氮源對甲烷氧化混合菌群甲烷氧化和氧化亞氮排放的影響

范玉婧，姚惠嬌，高志嶺，劉春敬，謝建治，劉臻岳，武新宇

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/河北省農(nóng)田生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000；2. 河北省畜牧總站，河北 石家莊 050000）

近年來，我國集約化畜禽養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，因此也帶來一系列的水污染和大氣污染問題［1］，其中溫室氣體甲烷排放是其中之一。Wolf 等用修正的模型估算了全球畜禽養(yǎng)殖CH4排放量，為119.1±18.2 Tg［2］。我國京津冀地區(qū)2017 年養(yǎng)殖業(yè)CH4排放量占人為源排放量的20%［3］。因此，重點(diǎn)開展畜禽養(yǎng)殖業(yè)CH4廢氣排放控制研究，對于我國實(shí)現(xiàn)“碳達(dá)峰”“碳中和”目標(biāo)要求，促進(jìn)畜禽養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展具有重要意義。

基于甲烷氧化菌氧化轉(zhuǎn)化甲烷是大氣中CH4排放控制的重要途徑，由于好氧甲烷氧化菌具有生長速率快、容易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，其被廣泛應(yīng)用到乏風(fēng)瓦斯［4］、垃圾填埋場［5］、畜禽養(yǎng)殖［6］、污水處理［7］等場所的甲烷控制技術(shù)研究中。氮源是影響好氧甲烷氧化菌甲烷氧化效率的一個關(guān)鍵因素，首先，氮源缺乏會抑制甲烷氧化菌生長，進(jìn)而降低CH4氧化效率［8］。此外，甲烷氧化菌的甲烷氧化酶和氨氧化菌的氨氧化酶較為相似，兩者可能存在底物競爭關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，NH4+作為營養(yǎng)元素對生物除CH4過程的啟動具有促進(jìn)作用，然而，當(dāng)NH4+濃度從0.1 g/L增加到0.5 g/L 時，生物法除CH4氧化效率由70%下降至13%［9］。Nikiema［10］等發(fā)現(xiàn)，NaNO3質(zhì)量濃度從0.14 g/L 增加到0.75 g/L 時，生物過濾器的甲烷去除負(fù)荷增加了5 倍，而當(dāng)濃度繼續(xù)增加時，則會對甲烷去除產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)。此外，NO2-也會對甲烷氧化菌氧化甲烷產(chǎn)生抑制作用［11］。上述研究重點(diǎn)關(guān)注了氮源種類和濃度對甲烷去除效率的影響，忽略了氮源供給會引起另一溫室氣體N2O 排放的潛在風(fēng)險。氮源供給使得處理甲烷生物反應(yīng)器中會發(fā)生由硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌參與的氮轉(zhuǎn)化過程，而硝化［12］、反硝化［13］、甲烷氧化［14］、硝化細(xì)菌反硝化［15］等都是N2O 的潛在生成途徑，目前關(guān)于氮源對甲烷氧化過程N(yùn)2O 排放及生成途徑的研究較少，尚需開展進(jìn)一步研究。Webster［16］采用乙炔抑制法研究了硝化過程的N2O 生成途徑，這為研究甲烷氧化過程的N2O 產(chǎn)生途徑提供了研究思路。因此，本研究開展了不同氮源種類和氮源濃度對甲烷氧化混合菌群的甲烷氧化效率和N2O 生成規(guī)律的影響研究，并采用乙炔抑制法進(jìn)一步探索了甲烷氧化過程中N2O 的生成途徑，結(jié)果可為甲烷氧化菌在畜禽養(yǎng)殖業(yè)溫室氣體減排領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

甲烷氧化混合菌群富集培養(yǎng)所需土壤樣品取自保定市垃圾衛(wèi)生填埋場礦化垃圾。取土?xí)r，首先除去覆蓋層表層1 cm 左右的覆蓋土，再取上層20 cm的覆蓋土，置于無菌袋中密封運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。土壤樣品除去草根等雜物并過2 mm 篩后于-20 ℃冰箱冷凍備用［17］。

1.2 NMS 培養(yǎng)基

甲烷氧化混合菌群的富集培養(yǎng)采用甲烷氧化菌通用硝酸鹽無機(jī)培養(yǎng)基（NMS 培養(yǎng)基）［18］，配制好后置于滅菌鍋中121 ℃滅菌30 min 備用。

1.3 甲烷氧化混合菌群的富集培養(yǎng)

首先，稱取5 g 土壤樣品置于裝有50 mL NMS培養(yǎng)基的250 mL 血清瓶中，瓶口用異丁基膠塞密封，用無菌注射器注入2 mL 10%甲烷氣體，使甲烷濃度維持在350 ～400 mg/m3，置于30 ℃ 150 r/min搖床中恒溫培養(yǎng)，每隔24 h 采集血清瓶頂空氣體，用氣相色譜法測定血清瓶頂空的CH4和N2O 濃度，為消除培養(yǎng)基對甲烷吸收的影響，試驗(yàn)同時設(shè)置不加菌液的空白對照。富集培養(yǎng)過程每7 d 為1 個周期，按10%（v/v）比例將富集培養(yǎng)液接種到新鮮培養(yǎng)基，待甲烷去除效率不再增長且保持穩(wěn)定后，即標(biāo)志著甲烷氧化混合菌群富集培養(yǎng)完成。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

