一株厭氧反硝化細菌的分離鑒定與砷耐受功能研究

馮紀龍，陳曉明，劉紫薇，羅 鋒

(1.中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢 430078；2.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430056)

砷(As)是一種類金屬元素，有很強的毒性，廣泛存在于地殼與生物圈。它的氧化物——三氧化二砷(AsO)，就是俗稱的“砒霜”。我國作為糧食生產(chǎn)大國，土壤中的砷卻嚴重超標，而稻米吸收土壤中的砷，導(dǎo)致砷進入人體造成一系列的健康問題。我國砷超標大米占全國總量的1%左右，全國有60%地區(qū)以食用稻米為主。據(jù)報道，稻米對砷的吸收能力比其他農(nóng)作物及蔬菜高很多，在砷污染比較輕的地區(qū)，水稻中的砷從莖葉到稻米的轉(zhuǎn)移系數(shù)比小麥和其他作物高10倍左右。在高砷的環(huán)境下，一部分微生物為了維持正常的生命活動，進化出耐砷機能，一些微生物能夠通過自身生化作用將毒性很強的砷排出體外而進入環(huán)境中。微生物對砷的耐受機制主要與砷的吸收、氧化還原、甲基化和外排等作用相關(guān)。砷的抗性主要由 arsC 操縱子操控。原核生物的砷抗性研究顯示，砷的抗性主要由3個基因來調(diào)控。微生物對三價砷[As(Ⅲ)或As]的氧化由砷氧化酶基因(aioA/aioB)調(diào)控，對五價砷[As(Ⅴ)或As]的還原由細菌的砷還原酶基因(arr/arsC)調(diào)控。

第三步：2NO+2H+2e→NO+HO

第四步：NO+2H+2e→N+HO

稻米和蔬菜是人體攝入的主要食物來源，由于人的活動造成了稻米和蔬菜中砷與硝酸鹽超標。當(dāng)人體長期攝入砷與硝酸鹽時，會造成機體的嚴重損害。砷污染稻米與硝酸鹽超標蔬菜會經(jīng)過人體的消化道被胃腸道吸收并釋放部分砷與硝酸鹽產(chǎn)物，人體腸道對砷與硝酸鹽具有一定的解毒作用，腸道微生物發(fā)揮著重要的作用。砷在人體腸道內(nèi)各個階段的價態(tài)和比例各不相同，人體腸道微生物群落結(jié)構(gòu)在各個時期也不相同。人體腸道微生物群落對硝酸鹽的還原途徑主要有兩種：一種是通過硝酸鹽異化作用還原為銨；另一種是通過反硝化作用轉(zhuǎn)化為N。

目前關(guān)于硝酸鹽在人體腸道中的還原機制研究已經(jīng)取得了很大的進展，但是對于具有特點的硝酸鹽還原單株菌報道還很少見。因此，本試驗通過富集與分離方法得到單株

Escherichia

CD14-2，研究了此單株菌的反硝化速率，并對其耐砷作用進行了探究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集

用糞便采樣器(Longsee菌群采樣器)和滅菌藥勺采取人體新鮮糞便樣品。志愿者是來自于非砷污染地區(qū)且6個月沒有抗生素治療史的一名健康女性。糞樣為晨便中段約3～4 cm處。

1.1.2 培養(yǎng)基

腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)(g/L):腦心浸液17.5 g，D-葡萄糖2.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，磷酸二氫鈉2.5 g，瓊脂(選擇添加)15.0 g，去離子水1 000 mL。

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g,氯化鈉10 g，去離子水950 mL，瓊脂(選擇添加)15.0 g。

DM培養(yǎng)基(g/L)：硝酸鉀0.72 g，磷酸二氫鉀1 g，七水硫酸鎂1 g，琥珀酸鈉2.8 g，去離子水1 000 mL。

改良后礦物鹽培養(yǎng)基(3M培養(yǎng)基)(g/L)：十二水磷酸氫二鈉7.56 g，磷酸二氫鉀3 g，七水硫酸鎂0.3 g，氯化鉀0.5 g，氯化鈣0.01 g，微量元素溶液，維生素溶液，去離子水1 000 mL。

上述培養(yǎng)基均在121℃、1×10Pa條件下，滅菌30 min備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 腸道微生物中反硝化細菌的富集

1.2.2 耐砷反硝化細菌的分離與純化

1.2.3 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

觀察菌株的形態(tài)、大小和顏色，進行革蘭氏染色，并結(jié)合《伯杰細菌鑒定手冊》進行形態(tài)特征鑒定。

1.2.4 菌株的16S rRNA和narG功能基因的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

采用煮沸法提取菌株的DNA作為模板，使用16S rRNA基因PCR通用引物進行擴增。正向引物為27F，反向引物為1541R。其堿基序列分別是5-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3和5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3。反應(yīng)體系為(50 uL)：ddHO 38.75 μL， 10×PCR 緩沖液5 μL，dNTPs 1 μL，27F和1541R各1 μL，Taq polymerase 0.25 μL，DNA模板3 μL。16S rRNA反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，50℃復(fù)性30 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)，72℃延伸7 min。

