實(shí)時(shí)熒光定量PCR 在沙眼衣原體檢測(cè)中的應(yīng)用

寧繼偉

（大同市第三人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，山西 大同 037046）

0 引言

沙眼衣原體（Chlamydia Trachomatis，CT）作為一種能夠通過細(xì)菌濾器的微生物，不僅會(huì)引發(fā)眼部感染，還會(huì)引起性病淋巴肉芽腫、生殖泌尿系統(tǒng)感染及其他器官疾病，嚴(yán)重影響患者的身心健康[1-2]。傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是檢測(cè)沙眼衣原體感染的有效方法，具有敏感性高、特異度高的優(yōu)點(diǎn)，但存在耗時(shí)長(zhǎng)、對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求高、成本高等不足。常規(guī)金標(biāo)法是當(dāng)前診斷沙眼衣原體感染的常用方法，但敏感性較低，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）在衣原體檢測(cè)中得到了逐步應(yīng)用和推廣[3]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用RT-PCR法和金標(biāo)法檢測(cè)生殖道分泌物CT，并將兩種方法的結(jié)果進(jìn)行比較分析，為RT-PCR在CT檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)提供可靠的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料。選取2019年1月至2020年1月本院接診的198例疑似沙眼衣原體感染患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)臨床檢查初步懷疑為沙眼衣原體患者；②均行金標(biāo)法、RT-PCR檢測(cè)；③患者同意配合研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病；②血液系統(tǒng)疾??；③精神異常、認(rèn)知功能障礙、語言表達(dá)能力障礙等無法配合研究的病人；④妊娠或哺乳期女性。其中男106例，女92例；年齡23～74歲，平均（47.25±7.89）歲?；颊呔炇鹬橥鈺?/p>

1.2 方法

（1）主要儀器和試劑：ABI 7500熒光PCR擴(kuò)增儀、沙眼衣原體核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒（廣州中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）；沙眼衣原體抗原檢測(cè)試劑盒（杭州艾康生物技術(shù)有限公司）。

（2）檢測(cè)方法：采集前均清潔外生殖器，男性患者可將按摩后的前列腺液置于無菌密閉容器后送檢；女性患者非月經(jīng)期可用無菌棉拭子在尿道口擦拭停留10 s，置于無菌密閉容器后送檢。每位患者均采集3份標(biāo)本：①RT-PCR：無菌密閉容器中加入1 mL無菌生理鹽水，振蕩混勻后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管內(nèi)，12000 r/min，離心10 min，棄上清液，加入50 μL DNA提取液，振蕩均勻，100℃ 10 min，12000 r/min，離心5 min，取上清液5 μL作為DNA反應(yīng)模板進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)條件如下，93℃ 5 min預(yù)變性，再按照93℃ 45 s、55℃ 45 s共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后由計(jì)算機(jī)分析結(jié)果，熒光強(qiáng)度＞5×102copies/mL即可判斷為陽性[4]；②金標(biāo)法：將采集到分泌物的棉拭子放入樣品處理管內(nèi)，按照試劑盒說明書處理標(biāo)本完成抗原提取。取5滴提取液滴加至抗原檢測(cè)卡樣品窗口內(nèi)，15 min后觀察檢測(cè)結(jié)果；相同方法采用熱滅活沙眼衣原體作為陽性對(duì)照。如控制窗和結(jié)果窗均可見紅線即可判斷為陽性；控制窗有一條紅線、結(jié)果窗無紅線者為陰性；控制窗無紅線則判斷為無效，需重新進(jìn)行檢測(cè)[5]。

1.3 觀察指標(biāo)。①以細(xì)胞培養(yǎng)法為參照，比較常規(guī)金標(biāo)法、RT-PCR兩種檢查方法在沙眼衣原體檢測(cè)中的結(jié)果；②評(píng)價(jià)常規(guī)金標(biāo)法、RT-PCR兩種方法檢測(cè)沙眼衣原體的效能，包括準(zhǔn)確性、敏感性、特異性、漏診率和誤診率，敏感性=真陽性/（真陽+假陰性），特異性=真陰/（真陰+假陽性），準(zhǔn)確性=（真陽+真陰）/總數(shù)，漏診率=假陰性/（真陽+假陰性），誤診率=假陽性/（真陰+假陽性）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料（n，%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05，表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR與常規(guī)金標(biāo)法在沙眼衣原體檢測(cè)中的結(jié)果比較。根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果可知，198例疑似沙眼衣原體感染者中檢出沙眼衣原體感染患者73例，未感染患者125例，以此為參照。RT-PCR與常規(guī)金標(biāo)法檢測(cè)沙眼衣原體的結(jié)果見表1。

