水生動物原肌球蛋白致敏原研究進展

陳紅兵， 胡 昕， 謝彥海， 華希瑋

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，南昌大學(xué)，江西 南昌330047；2.南昌大學(xué) 中德聯(lián)合研究院，江西 南昌330047；3.南昌大學(xué) 食品學(xué)院，江西 南昌330047；4.南昌大學(xué) 實驗動物科學(xué)中心，江西 南昌330006）

食物過敏已被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為21世紀(jì)重要的健康問題之一[1]。食物過敏影響呼吸系統(tǒng)、胃腸道消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等，其癥狀主要表現(xiàn)為水腫、蕁麻疹、腹瀉、過敏性哮喘等，嚴(yán)重時可危及生命[2]。

八大類過敏食物中包含甲殼類動物和魚類[3]。2018年中國水產(chǎn)品總產(chǎn)量為6 457.7萬噸，每年人均水產(chǎn)品消費量為11.7 kg[4]。隨著水產(chǎn)品在我國的消費量持續(xù)增加，其引起的食物過敏病例也逐漸增多，尤其是在沿海地區(qū)。與雞蛋、牛奶過敏不同，水產(chǎn)品過敏通常是伴隨終生的，將對人類健康產(chǎn)生巨大威脅[5]。因此，水產(chǎn)品引起的食物過敏值得高度重視。

致敏原是指可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生IgE，引起I型超敏反應(yīng)的抗原[6]。原肌球蛋白（tropomyosin，TM）是一種重要的食物致敏原，廣泛存在于甲殼類、貝類等水產(chǎn)品中。本文中將常見水生動物原肌球蛋白的性質(zhì)、表位和免疫交叉反應(yīng)、致敏性及其消減的研究進展進行總結(jié)。

1 原肌球蛋白

原肌球蛋白是一種耐熱的酸性糖蛋白，相對分子質(zhì)量為3.6×104~4.0×104[7]。TM主要存在于肌肉中，與肌動蛋白結(jié)合形成復(fù)合物調(diào)節(jié)肌肉收縮。在非肌肉中，TM主要功能是維持細(xì)胞骨架的完整性[8]。每個TM分子有7個肌動蛋白結(jié)合位點，可結(jié)合7個肌動蛋白[9]。TM二級結(jié)構(gòu)是由2個α螺旋多肽鏈相互纏繞形成的超螺旋結(jié)構(gòu)，α螺旋占比大于80%，剩余為β螺旋、無規(guī)則卷曲等，沒有復(fù)雜的三、四級空間結(jié)構(gòu)[10]。TM結(jié)構(gòu)保守，其中大部分保守的氨基酸序列位于N末端和C末端[11]。

原肌球蛋白是多種無脊椎動物中的一種泛致敏原，是軟體動物和甲殼類動物的主要過敏原，同時也是一些其他無脊椎動物（屋塵螨等）的次要過敏原[12]。世界衛(wèi)生組織與國際免疫聯(lián)合會（IUIS）下屬的過敏原國際命名委員會對已確認(rèn)的TM致敏原進行了登記收錄（見表1）。

表1 官方認(rèn)可的致敏原原肌球蛋白[13]Table 1 Officially recognized tropomyosin allergens[13]

續(xù)表1

1.1 魚類原肌球蛋白

脊椎動物TM與無脊椎動物TM同源性約為55%，與無脊椎動物TM相比，脊椎動物TM結(jié)構(gòu)更加靈活多變[14]。一般認(rèn)為脊椎動物TM沒有致敏性，然而近年來發(fā)現(xiàn)少數(shù)魚類TM具有致敏性[15]。魚類中的主要致敏原是小清蛋白，Liu等[16]的研究表明原肌球蛋白（Ore m 4）是莫桑比克羅非魚（Oreochromis mossambicus）的致敏原[4]，同時也是TM作為脊椎動物致敏原的較早報道。該TM與人原肌球蛋白亞型5同源性為87.7%，引起的過敏反應(yīng)與自身免疫十分相似。另外，研究者在帶魚（Trichiurus lepturus）[17]、鯉魚[18]中發(fā)現(xiàn)有相對分子質(zhì)量與TM相似且具有致敏性的蛋白質(zhì)。張晶宇[19]發(fā)現(xiàn)牙鲆魚（Paralichthys olivaceus）原肌球蛋白alpha-1、大黃魚（Larimichthys crocea）原肌球蛋白alpha-1和alpha-4與已知致敏原莫桑比克羅非魚Ore m 4的相似性分別為97.9%、82.0%、89.0%，推測這3種蛋白質(zhì)可能具有潛在的致敏性。如今相關(guān)研究領(lǐng)域已對魚類TM的致敏性有越來越多的研究。

