• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    一株厭氧反硝化細菌的分離鑒定與砷耐受功能研究

    2021-07-26 05:22:06馮紀龍陳曉明劉紫薇
    安全與環(huán)境工程 2021年4期
    關(guān)鍵詞:硝酸鹽硝化碳源

    馮紀龍,陳曉明,劉紫薇,羅 鋒

    (1.中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)環(huán)境學(xué)院,湖北 武漢 430078;2.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖北 武漢 430056)

    砷(As)是一種類金屬元素,有很強的毒性,廣泛存在于地殼與生物圈。它的氧化物——三氧化二砷(AsO),就是俗稱的“砒霜”。我國作為糧食生產(chǎn)大國,土壤中的砷卻嚴重超標,而稻米吸收土壤中的砷,導(dǎo)致砷進入人體造成一系列的健康問題。我國砷超標大米占全國總量的1%左右,全國有60%地區(qū)以食用稻米為主。據(jù)報道,稻米對砷的吸收能力比其他農(nóng)作物及蔬菜高很多,在砷污染比較輕的地區(qū),水稻中的砷從莖葉到稻米的轉(zhuǎn)移系數(shù)比小麥和其他作物高10倍左右。在高砷的環(huán)境下,一部分微生物為了維持正常的生命活動,進化出耐砷機能,一些微生物能夠通過自身生化作用將毒性很強的砷排出體外而進入環(huán)境中。微生物對砷的耐受機制主要與砷的吸收、氧化還原、甲基化和外排等作用相關(guān)。砷的抗性主要由 arsC 操縱子操控。原核生物的砷抗性研究顯示,砷的抗性主要由3個基因來調(diào)控。微生物對三價砷[As(Ⅲ)或As]的氧化由砷氧化酶基因(aioA/aioB)調(diào)控,對五價砷[As(Ⅴ)或As]的還原由細菌的砷還原酶基因(arr/arsC)調(diào)控。

    第三步:2NO+2H+2e→NO+HO

    第四步:NO+2H+2e→N+HO

    稻米和蔬菜是人體攝入的主要食物來源,由于人的活動造成了稻米和蔬菜中砷與硝酸鹽超標。當(dāng)人體長期攝入砷與硝酸鹽時,會造成機體的嚴重損害。砷污染稻米與硝酸鹽超標蔬菜會經(jīng)過人體的消化道被胃腸道吸收并釋放部分砷與硝酸鹽產(chǎn)物,人體腸道對砷與硝酸鹽具有一定的解毒作用,腸道微生物發(fā)揮著重要的作用。砷在人體腸道內(nèi)各個階段的價態(tài)和比例各不相同,人體腸道微生物群落結(jié)構(gòu)在各個時期也不相同。人體腸道微生物群落對硝酸鹽的還原途徑主要有兩種:一種是通過硝酸鹽異化作用還原為銨;另一種是通過反硝化作用轉(zhuǎn)化為N。

    目前關(guān)于硝酸鹽在人體腸道中的還原機制研究已經(jīng)取得了很大的進展,但是對于具有特點的硝酸鹽還原單株菌報道還很少見。因此,本試驗通過富集與分離方法得到單株

    Escherichia

    CD14-2,研究了此單株菌的反硝化速率,并對其耐砷作用進行了探究。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 樣品采集

    用糞便采樣器(Longsee菌群采樣器)和滅菌藥勺采取人體新鮮糞便樣品。志愿者是來自于非砷污染地區(qū)且6個月沒有抗生素治療史的一名健康女性。糞樣為晨便中段約3~4 cm處。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)(g/L):腦心浸液17.5 g,D-葡萄糖2.0 g,蛋白胨10.0 g,氯化鈉5.0 g,磷酸二氫鈉2.5 g,瓊脂(選擇添加)15.0 g,去離子水1 000 mL。

    LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,氯化鈉10 g,去離子水950 mL,瓊脂(選擇添加)15.0 g。