氮源對甲烷氧化混合菌群甲烷氧化和氧化亞氮排放影響試驗(yàn)采用完全試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)因素分別為氮源種類和氮源濃度，氮源種類分別為NH4Cl、KNO3、NaNO2，氮源濃度分別設(shè)置低（10 mg/L）、中（30 mg/L）、高（50 mg/L）3 個水平梯度，并設(shè)置加菌不加氮源的空白對照（0 mg/L），共計(jì)10個處理，3 次重復(fù)。試驗(yàn)過程同甲烷氧化菌的富集培養(yǎng)，按10%接種比例將富集培養(yǎng)好的甲烷氧化混合菌群接種到裝有50 mL NMS 培養(yǎng)基的血清瓶（250 mL）中，于30 ℃，150 r/min 搖床培養(yǎng)每隔24 h 后測定CH4和N2O 濃度。

甲烷氧化混合菌群的N2O 產(chǎn)生途徑試驗(yàn)主要通過改變頂空氣體組分實(shí)現(xiàn)，共設(shè)置5 個處理，如表1所示，3次重復(fù)，試驗(yàn)過程同甲烷氧化菌富集培養(yǎng)過程，按10%接種比例將富集培養(yǎng)好的甲烷氧化混合菌群接種到裝有50 mL NMS 培養(yǎng)基的血清瓶（250 mL）中，置于30 ℃，150 r/min 搖床培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)的1、3、5、7、8 d 測定頂空N2O 和CH4濃度。

1.5 不同生成途徑N2O 貢獻(xiàn)的計(jì)算方法

硝化作用（Ni）=（處理3-處理4）-（處理1-處理5），反硝化作用（De）=處理2-處理4，非生物作用（CO）=處理4，甲烷氧化菌羥胺氧化（Me）=處理1-處理5，硝化細(xì)菌反硝化作用（ND）=處理1-Ni-De-CO-Me 。

1.6 測試指標(biāo)及方法

本研究測試指標(biāo)主要為血清瓶頂空CH4和N2O濃度，測定方法［19］：氣相色譜為Agilent 6820，檢測器分別為火焰離子化檢測器（FID）和電子捕獲檢測器（ECD），檢測溫度分別為250 ℃和330 ℃，2 種氣體的測定均采用高純氮?dú)猓?9.999%）作載氣，載氣流量為30 mL/min，色譜柱均為Porapak Q，規(guī)格分別是60/80 目和80/100 目。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲烷氧化混合菌群的富集培養(yǎng)和氣體排放規(guī)律

2.1.1 甲烷氧化混合菌群的富集培養(yǎng) 以垃圾填埋場覆土為菌源，進(jìn)行了以7 d 為1 個周期，為期49 d的甲烷氧化混合菌群的富集培養(yǎng)。由圖1 可以看出，隨著富集培養(yǎng)過程的進(jìn)行，富集培養(yǎng)物的甲烷氧化能力逐漸提高。富集培養(yǎng)物在第7 d 的甲烷氧化效率為60%，到第42 d 提高到接近100%，隨后甲烷氧化效率基本保持穩(wěn)定，這標(biāo)志著甲烷氧化富集培養(yǎng)過程的完成，后續(xù)的氮源影響試驗(yàn)和N2O 生成途徑試驗(yàn)均采用該富集培養(yǎng)物開展。

2.1.2 甲烷氧化混合菌群的甲烷氧化和N2O 排放特征 以富集培養(yǎng)7 個周期的甲烷氧化混合菌群為供試對象，測定分析甲烷氧化混合菌群在12 d 中的CH4和N2O 濃度變化規(guī)律。由圖2 可見，甲烷氧化過程中伴有N2O 的產(chǎn)生，在一個培養(yǎng)周期內(nèi)，血清瓶頂空的CH4濃度逐漸降低，由最初的349.3 mg/m3降低至6.6 mg/m3，但同時氣相頂空中的N2O 逐漸升高，由0.7 mg/m3升高至5.9 mg/m3，相關(guān)性分析結(jié)果表明：甲烷消耗量和氧化亞氮生成量呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.556 8。

圖2 甲烷氧化混合菌群培養(yǎng)過程的CH4 氧化效率和N2O 排放Fig.2 CH4 oxidation and N2O emissions during the cultivation process of the mixed methane oxidation bacteria