1.2 甲殼類動物原肌球蛋白

蝦和蟹是人類食用的主要甲殼類動物，其中蝦的TM約占蝦肌肉的5%~7%[20]。TM是甲殼類動物中主要致敏原，該致敏原最早在1981年被報道[21]。60%~80%甲殼類動物過敏患者對原肌球蛋白IgE反應(yīng)為陽性[22]。在甲殼類動物肌肉中發(fā)現(xiàn)了TM 2種亞型：快型和慢型。雖然這2種亞型之間結(jié)構(gòu)相似，但是某些特定氨基酸序列具有差異[23]。目前，多種甲殼類動物的TM已被純化和鑒定[24-29]。TM可存在于螃蟹、蝦的加工環(huán)境中，與職業(yè)性過敏有關(guān)[30]。

1.3 軟體動物原肌球蛋白

相比于甲殼類動物，軟體動物的TM研究較少。目前，WHO公認(rèn)的軟體動物的致敏原有6種（Cra g 1、Hal l 1、Hel as 1、Sac g 1、Tod p 1、Hal m 1），其中前5種為TM。Miyazawa等[31]于1996年已報道TM是魷魚（Todarodes pacificus）的主要致敏原。黃榕芳[32]克隆了櫛孔扇貝（Azumapecten farreri）TM的cDNA序列，得到等電點為4.46的原肌球蛋白。呂良濤[33]對菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）TM進行分離純化以及分子克隆，結(jié)果表明菲律賓蛤仔TM相對分子質(zhì)量約為3.7×104，等電點5.1。與甲殼類動物TM類似，軟體動物TM也存在職業(yè)性過敏風(fēng)險。如有一名廚師加工和烹飪魷魚后出現(xiàn)過敏癥狀并被確診為過敏[34]。

2 原肌球蛋白表位和免疫交叉反應(yīng)研究

2.1 原肌球蛋白抗原表位

表位（epitope）又稱為抗原決定簇，是指抗原分子中可誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的數(shù)個氨基酸組成的序列和空間結(jié)構(gòu)[7]。按照空間結(jié)構(gòu)，表位可分為線性表位與構(gòu)象表位。線性表位與食物過敏關(guān)系密切[35]，對于TM表位的研究以線性表位為主。致敏原表位區(qū)域比非表位區(qū)域更加穩(wěn)定[36]。TM被胃腸消化后，其表位結(jié)構(gòu)會在消化過程中發(fā)生改變。消化過程中，酶可能破壞或改變TM部分表位，也可暴露更多隱藏在內(nèi)部的線性表位[37]。TM表位的研究對免疫交叉反應(yīng)、致敏性評價與消減、臨床診斷等均有重要作用。

2.1.1 原肌球蛋白表位研究方法 研究致敏原表位的實驗方法包括重疊肽庫技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、質(zhì)譜、蛋白質(zhì)芯片、表面等離子共振技術(shù)等[38]，此外還可使用生物信息學(xué)方法進行表位預(yù)測。常見的表位預(yù)測軟件包括DNAStar Protean System、AntheProt software、BepiPred 2.0 Server、SOPMA等，再結(jié)合抑制性斑點印跡、酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）、嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒實驗等進行鑒定[39-40]。另外，高通量測序與基因編輯技術(shù)也逐漸在表位研究中得到運用[41]。