表1 RT-PCR與常規(guī)金標(biāo)法在沙眼衣原體檢測(cè)中的結(jié)果比較

2.2 RT-PCR與常規(guī)金標(biāo)法檢測(cè)沙眼衣原體的效能評(píng)價(jià)。由表2可知，RT-PCR診斷沙眼衣原體感染的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性均高于金標(biāo)法，漏診率、誤診率均低于金標(biāo)法。

表2 RT-PCR與常規(guī)金標(biāo)法檢測(cè)沙眼衣原體的效能評(píng)價(jià)（%）

3 討論

沙眼衣原體是引起尿道炎、直腸炎、宮頸炎、盆腔炎、輸卵管炎等疾病的常見病原體，部分沙眼衣原體感染患者缺乏明顯的臨床癥狀，導(dǎo)致患者延誤治療時(shí)機(jī)，影響預(yù)后。臨床中快速、準(zhǔn)確的診斷沙眼衣原體感染是控制疾病傳播、減少不良后果的關(guān)鍵[6]。常規(guī)金標(biāo)法在沙眼衣原體檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，具有無需使用特殊設(shè)備、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，但檢測(cè)敏感性較低，容易出現(xiàn)漏診情況。因此有必要采用更加準(zhǔn)確的檢測(cè)方法來彌補(bǔ)常規(guī)方法的不足。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是上世紀(jì)末發(fā)展起來的一種全新檢測(cè)技術(shù)，融匯了PCR高敏感性、熒光光譜技術(shù)高精確定量、分子雜交技術(shù)高特異性等方面的優(yōu)勢(shì)，在沙眼衣原體的早期診斷中具有較高的應(yīng)用價(jià)值[7]。

本研究結(jié)果顯示，RT-PCR檢測(cè)沙眼衣原體感染的準(zhǔn)確性為98.48%，特異性為99.20%，敏感性為97.26%，均高于常規(guī)金標(biāo)法的檢測(cè)結(jié)果；而前者的漏診率為2.74%，誤診率為0.80%，均低于后者的檢測(cè)結(jié)果，說明RT-PCR在沙眼衣原體檢測(cè)中可為臨床醫(yī)師提供更加準(zhǔn)確的參考依據(jù)。目前，沙眼衣原體感染的診斷主要依賴于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，通常以細(xì)胞培養(yǎng)作為診斷沙眼衣原體感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但操作程序較為復(fù)雜、耗時(shí)，容易延誤患者病情。金標(biāo)法盡管操作簡(jiǎn)單、快速，但待測(cè)標(biāo)本中需包含足量的衣原體抗原方可獲得可靠的檢測(cè)結(jié)果，容易出現(xiàn)漏診情況，而RT-PCR檢測(cè)能夠在全封閉環(huán)境下操作，實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確鑒別出病原體的效果，避免污染造成的假陽性問題。在RT-PCR實(shí)際過程中，特異性引物通過熒光基團(tuán)來標(biāo)記，在單管封閉的條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物分析的全過程，通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并對(duì)結(jié)果自動(dòng)分析，可對(duì)病原體感染和臨床治療效果進(jìn)行準(zhǔn)確反映，具有重復(fù)性好、敏感性高、特異性強(qiáng)、直觀、易操作的優(yōu)點(diǎn)。結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，金標(biāo)法在應(yīng)用中可能受污染因素、受檢者自身疾病等因素的干擾，出現(xiàn)假陽性情況，干擾檢測(cè)結(jié)果。而RT-PCR法檢測(cè)能夠減少人為操作對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，避免了金標(biāo)法在檢測(cè)過程中易產(chǎn)生污染的不足，并克服了金標(biāo)法檢測(cè)存在“窗口期”的問題，能夠更加靈敏地反映沙眼衣原體感染情況，減少漏診、誤診率。本文中RT-PCR漏診2例，誤診1例，常規(guī)金標(biāo)法漏診17例，誤診18例，充分證實(shí)了這一觀點(diǎn)。值得注意的是，RTPCR法也存在對(duì)檢測(cè)環(huán)境、實(shí)驗(yàn)設(shè)備的要求較高、實(shí)驗(yàn)成本較貴等方面的不足。

綜上所述，與常規(guī)金標(biāo)法比較，RT-PCR法能夠更加靈敏地檢出沙眼衣原體感染者，敏感性、特異性、準(zhǔn)確性均高于金標(biāo)法，可為臨床醫(yī)師對(duì)于沙眼衣原體感染者的篩查提供更加準(zhǔn)確、可靠的參考依據(jù)，具有重要的臨床應(yīng)用與推廣價(jià)值。