    DM培養(yǎng)基(g/L):硝酸鉀0.72 g,磷酸二氫鉀1 g,七水硫酸鎂1 g,琥珀酸鈉2.8 g,去離子水1 000 mL。

    改良后礦物鹽培養(yǎng)基(3M培養(yǎng)基)(g/L):十二水磷酸氫二鈉7.56 g,磷酸二氫鉀3 g,七水硫酸鎂0.3 g,氯化鉀0.5 g,氯化鈣0.01 g,微量元素溶液,維生素溶液,去離子水1 000 mL。

    上述培養(yǎng)基均在121℃、1×10Pa條件下,滅菌30 min備用。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 腸道微生物中反硝化細菌的富集

    1.2.2 耐砷反硝化細菌的分離與純化

    1.2.3 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

    觀察菌株的形態(tài)、大小和顏色,進行革蘭氏染色,并結(jié)合《伯杰細菌鑒定手冊》進行形態(tài)特征鑒定。

    1.2.4 菌株的16S rRNA和narG功能基因的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

    采用煮沸法提取菌株的DNA作為模板,使用16S rRNA基因PCR通用引物進行擴增。正向引物為27F,反向引物為1541R。其堿基序列分別是5-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3和5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3。反應(yīng)體系為(50 uL):ddHO 38.75 μL, 10×PCR 緩沖液5 μL,dNTPs 1 μL,27F和1541R各1 μL,Taq polymerase 0.25 μL,DNA模板3 μL。16S rRNA反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,50℃復(fù)性30 s,72℃延伸90 s,30個循環(huán),72℃延伸7 min。

    將PCR產(chǎn)物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,并將PCR產(chǎn)物送至武漢天一輝遠公司進行測序。

    用菌株DNA作為模板,對菌株的功能基因——硝酸鹽還原酶基因進行擴增。PCR引物選用墨西哥科學(xué)家Rocio等設(shè)計的兩對引物:

    napAf1:5-CTGGACIATGGGYTTIAACCA -3

    napAr1:5-CCTTCYTTYTCIACCCACAT-3

    narGf1:5-ICAYGGIGTIAACTGYAC-3

    narGr1:5-TCGSMRTACCAGTCRTARAA-3

    兩對引物napA和narG期望的PCR片段長度在500 bp左右,引物由武漢天一輝遠公司合成,得到目的條帶后進行膠回收[DNA膠回收試劑盒QIAquick? Gel Extraction Kit(50)],然后進行連接轉(zhuǎn)化試驗,并挑取含有重組質(zhì)粒的陽性菌落進行菌液PCR鑒定。菌液PCR引物為通用引物RV-M和M13-47。將PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,并將電泳條帶在500 bp左右的菌液送至武漢天一輝遠公司進行測序。

    1.2.5 測定菌株對不同碳源的利用情況和不同砷濃度下的反硝化能力

    1.2.6 測定方法與數(shù)據(jù)分析

    采用紫外分光光度法(BHJ/T 346—200)測定樣品中硝態(tài)氮(NO-N)含量;采用N-(1- 萘基)- 乙二胺二鹽酸鹽分光光度法(GB 7493—87)測定樣品中亞硝態(tài)氮(NO-N)含量;采用納氏試劑分光光度法(GB HJ535—2009)測定樣品中銨態(tài)氮(NH-N)含量;使用pH儀測定樣品的pH值;采用原子熒光光譜法(AFS)測定樣品中砷含量。

    圖和表使用Origin 9.5和Excel繪制;使用Photoshop CC2015 編輯圖片;系統(tǒng)發(fā)育樹使用 MEGA 7.0完成制作。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 反硝化細菌的富集、分離與純化