2.1.2 甲殼類動物原肌球蛋白表位定位與鑒別已有不少學(xué)者對甲殼類動物TM表位進行定位與鑒別。如Ayuso[42]使用重疊肽庫鑒定出褐對蝦的5個線性表位。Zheng[43]利用DNAStar Protean系統(tǒng)、癌癥疫苗中心（CVC）的生物信息學(xué)預(yù)測抗原肽（BPAP）系統(tǒng)和BepiPred 1.0 Server預(yù)測斑節(jié)對蝦Pen m 1表位，得到10個預(yù)測表位并鑒定出其中8個為主要表位，酪氨酸、谷氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸在表位中比例較高。韓建勛[44]研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦TM中Peptide 1、Peptide 3、Peptide 6和Peptide 9是關(guān)鍵性表位。南美白對蝦Lit v 1已預(yù)測出10個線性表位，其中8個通過間接競爭ELISA得到驗證。Peptide 2（28—41）則未見報道，或為南美白對蝦TM的特異性表位[45]。楊煌[46]預(yù)測出擬穴青蟹（Scyllaparamamosain）TM的8個T細(xì)胞表位，其表位分布范圍廣，患者幾乎都可識別。王學(xué)麗[47]用南美白對蝦TM的抗消化表位合成肽灌胃Balb/c小鼠，其中3個抗原表位肽（111—125、137—141、50—66）引起小鼠特異性IgE抗體和組胺水平上升，證明TM經(jīng)過消化后部分表位仍具有免疫活性，這3個表位或是蝦過敏的關(guān)鍵性表位。華?，|等[48]預(yù)測到日本沼蝦10個B細(xì)胞線性表位與5個T細(xì)胞表位，與已確定的TM表位有重疊部分。Zhang等[40]采用DNAStar Protean System、AntheProt software、BepiPred 2.0 Server 3個軟件預(yù)測秀麗白蝦TM表位，并使用抑制性斑點印跡和重疊肽庫鑒定出5個線 性 表 位：Epitope 1 （43—59）、Epitope 2（85—105）、Epitope 3（131—164）、Epitope 4（187—201）、Epitope 5（243—280），同時對胃腸道消化物進行表位預(yù)測，33個消化后的肽段中有26個呈IgE陽性。

2.1.3 軟體動物原肌球蛋白表位定位與鑒別 與蝦TM相比，對軟體動物TM的表位研究相對較少。牡蠣Cra g 1表位已明確包含AA92—105（IQLLEEDMERSEER）[49]。Ishikawa[50]鑒 定 了 章 魚Oct v 1表位為AA77—112、AA148—160、AA269—281，表位AA77—112與牡蠣Cra g 1表位AA92—105有相同的序列。黃蓉芳[32]研究了18種軟體動物TM的序列一致性，發(fā)現(xiàn)氨基酸序列保守區(qū)域為：AA120—125、AA164—178、AA214—228、AA251—261，其中AA251—261與Pen a 1表位有重合部分，或可導(dǎo)致交叉反應(yīng)。呂良濤[51]在排除人、豬TM和菲律賓蛤仔TM相同的表位后，預(yù)測確定了菲律賓蛤仔TM的4個線性表位：Peptide 2，Peptide 6，Peptide 9和Peptide 10。

2.2 原肌球蛋白免疫交叉反應(yīng)

交叉反應(yīng)是一種致敏原誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的sIgE與另一種相似致敏原結(jié)合誘發(fā)產(chǎn)生的過敏反應(yīng)[52]。交叉反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)是抗原表位[53]。不同致敏原有相同或相似的表位易產(chǎn)生交叉反應(yīng)。國際食品法典委員會（CAC）對交叉反應(yīng)評估標(biāo)準(zhǔn)進行了修訂：蛋白質(zhì)中的氨基酸數(shù)目超過80，當(dāng)氨基酸同源性大于35%或者含有相同的8個連續(xù)氨基酸，該蛋白質(zhì)可能存在交叉反應(yīng)性[54]。致敏原氨基酸序列同源性高，可能導(dǎo)致其三維結(jié)構(gòu)具有同源性[55]。同源性高并不能證明一定產(chǎn)生免疫交叉反應(yīng)，需要結(jié)合血清學(xué)實驗研究，但是血清學(xué)交叉反應(yīng)與臨床反應(yīng)不一定完全相關(guān)[56]。

