馬鈴薯晚疫病帶菌種薯產(chǎn)孢與侵染行為觀察

王 卓，金飛躍，曹克強(qiáng)，胡同樂(lè)

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/植物病害流行與綜合防治研究室，河北 保定 071000）

馬鈴薯是世界第四大糧食作物，是重要的飼料和工業(yè)原料［1］，同時(shí)我國(guó)也是世界第一馬鈴薯生產(chǎn)大國(guó)［2］。馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯常見(jiàn)的病害之一，在世界馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，據(jù)統(tǒng)計(jì)，馬鈴薯晚疫病每年在全球引起的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)67 億美元［3］。該病傳播速度極快，從出現(xiàn)病斑到全田枯死只需14 d［4-5］。致病疫霉（Phytophthora infestans）作為該病的病原菌，主要以菌絲體在塊莖中越冬［6］。此外，致病疫霉的卵孢子可以在土壤中長(zhǎng)時(shí)間存活，并可成為初侵染源［7-8］。生產(chǎn)中馬鈴薯晚疫病主要的初侵染源為帶菌種薯、土壤中殘留的病殘?bào)w和卵孢子［9-10］。初侵染的病株發(fā)展成中心病株并產(chǎn)生孢子囊，孢子囊迅速通過(guò)空氣傳播進(jìn)行再侵染［11］，從而導(dǎo)致病害的爆發(fā)。

為了有效防控馬鈴薯晚疫病，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)開(kāi)展了基于氣候條件的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)研究，并在生產(chǎn)上獲得應(yīng)用［12］，但預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性在地區(qū)和年度間都有一些差異。深入了解和明確馬鈴薯晚疫病的初侵染途徑，是已有預(yù)測(cè)模型改良和新模型建立的依據(jù)和基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)外有關(guān)對(duì)馬鈴薯晚疫病初侵染途徑觀察的研究報(bào)道較少，且研究結(jié)果也不相同［13］。De Bary等人種植自然帶菌的種薯后，發(fā)現(xiàn)嫩芽中有菌絲存在，將菌絲分離培養(yǎng)后可以產(chǎn)生孢子囊［14］。Jensen等人觀察到帶菌種薯長(zhǎng)出的嫩芽在中部受到侵染，而非基部，從而推斷是土壤中的病菌孢子囊（或游動(dòng)孢子）侵染了嫩芽［15］。本研究室在近10 年的田間調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)的張家口地區(qū)，該病的初侵染通常發(fā)生在幼苗底部葉片或剛出土不久的幼莖頂端生長(zhǎng)點(diǎn)（該幼莖的其他部位未發(fā)病），從而推測(cè)該病的初侵染的途徑為：帶菌種薯播種后，病菌可在種薯表面產(chǎn)生孢子囊，孢子囊（或游動(dòng)孢子）可隨土壤水分而傳播，在土壤中侵染正在出土的幼莖的頂部，或傳至土壤表面侵染近地面的葉片。

從土壤中檢測(cè)植物病原菌的方法已有報(bào)道［16-17］，土壤中病原菌數(shù)量少，相關(guān)次生微生物生長(zhǎng)迅速以及土壤中休眠體萌發(fā)緩慢，使得疫霉菌檢測(cè)極為困難。本試驗(yàn)采用誘釣法［18-19］，將帶菌種薯分別種植在花盆和田間條件下，觀察并檢測(cè)種薯表面病菌產(chǎn)孢及孢子囊（或游動(dòng)孢子）在土壤中傳播的情況，明確帶菌種薯播種后能否在土壤中產(chǎn)孢、傳播和引起初侵染，為進(jìn)一步深入研究該病害的初侵染及預(yù)測(cè)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試種薯：‘費(fèi)烏瑞它’和‘夏波蒂’，均高感馬鈴薯晚疫病。

供試菌株：為馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)，保存于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害流行與綜合防控研究室，黑麥試管斜面培養(yǎng)基4 ℃保存。

接種病原菌的種薯制備：馬鈴薯晚疫病菌用黑麥培養(yǎng)基在18 ℃下培養(yǎng)7 d 左右，制成濃度為1.0×l05孢子囊/mL 懸浮液，用2 mL 注射器取200 μL 制備好的懸浮液，在播種前一天自非切面注射到薯塊中，得到人工接菌的種薯，備用。

1.2 盆栽試驗(yàn)

盆栽試驗(yàn)共4 個(gè)處理，分別為：接種了病原菌的種薯切塊種植（A），接種了病原菌的種薯整薯種植（B），健康種薯切塊種植（CK1），健康種薯整薯種植（CK2）；品種均為‘費(fèi)烏瑞它’；每個(gè)處理種植5 盆；試驗(yàn)整體重復(fù)4 次。在花盆中放入蛭石，營(yíng)養(yǎng)土1∶1 混合的土壤，將種薯種植在花盆內(nèi)，每盆1 塊種薯塊莖（或切塊），花盆放置在覆蓋薄土層的大托盤(pán)內(nèi)，18 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2 d 扒開(kāi)土壤檢查記錄種薯塊表面產(chǎn)孢與否和產(chǎn)孢位置。