    利用BHI培養(yǎng)基進行富集,DM培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基進行分離與純化,用3M培養(yǎng)基測試分離純化出來的細菌功能,得到一株反硝化細菌CD14-2。該菌株能將10 mM NO-N轉(zhuǎn)化為大約9 mM NO-N,轉(zhuǎn)化率可達到90%,期間不產(chǎn)生銨態(tài)氮。

    2.2 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹建立與同源性分析

    菌株CD14-2在LB固體培養(yǎng)基上的形狀為圓形,顏色為乳白色,微微隆起,單菌落直徑大概在2~3 μm,表面光滑有光澤且有一定的黏性,見圖1。該菌株革蘭氏染色為陽性,光學(xué)顯微鏡下觀察為細小短桿型。將得到的單菌落用LB培養(yǎng)基擴大培養(yǎng),培養(yǎng)24 h后吸取1 mL菌液,利用煮沸法提取菌株CD14-2 的DNA,然后將PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,得到條帶在1 500 bp 左右。通過測序得到菌株CD14-2的16S rRNA基因序列,并在NCBI上Genbank數(shù)據(jù)庫進行BLAST序列比對與分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株屬于變形菌門,腸桿菌科,埃希氏桿菌屬(CD14-2基因序列與埃希氏桿菌(

    Escherichia

    fegusonii

    )序列相似度達到了98.43%),將其命名為

    Escherichia

    sp.CD14-2。使用鄰接法構(gòu)建菌株

    Escherichia

    sp.CD14-2的16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹,見圖2。將菌株

    Escherichia

    sp.CD14-2的16S rRNA基因序列提交Genbank,獲取Genbank登錄號為MT883284。

    圖1 菌株Escherichia sp.CD14-2 平板

    圖2 菌株Escherichia sp.CD14-2的16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

    通過試驗發(fā)現(xiàn)菌株

    Escherichia

    sp.CD14-2具有反硝化作用,能夠?qū)⑾跛猁}轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽。于是對其反硝化過程的第一步關(guān)鍵酶——硝酸鹽還原酶基因narG和napA進行擴增和測序(napA擴增未成功)。根據(jù)菌株

    Escherichia

    CD14-2的narG基因編碼的氨基酸序列在NCBI上進行BLAST序列對比與分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其同源性最近的是

    Escherichia

    coil

    (大腸桿菌),相似度達到了98.18%。使用鄰接法構(gòu)建菌株

    Escherichia

    sp.CD14-2功基于narG同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹,見圖3。

    圖3 菌株Escherichia sp.CD14-2基于narG同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹

    2.3 菌株Escherichia sp.CD14-2 的反硝化功能

    在新鮮糞便中分離出的腸道微生物單株

    Escherichia

    sp.CD14-2 是一株反硝化細菌,但是其只能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽并大量累積。本試驗探究了菌株

    Escherichia

    sp.CD14-2在乳酸鈉作為碳源下的反硝化能力,其試驗結(jié)果見圖4。

    圖4 菌株Escherichia sp.CD14-2在乳酸鈉作為碳源下的反硝化速率

    在含有乳酸鈉作為碳源的培養(yǎng)基中,菌株

    Escherichia

    sp.CD14-2 能夠在2 d內(nèi)將10 mM硝酸鹽氮還原為 9 mM亞硝酸鹽氮,還原率達到 90%左右;而在其他有機碳源下,該菌株還原硝酸鹽的能力較弱,當(dāng)加入無機碳源碳酸氫鈉時,菌株

    Escherichia

    sp.CD14-2的反硝化能力很弱,在一周內(nèi)才生成1 mM左右的亞硝酸鹽。

    2.4 菌株Escherichia sp.CD14-2對不同碳源的利用情況

    將菌株

    Escherichia

    sp.CD14-2接種到添加有不同碳源的培養(yǎng)基中,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在含有甲酸鈉或甲醇的培養(yǎng)基中細菌幾乎不具有反硝化功能,在含有碳酸氫鈉或檸檬酸鈉的培養(yǎng)基中該菌株反硝化功能較弱,而在含有乳酸鈉或丙酮酸鈉或葡萄糖的培養(yǎng)基中,該菌株生長非常迅速且反硝化功能很強。菌株