2.2.1 水產(chǎn)品TM之間免疫交叉反應(yīng) TM結(jié)構(gòu)保守，多種TM具有共同的IgE表位，因此TM交叉反應(yīng)廣泛存在。無脊椎動物TM之間的交叉反應(yīng)已得到證實[57]，并且無脊椎動物致敏原中TM交叉反應(yīng)最強。

過去，脊椎動物的TM基本被認(rèn)為無致敏性。但是，近年來研究表明某些魚類和貝類中的TM也可能存在潛在的交叉反應(yīng)[58]。李荔等[59]克隆純化的斑馬魚TM對魚蝦蟹過敏患者血清具有良好的免疫活性。2018年報道了一位蝦過敏患者在攝取一定量的魚后出現(xiàn)過敏反應(yīng)，特異性IgE（ImmunoCAP ISAC）實驗中檢測了112種致敏原組分，魚小清蛋白無陽性反應(yīng)，對TM（Pen m 1、Der p 10、Ani s 3、Bla g 7）呈陽性。該患者血清與相對分子質(zhì)量3.6×104條帶對應(yīng)物質(zhì)呈IgE陽性反應(yīng)，免疫印跡結(jié)果表明該條帶為TM，證明鱈魚TM可與蝦TM發(fā)生交叉反應(yīng)[60]。

甲殼類動物之間TM同源性可達(dá)98%以上。Zheng等[43]比較了14種甲殼類動物TM氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦、褐美對蝦TM表位序列基本一致，且14種TM潛在表位也具有高度相似性，或可以進一步解釋交叉反應(yīng)的發(fā)生。Abramovitch[26]通過免疫印跡與ELISA發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)海梭子蟹與斑節(jié)對蝦的TM有交叉反應(yīng)性。周瑾茹[45]研究表明21種蝦、蟹的TM同源性均大于80%，具有潛在交叉反應(yīng)性。

與甲殼類動物TM相比，軟體動物之間的TM同源性相對較低。Leung對TM進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，TM主要分為兩大類：節(jié)肢動物TM與軟體動物TM。這兩類平均同源性分別為91.7%和77.2%。與甲殼類動物TM相比，軟體動物TM的同源性低很多（56%~68%），表明軟體動物TM更加多樣化，致敏能力或有不同。TM不是唯一引起甲殼類動物與軟體動物免疫交叉反應(yīng)的致敏原[61]。已知甲殼類動物TM的97個IgE表位中，軟體動物TM中含有26個，其中雙殼綱動物TM共有表位更少，特異性更強[52]。因此，甲殼類動物與軟體動物TM之間的交叉反應(yīng)還不是很明確。

2.2.2 水產(chǎn)品TM與其他TM的免疫交叉反應(yīng)TM也是一種吸入性致敏原，在蟑螂、塵螨等昆蟲中存在。除了在水產(chǎn)品間存在外，蟑螂、塵螨與甲殼類動物、軟體動物之間也存在一定的TM交叉反應(yīng)。蟑螂、塵螨與甲殼類動物同屬于節(jié)肢動物，更易發(fā)生交叉反應(yīng)[62]。蟑螂和螨蟲TM與蝦TM同源性可達(dá)80%以上，其IgE表位相似度高于軟體動物TM，所以蝦過敏患者對蟑螂和螨蟲的交叉反應(yīng)風(fēng)險更高[12]。Der p 10并不是屋塵螨主要致敏原，但螨蝦過敏綜合征（Mite Shrimp Allergy Syndrome，MSAS）已被證實[63]。TM交叉反應(yīng)還具有地域性及氣候性差異，中國農(nóng)村蝦致敏性高于城市，而蟑螂和灰塵較多有誘發(fā)蝦過敏的可能[64]。也有研究表明塵螨與蝦TM陽性反應(yīng)率低，交叉反應(yīng)可能由其他致敏原引起[65]。