當(dāng)上述盆栽試驗(yàn)中的種薯表面產(chǎn)孢后，進(jìn)行花盆土壤及托盤(pán)土壤的誘釣試驗(yàn)：自上而下澆水至水分飽和狀態(tài)，用3 ～5 mm 厚的薯片作為誘餌，分別置于花盆內(nèi)和花盆下面托盤(pán)中的土壤表面，用培養(yǎng)皿將薯片罩住保濕，12 h 后將薯片取回，置于滅菌培養(yǎng)皿中18 ℃保濕培養(yǎng)，每天檢查薯片發(fā)病情況。試驗(yàn)整體重復(fù)4 次。

1.3 田間小區(qū)試驗(yàn)

田間試驗(yàn)在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)植物保護(hù)學(xué)院試驗(yàn)實(shí)踐園中開(kāi)展，品種均為‘夏波蒂’。土壤高濕處理和正常濕度處理分別設(shè)置在2 個(gè)單獨(dú)的區(qū)域，每個(gè)區(qū)域15 m2，在每個(gè)區(qū)域內(nèi)種植4 行（行距60 cm），分別種植人工接菌種薯切塊、人工接菌種薯整薯、自然帶菌種薯切塊和自然帶菌種薯整薯，每行播種15 穴，穴距為35 cm。

土壤高濕處理是自播種后每2 d 澆水1 次并覆蓋地膜，使土壤相對(duì)濕度保持在60%左右，而土壤正常濕度處理是在播種后不澆水、不覆膜，土壤相對(duì)濕度保持在20%左右。

播種后逐日調(diào)查并記錄出苗時(shí)問(wèn)(幼苗出土視為出苗)，每3 d 扒開(kāi)土壤，檢查種薯表面產(chǎn)孢以及種薯的萌芽情況(幼芽從芽眼中長(zhǎng)出0.5 cm 視為萌芽)。同時(shí)進(jìn)行土壤中的誘釣試驗(yàn)：出苗前在土壤中種薯的前、后、左、右、上方5 個(gè)方位距離5 cm 處，各放置1 枚厚度為3 ～5 cm 的健康薯片作為誘餌，3 d 更換1 次薯片；薯片誘餌取回后，置于滅菌培養(yǎng)皿中的塑料隔水網(wǎng)格上，18 ℃保濕培養(yǎng)并逐日檢查記錄誘餌上的晚疫病菌生長(zhǎng)情況。

出苗后進(jìn)行地表誘釣試驗(yàn)：使用噴壺模擬降雨量為中雨的人工降雨及雨水飛濺，將新鮮葉片作為誘餌置于植株四周的土壤表面，地膜覆蓋保濕24 h，將誘餌葉片取回后用濕棉球包裹葉柄保濕，放于18 ℃保存，每天記錄葉片的發(fā)病情況。每3 d 誘釣1 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 帶菌種薯在盆栽條件下的產(chǎn)孢情況

盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示，人工接菌種薯切塊種植后的4 ～6 d，切面位置和萌芽基部變褐，切面著生病菌絲并帶有孢子囊，整薯播種后4 d，在注射孔處出現(xiàn)菌絲并產(chǎn)生孢子囊。而健康種薯上并沒(méi)有病菌出現(xiàn)。表明人工接種的整薯和切塊播種后均可在花盆土壤中產(chǎn)孢（見(jiàn)表1）。

表1 盆栽試驗(yàn)中帶菌種薯在土壤中的產(chǎn)孢情況Table 1 Sporulation of the infected seed tubers in pot trail

2.2 病菌在花盆土壤中的傳播

誘釣結(jié)果（表2）顯示，在花盆內(nèi)的土壤表面和花盆下面托盤(pán)中的土壤表面均誘釣成功，說(shuō)明種薯上病菌在土壤中產(chǎn)生的孢子囊能夠在土壤中移動(dòng)并形成侵染；從時(shí)間上來(lái)看，播種后7 ～10 d 首次誘釣成功，播種后6 d 種薯才開(kāi)始萌芽，說(shuō)明在馬鈴薯播種后，病菌產(chǎn)孢的時(shí)間明顯早于出苗。

表2 盆栽試驗(yàn)中帶菌種薯萌芽和在土壤中首次誘釣到致病疫霉的時(shí)間Table 2 Time of potato germinating and the first time of bating for Phytophthora infestans after planting of infected seed tubers in pot trail