    Escherichia

    sp.CD14-2對不同碳源的利用情況,見表1。

    表1 菌株Escherichia sp.CD14-2對不同碳源的利用情況

    菌株分離自新鮮糞樣,屬于腸道微生物。腸道微生物能夠利用多種碳源為機體和菌株本身提供生長所需要的能量,菌株

    Escherichia

    sp.CD14-2的分離純化說明腸道微生物具有硝酸鹽還原的能力。如果外部的硝酸鹽濃度過高對機體可能產(chǎn)生嚴重的危害。

    2.5 菌株Escherichia sp.CD14-2的耐砷功能

    對于反硝化細菌

    Escherichia

    sp.CD14-2的耐砷功能的探究,可在不同三價砷濃度下檢測菌株

    Escherichia

    sp.CD14-2的OD值來測定該菌株的生長曲線,見圖5。

    圖5 菌株Escherichia sp.CD14-2在不同三價砷濃度下的生長曲線

    由圖5可見,在LB培養(yǎng)基中,該菌株在無砷條件下OD值達到0.8左右,在添加1 mM As(Ⅲ)的情況下其OD值略小于不加入外源砷,而繼續(xù)增加外源砷濃度時,該菌株的生長受到抑制。

    2.6 不同砷濃度下菌株Escherichia sp.CD14-2的反硝化能力

    在測定不同砷濃度下菌株

    Escherichia

    sp.CD14-2的反硝化能力時,選用改良的礦物鹽培養(yǎng)基(3M)作為培養(yǎng)基,乳酸鈉作為有機碳源,其試驗結(jié)果見圖6。

    圖6 菌株Escherichia sp.CD14-2在不同砷濃度下硝酸鹽氮的還原和亞硝酸鹽氮的生成曲線

    3 結(jié) 論

    (1) 本試驗采用健康女性的糞便,通過分離與純化得到反硝化細菌CD14-2,經(jīng)形態(tài)學(xué)分析鑒定其為革蘭氏陰性菌,16S rRNA基因序列分析得出其與

    Escherichia

    fegusonii

    相似性達到98.43%,確定該菌株為埃希氏桿菌屬,并命名為

    Escherichia

    sp.CD14-2。該菌株的硝酸鹽還原功能與narG基因相關(guān)。(2) 本試驗檢測了菌株

    Escherichia

    sp.CD14-2對不同碳源的利用情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株能夠快速利用葡萄糖、乳酸鈉、丙酮酸鈉等碳源,對于甲酸鈉和甲醇幾乎不能利用或者利用緩慢。(3) 砷對菌株