將PCR產(chǎn)物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，并將PCR產(chǎn)物送至武漢天一輝遠公司進行測序。

用菌株DNA作為模板，對菌株的功能基因——硝酸鹽還原酶基因進行擴增。PCR引物選用墨西哥科學(xué)家Rocio等設(shè)計的兩對引物：

napAf1:5-CTGGACIATGGGYTTIAACCA -3

napAr1:5-CCTTCYTTYTCIACCCACAT-3

narGf1:5-ICAYGGIGTIAACTGYAC-3

narGr1:5-TCGSMRTACCAGTCRTARAA-3

兩對引物napA和narG期望的PCR片段長度在500 bp左右，引物由武漢天一輝遠公司合成，得到目的條帶后進行膠回收[DNA膠回收試劑盒QIAquick? Gel Extraction Kit(50)]，然后進行連接轉(zhuǎn)化試驗，并挑取含有重組質(zhì)粒的陽性菌落進行菌液PCR鑒定。菌液PCR引物為通用引物RV-M和M13-47。將PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并將電泳條帶在500 bp左右的菌液送至武漢天一輝遠公司進行測序。

1.2.5 測定菌株對不同碳源的利用情況和不同砷濃度下的反硝化能力

1.2.6 測定方法與數(shù)據(jù)分析

采用紫外分光光度法(BHJ/T 346—200)測定樣品中硝態(tài)氮(NO-N)含量；采用N-(1- 萘基)- 乙二胺二鹽酸鹽分光光度法(GB 7493—87)測定樣品中亞硝態(tài)氮(NO-N)含量；采用納氏試劑分光光度法(GB HJ535—2009)測定樣品中銨態(tài)氮(NH-N)含量；使用pH儀測定樣品的pH值；采用原子熒光光譜法(AFS)測定樣品中砷含量。

圖和表使用Origin 9.5和Excel繪制；使用Photoshop CC2015 編輯圖片；系統(tǒng)發(fā)育樹使用 MEGA 7.0完成制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 反硝化細菌的富集、分離與純化

利用BHI培養(yǎng)基進行富集，DM培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基進行分離與純化，用3M培養(yǎng)基測試分離純化出來的細菌功能，得到一株反硝化細菌CD14-2。該菌株能將10 mM NO-N轉(zhuǎn)化為大約9 mM NO-N，轉(zhuǎn)化率可達到90%，期間不產(chǎn)生銨態(tài)氮。

2.2 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹建立與同源性分析

菌株CD14-2在LB固體培養(yǎng)基上的形狀為圓形，顏色為乳白色，微微隆起，單菌落直徑大概在2～3 μm，表面光滑有光澤且有一定的黏性，見圖1。該菌株革蘭氏染色為陽性，光學(xué)顯微鏡下觀察為細小短桿型。將得到的單菌落用LB培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后吸取1 mL菌液，利用煮沸法提取菌株CD14-2 的DNA，然后將PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，得到條帶在1 500 bp 左右。通過測序得到菌株CD14-2的16S rRNA基因序列，并在NCBI上Genbank數(shù)據(jù)庫進行BLAST序列比對與分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株屬于變形菌門，腸桿菌科，埃希氏桿菌屬(CD14-2基因序列與埃希氏桿菌(

Escherichia

fegusonii

)序列相似度達到了98.43%)，將其命名為

Escherichia

sp.CD14-2。使用鄰接法構(gòu)建菌株

Escherichia

sp.CD14-2的16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。將菌株

Escherichia

sp.CD14-2的16S rRNA基因序列提交Genbank，獲取Genbank登錄號為MT883284。

圖1 菌株Escherichia sp.CD14-2 平板

圖2 菌株Escherichia sp.CD14-2的16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

通過試驗發(fā)現(xiàn)菌株

Escherichia

sp.CD14-2具有反硝化作用，能夠?qū)⑾跛猁}轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽。于是對其反硝化過程的第一步關(guān)鍵酶——硝酸鹽還原酶基因narG和napA進行擴增和測序(napA擴增未成功)。根據(jù)菌株

Escherichia

CD14-2的narG基因編碼的氨基酸序列在NCBI上進行BLAST序列對比與分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其同源性最近的是

Escherichia

coil

(大腸桿菌)，相似度達到了98.18%。使用鄰接法構(gòu)建菌株

Escherichia

sp.CD14-2功基于narG同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。

圖3 菌株Escherichia sp.CD14-2基于narG同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株Escherichia sp.CD14-2 的反硝化功能