2.3 晚疫病菌在田間土壤的產(chǎn)孢

田間試驗(yàn)結(jié)果（表3）顯示，除正常土壤濕度處理的自然帶菌種薯切塊種植比整薯種植的產(chǎn)孢塊數(shù)低之外，其他處理的切塊種植的產(chǎn)孢數(shù)均比整薯種植的產(chǎn)孢塊數(shù)高，說(shuō)明切塊種植有利于帶菌種薯的產(chǎn)孢。然而，無(wú)論是種薯切塊與否以及士壤濕度高低，帶菌種薯在播種后的產(chǎn)孢時(shí)間都沒(méi)有明顯差別均為4 ～9 d。

田間觀測(cè)結(jié)果顯示，人工接種薯塊的切面變褐，出現(xiàn)晚疫病菌菌絲并著生孢子囊。自然帶菌薯塊芽眼處薯肉變褐，出現(xiàn)晚疫病菌菌絲并著生孢子囊。說(shuō)明人工接種和自然帶菌的種薯在田間播種后，均可在土壤中產(chǎn)孢。

表3 田間種植條件下帶菌種薯在土壤中的產(chǎn)孢情況Table 3 Sporulation of infected seed tubers planted under field conditions

2.4 病菌在田間土壤中的傳播

田間環(huán)境下，在土壤中種薯周?chē)恼T釣結(jié)果（見(jiàn)表4）顯示，土壤高濕度處理中均誘釣成功，說(shuō)明種薯上的病菌在土壤中產(chǎn)生的孢子囊能夠在土壤中移動(dòng)并進(jìn)行侵染。初次誘釣成功時(shí)間均早于種薯萌芽和出苗的時(shí)間。正常土壤濕度處理組，帶菌種薯上有孢子囊產(chǎn)生，但并未誘釣成功，說(shuō)明孢子囊在土壤中移動(dòng)和侵染需要較高的濕度。

表4 田間種植條件下帶菌種薯出苗和在土壤中首次誘釣到致病疫霉的時(shí)間Table 4 Time of potato germinating and the first bating time for P. infestans after planting of infected seed tubers in field conditions

3 討論與結(jié)論

林國(guó)光等［20］研究發(fā)現(xiàn)，在無(wú)人干擾的情況下，孢子囊本身是向斜下方移動(dòng)，土壤下層的病原菌不能向上移動(dòng)，而中耕等農(nóng)事操作可以將孢子囊翻至地表進(jìn)行侵染。本研究在盆栽試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不需要中耕操作，病菌孢子囊可以向上擴(kuò)散并侵染土壤表面的誘餌。通過(guò)多年的田間觀察發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)中耕操作但易積水的低洼地塊較易出現(xiàn)中心病株的現(xiàn)象，推斷土壤中的病菌孢子囊（或游動(dòng)孢子）在田塊出現(xiàn)積水的情況下可擴(kuò)散到到達(dá)土壤表面，侵染接觸地面的葉片或被雨水飛濺帶到下部葉片引起侵染。

目前，已經(jīng)報(bào)道的馬鈴薯晚疫病初侵染途徑的主要是：種薯上的病菌進(jìn)入萌發(fā)的幼芽并隨幼苗向上生長(zhǎng)，幼苗與病菌長(zhǎng)期共存最終形成中心病株［21］。本研究的觀察表明，帶菌種薯在土壤中的產(chǎn)孢時(shí)間早于出苗時(shí)間，因此從時(shí)間上看，播種后帶菌種薯表面產(chǎn)生孢子囊（或游動(dòng)孢子）在土壤中傳播要比病菌菌絲進(jìn)入萌芽的幼莖早；從發(fā)生機(jī)率來(lái)說(shuō)，本實(shí)驗(yàn)室10 余年的田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)初侵染植株（中心病株）多為底部葉片先發(fā)病，少數(shù)為剛出土的幼莖頂部發(fā)病，也有更為少數(shù)的植株莖部距離地面一定高度的部位發(fā)生莖部初侵染，但總的比例來(lái)看前2 種情況均為孢子囊（或游動(dòng)孢子）經(jīng)土壤傳播侵染所致，比例要高于后者（菌絲進(jìn)入幼莖所致），且前兩者出現(xiàn)的時(shí)間更早。綜合對(duì)比上述不同初侵染途徑的發(fā)生時(shí)間和發(fā)生機(jī)率來(lái)看，帶菌種薯播種后在土壤中產(chǎn)孢隨后在土壤中傳播，導(dǎo)致近地面葉片和正在出土的幼莖頂部侵染這一途徑可能更早，也更普遍、更重要。

在田間條件下，自然帶菌種薯播種后可在種薯表面產(chǎn)孢，開(kāi)始產(chǎn)孢的時(shí)間早于種薯萌芽和出苗的時(shí)間；帶菌種薯上產(chǎn)生的孢子囊（或游動(dòng)孢子）可在土壤中擴(kuò)散并保持侵染能力，能侵染近地面葉片或正在出土的幼莖頂部嫩葉形成初侵染。