    Escherichia

    sp.CD14-2的生長具有抑制作用,且砷濃度越大其抑制效果越強烈。此外,在不加砷和外源砷濃度在1 mM的情況下菌株

    Escherichia

    sp.CD14-2能夠在48 h內(nèi)將10 mM的NO-N還原成8.0 mM NO-N并且大量累積;在加入5.0 mM的外源砷時,菌株

    Escherichia

    sp.CD14-2能夠在48 h內(nèi)將10 mM的NO-N還原成6.0 mM NO-N,高砷對其生長具有抑制作用。(4) 本試驗對富集分離出的菌株

    Escherichia

    sp.CD14-2 的反硝化能力及其耐砷功能的研究,說明人體腸道內(nèi)具有砷抗性微生物,當(dāng)人體攝入少量砷時,腸道微生物可能具有一定的解毒功能。

    猜你喜歡
    硝酸鹽硝化碳源
    硝酸鹽并不致癌還或有益處
    中老年保健(2022年3期)2022-11-21 09:40:36
    緩釋碳源促進生物反硝化脫氮技術(shù)研究進展
    不同碳源對銅溜槽用鋁碳質(zhì)涂抹料性能的影響
    昆鋼科技(2021年6期)2021-03-09 06:10:20
    MBBR中進水有機負荷對短程硝化反硝化的影響
    家畜硝酸鹽和亞硝酸鹽中毒的診斷、鑒別和防治
    四甘醇作碳源合成Li3V2(PO4)3正極材料及其電化學(xué)性能
    厭氧氨氧化與反硝化耦合脫氮除碳研究Ⅰ:
    短期水分脅迫影響巴旦杏植株對硝酸鹽的吸收
    海水反硝化和厭氧氨氧化速率同步測定的15N示蹤法及其應(yīng)用
    外加碳源對污水廠異常進水時的強化脫氮效果分析
    河南科技(2014年16期)2014-02-27 14:13:33
    国产亚洲精品久久久久久毛片| 国内精品一区二区在线观看| 色av中文字幕| 免费在线观看成人毛片| 久久久色成人| 久9热在线精品视频| 毛片女人毛片| 久9热在线精品视频| 欧美中文综合在线视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 午夜福利免费观看在线| 国产成人av教育| 99热这里只有精品一区 | 亚洲av片天天在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 国内精品久久久久久久电影| 无人区码免费观看不卡| 99在线视频只有这里精品首页| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲国产色片| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产淫片久久久久久久久 | 91在线观看av| 99国产精品一区二区三区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲国产欧美网| 国产高清videossex| 欧美国产日韩亚洲一区| 99热这里只有精品一区 | 手机成人av网站| 国内精品美女久久久久久| 午夜影院日韩av| 精品久久久久久,| 999久久久精品免费观看国产| 波多野结衣高清无吗| 搡老岳熟女国产| 欧美午夜高清在线| 中文字幕熟女人妻在线| 免费看日本二区| 无限看片的www在线观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产精品av视频在线免费观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产精品电影一区二区三区| 欧美高清成人免费视频www| 久久精品91无色码中文字幕| 欧美日韩一级在线毛片| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 成年女人毛片免费观看观看9| 久久久久久久久中文| 97碰自拍视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 精品久久蜜臀av无| 欧美精品啪啪一区二区三区| 婷婷六月久久综合丁香| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产精品一区二区精品视频观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 一级毛片高清免费大全| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久久久久久精品吃奶| 午夜久久久久精精品| 午夜两性在线视频| 床上黄色一级片| 熟女人妻精品中文字幕| 成人永久免费在线观看视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 狠狠狠狠99中文字幕| 91麻豆av在线| 在线观看免费视频日本深夜| 国产午夜精品久久久久久| 可以在线观看的亚洲视频| 国产精品野战在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 一个人免费在线观看电影 | 午夜福利欧美成人| 禁无遮挡网站| 一级毛片精品| 国产男靠女视频免费网站| 99国产综合亚洲精品| 精品一区二区三区四区五区乱码| 最近最新中文字幕大全电影3| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲国产精品合色在线| 日本黄大片高清| 久久久国产欧美日韩av| 99热只有精品国产| 欧美zozozo另类| 精品无人区乱码1区二区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲在线自拍视频| 国产激情欧美一区二区| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲国产精品sss在线观看| 九色成人免费人妻av| 偷拍熟女少妇极品色| 色播亚洲综合网| 国产麻豆成人av免费视频| 人妻久久中文字幕网| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 午夜福利在线在线| 黄频高清免费视频| 级片在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 欧美在线一区亚洲| 亚洲国产精品久久男人天堂| 看黄色毛片网站| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 免费在线观看影片大全网站| 色在线成人网| 十八禁网站免费在线| 欧美zozozo另类| 可以在线观看的亚洲视频| 国产精品永久免费网站| 欧美日韩综合久久久久久 | 国产亚洲欧美98| 亚洲欧美日韩东京热| 最新中文字幕久久久久 | 