(shù)(1～20)存在不同處理的交集中(圖5)。

表2 不同處理豐度發(fā)生顯著性變化屬的數(shù)量 Table 2 Number of genera with significant changes in different treatments

圖5 不同處理在屬水平交集的數(shù)量

2.4 蛭石中鏈霉菌與其他細菌相關(guān)性分析

相關(guān)性分析(P<0.01，R>0.6)結(jié)果顯示(圖6)，蛭石中鏈霉菌豐度與55個屬細菌呈顯著正相關(guān)，相關(guān)性最大前5位分別是中慢生根瘤菌(Mesorhizobium，r=0.979 5)、Solirubrobacter(r=0.939 9)、Acidipila(r=0.939 0)、Ellin6067(r=0.937 4)、包層不黏柄菌(Asticcacaulis，r=0.936 3)，而與Dyadobacter(r=-0.783 2)、Pedobacter(r=-0.759 9)、Paenarthrobacter(r=-0.742 2)等8個屬豐度呈顯著負相關(guān)。

1.Mesorhizobium； 2.Solirubrobacter； 3.Acidipila； 4.Ellin 6067； 5.Asticcacaulis； 6.IMCC 26256； 7.Pelomonas； 8.Xanthobacter； 9.Sphingomonas； 10.Pseudolabrys； 11.Luteimonas； 12.Kribbella； 13.Unclassified-Sphingomonas； 14.Acinetobacter； 15.AKYG 1722； 16.Rhodanobacter； 17.Elstera； 18.Unclassified-Pedosphaeraceae； 19.Dyella； 20.Ideonella； 21.Polycyclovorans； 22.Methyloversatilis； 23.Jatrophihabitans； 24.Mizugakiibacter； 25.Tumebacillus； 26.Methylobacillus； 27.Unclassified-Rhodanobacter； 28.Geothrix； 29.Intrasporangium； 30.Nitrosospira； 31.Afipia； 32.Hyphomicrobium； 33.Luteibacter； 34.Micromonospora； 35.Rhizobium； 36.Terrabacter； 37.Nitrobacter； 38.Angustibacter； 39.Candidatus_Kaiserbacteria； 40.Arenimonas； 41.Longimicrobium； 42.Mycobacterium； 43.Gemmatimonas； 44.Unclassified-Vermiphilaceae； 45.Sporolactobacillus； 46.Promicromonospora； 47.Paucibacter； 48.Aquabacterium； 49.Marmoricola； 50.Effusibacillus； 51.Lysobacter； 52.Leifsonia； 53.Humibacter； 54.Amycolatopsis； 55.Nocardioides； 56.Methylophilus； 57.Microbacterium； 58.Achromobacter； 59.MM2； 60.Noviherbaspirillum； 61.Pedobacter； 62.Paenarthrobacter； 63.Dyadobacter.

3 討 論

馬鈴薯瘡痂病是既可種傳、也可土傳的病害，但蛭石栽培的脫毒微型薯瘡痂病菌主要來源于蛭石菌。因此，清除蛭石中的病原菌對防控微型薯瘡痂病非常關(guān)鍵。棉隆是一種廣譜性農(nóng)藥，在土壤中能分解出異硫氰酸甲酯、甲醛和硫化氫等物質(zhì)，對土壤中線蟲、真菌、細菌等均有殺滅作用，實踐證明其對生姜青枯病[15]等具有較好的效果，但對土壤微生物多樣性和土壤酶活性有抑制作用[14]。本研究通過田間試驗，探索棉隆消毒及與生物藥劑配合使用對蛭石栽培微型薯瘡痂病的防控效果，并對其微生態(tài)效應(yīng)進行了分析。結(jié)果證明，棉隆消毒與青霉菌34107灌根聯(lián)合使用，對微型薯瘡痂病防控效果最好，高于棉隆與中生菌素聯(lián)合使用，也高于單用棉隆，商品微型薯數(shù)量、產(chǎn)值和經(jīng)濟效益也明顯增加。同時，蛭石中假單胞桿菌等有益微生物顯著提升、微生態(tài)多樣性也相比單用棉隆有顯著提升，說明棉隆消毒與青霉菌聯(lián)合使用防控蛭石栽培的微型薯瘡痂病具有較好的經(jīng)濟和生態(tài)效應(yīng)。由于蛭石栽培的微型薯瘡痂病源主要來源于蛭石，因此，消滅蛭石中病原菌，對于防控該病非常關(guān)鍵。但單用棉隆消毒，可能不能完全殺滅蛭石中的病原菌，殘存的病原菌可能會導致部分微型薯發(fā)病，而生物菌劑灌根可以起到抑制病原菌感染，同時也能促進土壤微生物多樣性發(fā)展。所以，棉隆與生物菌劑聯(lián)用取得較好的效果。長期以來，馬鈴薯瘡痂病的防控主要以噴施農(nóng)用硫酸鏈霉素為主，但由于交互抗性和環(huán)境食品安全等問題，2016年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已經(jīng)嚴禁其在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用。由于缺乏經(jīng)濟有效的防控方法，馬鈴薯瘡痂病成為原種繁育的關(guān)鍵制約因子。本研究結(jié)果通過聯(lián)合棉隆消毒和青霉菌生物防治對微型薯瘡痂病取得較好的防效，對保障馬鈴薯原種繁育具有積極意義。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯瘡痂病的發(fā)生與土壤細菌數(shù)量、種類和豐富度相關(guān)[20]，然而，本研究發(fā)現(xiàn)蛭石中變形菌門的數(shù)量在處理后無顯著減少、反而有所增加，而與前人研究結(jié)果[20]相同的是，放線菌門數(shù)量有明顯減少，放線菌門減少主要是鏈霉菌數(shù)量減少，鏈霉菌在對照處理中占比很高，達到3.23%，這可能是蛭石中瘡痂病發(fā)生嚴重的關(guān)鍵因素[18]。通過相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)鏈霉菌的豐度與55個屬的細菌呈正相關(guān)，例如與中慢生根瘤菌的相關(guān)性達到0.979 5，呈極顯著正相關(guān)(P<0.001)，說明瘡痂病的發(fā)生與蛭石中微生物密切相關(guān)，并且可能是多種微生物互作的結(jié)果[13]。因此，對土傳性病害的防控，不僅要減少病原菌的數(shù)量，同時也要恢復(fù)和重建健康土壤微生態(tài)，保持土壤微生態(tài)健康環(huán)境。