可食用昆蟲與甲殼類動物的TM之間也存在交叉反應(yīng)，甲殼類動物過敏患者食用粉蟲具有過敏風(fēng)險。在一項雙盲食物激發(fā)實驗中，15名蝦過敏患者中有13人對粉蟲產(chǎn)生過敏反應(yīng)，主要致敏原是原肌球蛋白和（或）精氨酸激酶[66]。Jeong等[67]發(fā)現(xiàn)重組家蠶TM與其他可致敏TM同源性為78.5%~81.0%，ImmunoCAP結(jié)果顯示對家蠶TM呈陽性的8份血清中有6份對蝦、螃蟹TM也呈陽性，證明家蠶TM與甲殼類動物TM具有潛在交叉反應(yīng)。

雞、豬、兔、人的TM與刀額新對蝦TM的同源性在53%~57%[61]。呂良濤[51]的研究表明菲律賓蛤仔和豬的TM同源性為50.35%，氨基酸序列差異較大，預(yù)測基本無交叉反應(yīng)。

3 原肌球蛋白致敏性及其消減的研究

3.1 原肌球蛋白致敏性評價

致敏原的致敏性評價主要有生物信息學(xué)方法、血清學(xué)方法、模擬胃腸液消化實驗、細(xì)胞學(xué)方法和動物模型實驗[68]。其中細(xì)胞學(xué)方法常見的有KU812和肥大細(xì)胞等細(xì)胞模型；動物模型實驗中常用的動物 有C57BL/6、C3H/HeJ、DBA2、Balb/c等[69]小 鼠 品系以及SD、Wistar和BN[70]大鼠品系。

3.1.1 原肌球蛋白致敏性的體外評價 TM是一種致敏性強的致敏原，血清學(xué)實驗證明了多種TM的致敏性?？谖r咕TM的血清IgE反應(yīng)呈陽性，但其肉中TM含量很低，推測基本不會引發(fā)食物過敏[71]。李智偉[72]檢測了35位蝦過敏患者血清IgE，其中25位患者（71.4%）對TM有反應(yīng)。南極磷蝦作為新型食物來源，免疫印跡結(jié)果證明TM是南極磷蝦中主要致敏原，且與美國龍蝦TM相似。魚類TM中鱈魚和長鰭金槍魚TM可被IgE識別，具有致敏性[58]。

日本沼蝦TM可導(dǎo)致KU812細(xì)胞產(chǎn)生明顯的脫顆粒作用，Balb/c小鼠模型中TM組血液中IgE、IgG1水平明顯升高，證明日本沼蝦TM具有很強的致敏性[73]。張江濤[74]利用重組的牡蠣Cra g 1致敏原建立BN致敏大鼠模型，與對照組相比，致敏組白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等含量上升，血液中IgE、IgG水平和組胺釋放量上升，腸道肥大細(xì)胞產(chǎn)生脫顆?，F(xiàn)象，該動物模型可運用于Cra g 1的致敏性研究。Xu等[75]使用Balb/c小鼠模型與RBL細(xì)胞模型比較了對蝦、蛤蜊和魚類TM致敏性，發(fā)現(xiàn)魚TM致敏性較弱，蝦TM和蛤蜊TM可使小鼠體內(nèi)IgE、IgG1、組胺等顯著升高，RBL細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象明顯，具有強致敏性，同時發(fā)現(xiàn)TM煮沸前后致敏性變化不顯著。

3.1.2 原肌球蛋白胃腸消化穩(wěn)定性 食物中的致敏原經(jīng)胃腸道消化后，其結(jié)構(gòu)與表位會產(chǎn)生變化，致敏性也隨之改變[76]。模擬胃腸液消化實驗對食物致敏原的致敏性評價更準(zhǔn)確。TM性質(zhì)穩(wěn)定，經(jīng)過胃腸消化后依然具有致敏性[77]。