亚洲最大成人中文| 欧美黑人欧美精品刺激| 欧美日韩福利视频一区二区| 最新美女视频免费是黄的| 又黄又粗又硬又大视频| 悠悠久久av| 少妇人妻一区二区三区视频| 久久久久久久久久黄片| 我要搜黄色片| 欧美日韩福利视频一区二区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 在线观看舔阴道视频| 国产乱人伦免费视频| 久久热在线av| 国产av麻豆久久久久久久| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲精品在线观看二区| 五月伊人婷婷丁香| 麻豆国产97在线/欧美| 夜夜爽天天搞| 性欧美人与动物交配| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 久久久成人免费电影| 麻豆国产av国片精品| netflix在线观看网站| 少妇人妻一区二区三区视频| 俺也久久电影网| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 母亲3免费完整高清在线观看| 国产高清videossex| 日韩欧美 国产精品| 亚洲性夜色夜夜综合| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 一区二区三区激情视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久这里只有精品中国| 熟女人妻精品中文字幕| 日韩国内少妇激情av| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲人与动物交配视频| 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久久久久国产a免费观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 精品一区二区三区视频在线 | 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产欧美日韩一区二区三| 观看美女的网站| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲精品在线观看二区| 90打野战视频偷拍视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产一区二区三区视频了| 国产精品av久久久久免费| 国产精品永久免费网站| 大型黄色视频在线免费观看| 国产成人影院久久av| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美日韩福利视频一区二区| 麻豆成人av在线观看| 免费高清视频大片| 国产激情久久老熟女| 免费在线观看影片大全网站| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 欧美一级a爱片免费观看看| av天堂在线播放| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 可以在线观看毛片的网站| 欧美在线黄色| 精品一区二区三区四区五区乱码| av福利片在线观看| 91av网站免费观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 美女午夜性视频免费| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 无限看片的www在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 一本精品99久久精品77| 天天一区二区日本电影三级| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲国产色片| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲av五月六月丁香网| 成人特级av手机在线观看| 国产久久久一区二区三区| 一进一出抽搐gif免费好疼| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲在线自拍视频| 国产高清激情床上av| 国产麻豆成人av免费视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 久久草成人影院| 曰老女人黄片| 在线视频色国产色| 白带黄色成豆腐渣| 久久中文看片网| 亚洲欧美激情综合另类| 国产精品99久久99久久久不卡| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 三级毛片av免费| 又黄又粗又硬又大视频| 国产欧美日韩一区二区三| 1024手机看黄色片| 亚洲 欧美一区二区三区| 身体一侧抽搐| 一二三四社区在线视频社区8| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久热在线av| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产av不卡久久| 高清毛片免费观看视频网站| 一级毛片高清免费大全| 国产成年人精品一区二区| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 成人无遮挡网站| 看片在线看免费视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 性欧美人与动物交配| 1000部很黄的大片| 男人的好看免费观看在线视频| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲熟妇熟女久久| 国产综合懂色| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 精品一区二区三区四区五区乱码| 成年女人看的毛片在线观看| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产亚洲精品一区二区www| 长腿黑丝高跟| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 免费看a级黄色片| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产精品国产高清国产av| 露出奶头的视频| 91老司机精品| 午夜免费观看网址| 色尼玛亚洲综合影院| 午夜福利18| 在线观看免费午夜福利视频| av在线蜜桃| 亚洲五月天丁香| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 