在新鮮糞便中分離出的腸道微生物單株

Escherichia

sp.CD14-2 是一株反硝化細菌，但是其只能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽并大量累積。本試驗探究了菌株

Escherichia

sp.CD14-2在乳酸鈉作為碳源下的反硝化能力，其試驗結(jié)果見圖4。

圖4 菌株Escherichia sp.CD14-2在乳酸鈉作為碳源下的反硝化速率

在含有乳酸鈉作為碳源的培養(yǎng)基中，菌株

Escherichia

sp.CD14-2 能夠在2 d內(nèi)將10 mM硝酸鹽氮還原為 9 mM亞硝酸鹽氮，還原率達到 90%左右；而在其他有機碳源下，該菌株還原硝酸鹽的能力較弱，當(dāng)加入無機碳源碳酸氫鈉時，菌株

Escherichia

sp.CD14-2的反硝化能力很弱，在一周內(nèi)才生成1 mM左右的亞硝酸鹽。

2.4 菌株Escherichia sp.CD14-2對不同碳源的利用情況

將菌株

Escherichia

sp.CD14-2接種到添加有不同碳源的培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在含有甲酸鈉或甲醇的培養(yǎng)基中細菌幾乎不具有反硝化功能，在含有碳酸氫鈉或檸檬酸鈉的培養(yǎng)基中該菌株反硝化功能較弱，而在含有乳酸鈉或丙酮酸鈉或葡萄糖的培養(yǎng)基中，該菌株生長非常迅速且反硝化功能很強。菌株

Escherichia

sp.CD14-2對不同碳源的利用情況，見表1。

表1 菌株Escherichia sp.CD14-2對不同碳源的利用情況

菌株分離自新鮮糞樣，屬于腸道微生物。腸道微生物能夠利用多種碳源為機體和菌株本身提供生長所需要的能量，菌株

Escherichia

sp.CD14-2的分離純化說明腸道微生物具有硝酸鹽還原的能力。如果外部的硝酸鹽濃度過高對機體可能產(chǎn)生嚴重的危害。

2.5 菌株Escherichia sp.CD14-2的耐砷功能

對于反硝化細菌

Escherichia

sp.CD14-2的耐砷功能的探究，可在不同三價砷濃度下檢測菌株

Escherichia

sp.CD14-2的OD值來測定該菌株的生長曲線，見圖5。

圖5 菌株Escherichia sp.CD14-2在不同三價砷濃度下的生長曲線

由圖5可見，在LB培養(yǎng)基中，該菌株在無砷條件下OD值達到0.8左右，在添加1 mM As(Ⅲ)的情況下其OD值略小于不加入外源砷，而繼續(xù)增加外源砷濃度時，該菌株的生長受到抑制。

2.6 不同砷濃度下菌株Escherichia sp.CD14-2的反硝化能力

在測定不同砷濃度下菌株

Escherichia

sp.CD14-2的反硝化能力時，選用改良的礦物鹽培養(yǎng)基(3M)作為培養(yǎng)基，乳酸鈉作為有機碳源,其試驗結(jié)果見圖6。

圖6 菌株Escherichia sp.CD14-2在不同砷濃度下硝酸鹽氮的還原和亞硝酸鹽氮的生成曲線

3 結(jié) 論

(1) 本試驗采用健康女性的糞便，通過分離與純化得到反硝化細菌CD14-2，經(jīng)形態(tài)學(xué)分析鑒定其為革蘭氏陰性菌，16S rRNA基因序列分析得出其與

Escherichia

fegusonii

相似性達到98.43%，確定該菌株為埃希氏桿菌屬，并命名為

Escherichia

sp.CD14-2。該菌株的硝酸鹽還原功能與narG基因相關(guān)。(2) 本試驗檢測了菌株

Escherichia

sp.CD14-2對不同碳源的利用情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株能夠快速利用葡萄糖、乳酸鈉、丙酮酸鈉等碳源，對于甲酸鈉和甲醇幾乎不能利用或者利用緩慢。(3) 砷對菌株

Escherichia

sp.CD14-2的生長具有抑制作用，且砷濃度越大其抑制效果越強烈。此外，在不加砷和外源砷濃度在1 mM的情況下菌株

Escherichia

sp.CD14-2能夠在48 h內(nèi)將10 mM的NO-N還原成8.0 mM NO-N并且大量累積；在加入5.0 mM的外源砷時，菌株

Escherichia

sp.CD14-2能夠在48 h內(nèi)將10 mM的NO-N還原成6.0 mM NO-N，高砷對其生長具有抑制作用。(4) 本試驗對富集分離出的菌株

Escherichia

sp.CD14-2 的反硝化能力及其耐砷功能的研究，說明人體腸道內(nèi)具有砷抗性微生物，當(dāng)人體攝入少量砷時，腸道微生物可能具有一定的解毒功能。