鋸緣青蟹（Scylla serrata）TM在消化60 min后，相對分子質(zhì)量為3.4×104的產(chǎn)物仍具有免疫活性[78]。南美白對蝦與斑節(jié)對蝦TM用模擬胃液處理后僅出現(xiàn)小部分降解，模擬腸液處理4 h后原TM條帶仍存在，免疫印跡結(jié)果表明致敏性雖有下降但未消失，且南美白對蝦TM比斑節(jié)對蝦TM更耐消化[79]。黃天嬌[80]選擇4種烹飪方式對蝦進行處理后，再進行體外消化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)水煮、油炸、紅燒，蝦肉產(chǎn)物免疫活性分別下降86.90%、88.94%和97.39%。牡蠣Cra g 1酸處理后因構(gòu)象改變而使IgE結(jié)合能力下降，對酸處理后的產(chǎn)物進行胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解，胃蛋白酶降低致敏性，胰蛋白酶反而使其致敏性上升，可能是因為降解的TM片段暴露或產(chǎn)生了更多的表位[81]。

3.2 原肌球蛋白致敏性消減研究

開發(fā)低敏食物是改善食物過敏的一個重要方法，因此如何利用食品加工技術(shù)降低致敏性是一個重要問題。食品加工過程中，加工使TM結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化，表位被破壞或者改變，進而影響其致敏性[82]。致敏性消減方法可分為物理法、化學(xué)法、生物法等。使用單一方法對TM的致敏性消減效果有限，多種技術(shù)聯(lián)合使用是致敏性消減的研究趨勢。

3.2.1 物理方法 物理方法是利用熱處理、高壓、超聲、輻照等方法直接破壞TM的結(jié)構(gòu)，進而影響其致敏性。TM是一種耐高溫的蛋白質(zhì)，因此單純通過加熱對于TM致敏性的影響很小。用高靜壓技術(shù)（HPP）處理凡納濱對蝦TM可破壞其一級結(jié)構(gòu)[44]。Ozawa[83]將蝦肉高壓加熱（121℃、20 min），ELISA結(jié)果表明TM的IgE結(jié)合能力下降，連續(xù)同樣條件處理3次后，TM低于檢測閾值，證明高壓加熱是降低蝦TM致敏性的有效辦法。

輻照技術(shù)可以使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)、降解，分子構(gòu)象發(fā)生變化[84]。如劉光明等[85]研究表明小劑量輻射對中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）和三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）TM影響不大，加大劑量（10 kGy）后可部分破壞TM的表位并降低其致敏性。官愛艷等[86]發(fā)現(xiàn)電子束輻照可以降低中華管鞭蝦（Solenocera crassicornis）TM的含量和致敏性，輻照能夠降解TM和改變TM空間構(gòu)象，消減致敏性效果與輻照劑量成正比。

3.2.2 化學(xué)方法 糖基化是蛋白質(zhì)中游離氨基與還原糖之間的反應(yīng)，在致敏性消減中應(yīng)用較廣[87]。蝦TM富含有游離氨基的賴氨酸，因此糖基化能夠破壞其表位，降低致敏性[88]。

Zhang[89]發(fā)現(xiàn)低聚半乳糖、甘露寡糖和麥芽五糖可以降低蝦TM（Exo m 1）致敏性，但是低聚果糖與TM發(fā)生美拉德反應(yīng)后，致敏性反而升高，可能是因為原表位被破壞后產(chǎn)生了新致敏原。楊煌[46]將擬穴青蟹TM與L-阿拉伯糖反應(yīng)，免疫印跡和斑點印跡結(jié)果表明美拉德產(chǎn)物的IgE、IgG結(jié)合能力下降，并且通過樹突狀細(xì)胞（DC）模型發(fā)現(xiàn)美拉德產(chǎn)物抑制CD86表達(dá)水平，影響DC對T細(xì)胞提呈。Masako等[90]將扇貝TM與葡萄糖反應(yīng)（60℃、3 h）后IgE結(jié)合活性降低。藺海鑫等[91]發(fā)現(xiàn)菲律賓蛤仔TM在美拉德反應(yīng)發(fā)生后α-螺旋含量下降71.7%，IgE結(jié)合能力下降76.2%。α-螺旋的穩(wěn)定性與NH—和—CO之間的氫鍵有關(guān)，證明美拉德反應(yīng)會破壞TM的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