最新美女视频免费是黄的| 美女午夜性视频免费| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲中文字幕日韩| 免费人成视频x8x8入口观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 午夜亚洲福利在线播放| 国产午夜精品论理片| 国产一区二区在线av高清观看| svipshipincom国产片| 日韩成人在线观看一区二区三区| 熟女人妻精品中文字幕| 欧美日韩综合久久久久久 | 久久热在线av| 亚洲激情在线av| 成人三级做爰电影| 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧美色欧美亚洲另类二区| 午夜视频精品福利| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲七黄色美女视频| 波多野结衣巨乳人妻| 丰满人妻一区二区三区视频av | 麻豆成人午夜福利视频| 不卡一级毛片| 香蕉国产在线看| 黄色成人免费大全| 91久久精品国产一区二区成人 | 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 一个人免费在线观看电影 | 99国产精品一区二区蜜桃av| 老司机深夜福利视频在线观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 久久久久久久久免费视频了| 国产91精品成人一区二区三区| 校园春色视频在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 男女午夜视频在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 99riav亚洲国产免费| 国产乱人伦免费视频| 18禁美女被吸乳视频| 欧美日本视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久久久免费精品人妻一区二区| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美日韩国产亚洲二区| 日韩欧美免费精品| 国产伦在线观看视频一区| 九九热线精品视视频播放| 国产探花在线观看一区二区| 久久久水蜜桃国产精品网| 久久国产精品人妻蜜桃| 91av网一区二区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久香蕉精品热| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲精品色激情综合| 亚洲av电影不卡..在线观看| 色在线成人网| 日本黄色片子视频| 最好的美女福利视频网| bbb黄色大片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 欧美在线一区亚洲| 国产精品国产高清国产av| 黄色视频,在线免费观看| 国产av麻豆久久久久久久| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 观看免费一级毛片| 丰满人妻一区二区三区视频av | 国产视频内射| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产欧美日韩一区二区精品| 久久中文看片网| 香蕉国产在线看| 国产av一区在线观看免费| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲av电影不卡..在线观看| 日韩国内少妇激情av| 91av网一区二区| 黄频高清免费视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产激情欧美一区二区| 精品不卡国产一区二区三区| 波多野结衣巨乳人妻| 久久香蕉精品热| 在线观看一区二区三区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 两个人看的免费小视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 91av网站免费观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 久久午夜亚洲精品久久| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲乱码一区二区免费版| 69av精品久久久久久| 久久热在线av| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美激情在线99| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 日本五十路高清| 一个人免费在线观看的高清视频| 免费在线观看成人毛片| a级毛片在线看网站| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 午夜视频精品福利| www.www免费av| 国产激情偷乱视频一区二区| 五月伊人婷婷丁香| 久久亚洲真实| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国内精品美女久久久久久| 偷拍熟女少妇极品色| 国产精品 欧美亚洲| 一进一出抽搐gif免费好疼| 精品免费久久久久久久清纯| xxx96com| 一级a爱片免费观看的视频| 精品欧美国产一区二区三| 国产精品亚洲美女久久久| 国产91精品成人一区二区三区| 久久久久性生活片| 九九在线视频观看精品| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲成人久久性| 狠狠狠狠99中文字幕| 看片在线看免费视频| 国产精品久久久久久精品电影| 很黄的视频免费| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲性夜色夜夜综合| 成人欧美大片| 久久中文字幕一级| 免费无遮挡裸体视频| 在线观看午夜福利视频| 12—13女人毛片做爰片一| 在线免费观看不下载黄p国产 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| 午夜免费成人在线视频| 午夜福利成人在线免费观看| 久久中文看片网| 免费在线观看日本一区| 天天添夜夜摸| 亚洲色图av天堂| 一本久久中文字幕| 亚洲 国产 在线| 女人被狂操c到高潮| 色噜噜av男人的天堂激情| 久久久久精品国产欧美久久久| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲av成人一区二区三| 