3.2.3 酶法 酶法是利用蛋白酶斷裂肽鍵破壞一級結(jié)構(gòu)降低蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量，或者破壞抗原表位和改變空間結(jié)構(gòu)來降低致敏性[92]。董曉穎等[93]使用5種蛋白酶對海白蝦TM進行酶解，間接ELISA結(jié)果表明風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶降低致敏性的效果最好。孫佳益[94]使用5種酶（胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、無花果蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶）作用于南美白對蝦TM，其中無花果蛋白酶可以顯著消減致敏性。高永艷等[95]使用菠蘿蛋白酶單一酶解與酶解復(fù)合超聲方法處理南美白對蝦蝦糜，ELISA結(jié)果表明致敏性分別下降30.70%和33.33%。張弛[96]使用堿性蛋白酶水解后的褐對蝦Pen a 1構(gòu)建小鼠致敏模型，水解TM組與TM組相比，sIgE水平下降40.44%，組胺水平下降5%。賈瑩等[97]使用酶解和超高壓結(jié)合方法處理南美白對蝦TM，ELISA結(jié)果表明致敏性下降95.27%。酶的種類很多，溫度與酶解時間等對酶解效果也有影響，選擇酶時應(yīng)注意是否有合適的酶切位點。

3.2.4 其他方法 基因改良是將定點表位的基因敲除或進行基因突變，根本上改變蛋白質(zhì)的組成和性質(zhì)從而降低甚至消除致敏性。Wai等[98]對蝦TM（Met e 1）進行定點突變，致敏的小鼠血液IgE結(jié)合能力和肥大細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象顯著下降。Liu等[98]將鋸緣青蟹TM 3個關(guān)鍵氨基酸（R 90、E 164、Y 267）用丙氨酸進行替代，突變后的TM與原TM相比與患者血清IgE結(jié)合活性明顯降低。梅雪嬌[100]通過基因定點突變降低擬穴青蟹TM的致敏性，對TM關(guān)鍵氨基酸進行基因定點突變，突變TM與原TM相比，IgE結(jié)合能力下降18.1%。但是該技術(shù)存在一定的風(fēng)險，可能產(chǎn)生新的表位[101]。

反義肽是DNA反義鏈編碼而成的肽段，可與正義肽特異性配對，通過生物信息學(xué)方法篩選與TM特異性結(jié)合的適配體小肽。適配體小肽能與目標(biāo)蛋白質(zhì)強親和力結(jié)合，12個TM的適配體小肽對擬穴青蟹TM和IgG的結(jié)合均有抑制作用[100]。

4 展望

隨著水產(chǎn)品產(chǎn)量和消費量的迅速增加，甲殼類水產(chǎn)品引起的食物過敏現(xiàn)象越來越普遍。原肌球蛋白是甲殼類水生動物中一種重要的致敏原，研究人員對TM的性質(zhì)、表位、交叉反應(yīng)、致敏性及其消減等方向不斷探索，已取得了很多重要進展。TM的結(jié)構(gòu)與基本性質(zhì)已被基本了解，各種生物信息學(xué)軟件分析促進了對TM表位的研究。同時TM表位的研究對探索致敏性與交叉反應(yīng)等至關(guān)重要。但對TM的研究還有很多難題，如在表位方面對其構(gòu)象表位的了解還知之甚少，TM交叉反應(yīng)的機制尚不明確等。生產(chǎn)低致敏甚至脫敏水產(chǎn)品加工食品具有廣闊前景，但目前基本停留在理論研究階段，還需要進一步深入探索。