色综合婷婷激情| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产探花在线观看一区二区| 99精品在免费线老司机午夜| 成年版毛片免费区| or卡值多少钱| 国产v大片淫在线免费观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 男女之事视频高清在线观看| 免费观看精品视频网站| 男女下面进入的视频免费午夜| 日韩有码中文字幕| 在线a可以看的网站| 性色av乱码一区二区三区2| 少妇的逼水好多| 亚洲18禁久久av| 日本在线视频免费播放| 美女大奶头视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 成人av一区二区三区在线看| 18美女黄网站色大片免费观看| 99国产精品一区二区三区| a级毛片a级免费在线| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久久这里只有精品19| 999久久久精品免费观看国产| 一个人观看的视频www高清免费观看 | e午夜精品久久久久久久| 亚洲成人久久性| e午夜精品久久久久久久| 精品国产三级普通话版| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 嫩草影院精品99| 亚洲av五月六月丁香网| 久9热在线精品视频| 国产野战对白在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 久久久久久大精品| 国产精品国产高清国产av| 美女cb高潮喷水在线观看 | 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲av美国av| 香蕉久久夜色| 国产成人影院久久av| 久久精品人妻少妇| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产精品一区二区三区四区久久| 一本综合久久免费| 十八禁人妻一区二区| 国产三级中文精品| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 午夜激情福利司机影院| 国产又色又爽无遮挡免费看| 校园春色视频在线观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 一个人免费在线观看电影 | 亚洲 欧美一区二区三区| 在线观看一区二区三区| 免费在线观看亚洲国产| 动漫黄色视频在线观看| 欧美在线一区亚洲| 超碰成人久久| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲美女黄片视频| 桃色一区二区三区在线观看| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲成av人片免费观看| 在线a可以看的网站| 老鸭窝网址在线观看| 757午夜福利合集在线观看| 观看美女的网站| 成人永久免费在线观看视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 成人一区二区视频在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久久久久久久久久黄片| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 色噜噜av男人的天堂激情| 婷婷丁香在线五月| avwww免费| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 丰满的人妻完整版| 婷婷丁香在线五月| 哪里可以看免费的av片| 婷婷亚洲欧美| 国产成人aa在线观看| 一区福利在线观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲精华国产精华精| www.自偷自拍.com| 精品久久久久久久久久久久久| 成年女人永久免费观看视频| 婷婷精品国产亚洲av| 热99re8久久精品国产| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 男女午夜视频在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 一夜夜www| 我的老师免费观看完整版| 精品午夜福利视频在线观看一区| 变态另类丝袜制服| h日本视频在线播放| 午夜激情福利司机影院| 91麻豆精品激情在线观看国产| 韩国av一区二区三区四区| 桃红色精品国产亚洲av| 国产成人系列免费观看| 99热精品在线国产| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 久久久久久久久久黄片| 一个人看视频在线观看www免费 | 一级毛片精品| 最近最新免费中文字幕在线| av中文乱码字幕在线| 最近最新中文字幕大全电影3| 免费大片18禁| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产激情久久老熟女| 午夜福利免费观看在线| 全区人妻精品视频| 中出人妻视频一区二区| 床上黄色一级片| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| aaaaa片日本免费| 岛国视频午夜一区免费看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲成人久久爱视频| 在线永久观看黄色视频| 一本综合久久免费| 麻豆国产av国片精品| 国产高清激情床上av| 久久精品国产综合久久久| 十八禁人妻一区二区| 美女大奶头视频| 国产精品野战在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲五月天丁香| 国产野战对白在线观看| 脱女人内裤的视频| 精品久久久久久久末码| 色在线成人网| 成人欧美大片| 这个男人来自地球电影免费观看| 亚洲国产精品999在线| 精品国内亚洲2022精品成人| 色精品久久人妻99蜜桃| 午夜福利18| 成人一区二区视频在线观看| 国模一区二区三区四区视频 | 国产 一区 欧美 日韩| 91在线精品国自产拍蜜月 | 国产精品精品国产色婷婷| 欧美日韩黄片免| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 偷拍熟女少妇极品色| 成人av一区二区三区在线看| 伦理电影免费视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 成人国产一区最新在线观看| 日本一本二区三区精品| 亚洲黑人精品在线| 午夜影院日韩av| 国产av麻豆久久久久久久| 俺也久久电影网| 美女午夜性视频免费|