2.2 氮源對甲烷氧化混合菌群甲烷氧化和N2O 排放的影響

2.2.1 氮源類型對甲烷氧化混合菌群甲烷氧化和N2O 排放的影響

（1）甲烷氧化 氮源類型對甲烷氧化混合菌群甲烷氧化效率的影響如圖3 所示。當(dāng)?shù)礉舛葹?0 mg/L 時， 分別以NH4+-N、NO3--N 和NO2--N 為氮源，甲烷氧化混合菌群的甲烷氧化效率均在90.0%左右，無明顯差異（圖3a）。當(dāng)液相氮源濃度為30 mg/L 時，以NO3--N 為氮源時甲烷氧化效率最高，可達(dá)90.0%，NH4+-N 為氮源的甲烷氧化效率次之，為86.3%，NO2--N 為氮源的甲烷氧化效率最低為77.9%（圖3b）。液相氮源濃度為50 mg/L 時，同樣是以NO3--N 為氮源的甲烷氧化效率最高可達(dá)90.1%，但以NH4+-N 為氮源的甲烷氧化效率最低為78.9%（圖3c）。綜上可知，從保證較高的甲烷氧化效率的角度考慮，NO3--N 適宜作為甲烷氧化混合菌群培養(yǎng)的氮源。

（2）N2O 排放 由圖4 可知，氮源類型對甲烷氧化混合菌群培養(yǎng)過程N(yùn)2O 的排放有明顯的影響，尤其是在中、高濃度氮源供給時，以NH4+-N 作為氮源時的N2O 的排放量最高，為5.1 ～17.8 mg/m3，以N 為氮源的N2O 排放量次之，范圍在2.1 ～3.3 mg/m3，氮源為N 時的N2O 排放量最低約為1.0 mg/m3左右。因此，從N2O 排放的角度考慮，以-N 為氮源較為適宜。

圖3 氮源類型對甲烷氧化混合菌群CH4 氧化效率的影響（a. 10 mg/L；b. 30 mg/L；c. 50 mg/L）Fig.3 The effects of nitrogen source type on CH4 oxidation efficiency of the mixed methane oxidation bacteria(a. 10 mg/L；b. 30 mg/L；c. 50 mg/L)

2.2.2 氮源濃度對甲烷氧化混合菌群甲烷氧化和N2O 排放的影響

（1）甲烷氧化 圖5 為氮源濃度對甲烷氧化混合菌群甲烷氧化效率的影響，當(dāng)以NH4+-N 為氮源時，高濃度NH4+-N 會降低CH4氧化效率，濃度為10 mg/L 時甲烷氧化效率最高，為92.0%，而N 濃度為50 mg/L 時甲烷氧化效率僅為78.9%（圖5a）。當(dāng)以NO3--N 為氮源時，氮源濃度對甲烷氧化效率影響不大均處于90.0%左右（圖5b）。當(dāng)以-N 為氮源時，NO2--N 濃度為10 mg/L 時甲烷氧化效率最高，為93.0%，30 mg/L 和50 mg/L時甲烷氧化效率均處于90.0%以下（圖5（b））。綜上可得，從保證較高甲烷氧化效率的角度考慮，不論是選用NH4+-N、NO3--N、還是NO2--N，以10 mg/L 的氮源濃度較為適宜。

圖4 氮源類型對甲烷氧化混合菌群培養(yǎng)過程N(yùn)2O 排放的影響（a. 10 mg/L；b. 30 mg/L；c. 50 mg/L）Fig.4 The effects of nitrogen source type on N2O emissions of the mixed methane oxidation bacteria（a. 10 mg/L；b. 30 mg/L；c. 50 mg/L）

圖5 氮源濃度對甲烷氧化混合菌群CH4 氧化效率的影響（a. NH4+-N；b. NO3--N；c. NO2--N）Fig.5 The effects of nitrogen source concentration on CH4 oxidation efficiency of the mixed methane oxidation bacteria (a. NH4+-N; b. NO3--N; c. NO2--N)

基于以上試驗(yàn)結(jié)果可知，以低濃度NO3--N 為氮源培養(yǎng)甲烷氧化混合菌群，不僅具有較高的甲烷氧化效率，且生成的氧化亞氮濃度較低，因此，宜采用低濃度的NO3--N 作為氮源，但培養(yǎng)過程仍有少量N2O 生成。

圖6 氮源濃度對甲烷氧化混合菌群培養(yǎng)過程N(yùn)2O 排放的影響（a. NH4+-N；b. NO3--N；c. NO2--N）Fig.6 The effects of nitrogen source concentration on N2O emissions of the mixed methane oxidation bacteria(a. NH4+-N; b. NO3--N; c. NO2--N)

2.3 甲烷氧化混合菌群氧化甲烷過程的N2O 生成途徑變化規(guī)律

如圖7 所示，在甲烷氧化混合菌群培養(yǎng)過程的第1 天，培養(yǎng)體系中的N2O 主要是非生物作用產(chǎn)生的，其貢獻(xiàn)約占79%，其次為甲烷氧化菌羥胺化作用，約占15%；隨著甲烷氧化過程的進(jìn)行，硝化細(xì)菌反硝化作用的貢獻(xiàn)逐漸增大，從培養(yǎng)第1 天的6%增加到第5 天的61%。而非生物作用隨著培養(yǎng)過程的進(jìn)行，則逐漸降低，到第8 天其貢獻(xiàn)下降至22%。整個培養(yǎng)過程甲烷氧化菌羥胺氧化作用的貢獻(xiàn)一直穩(wěn)定在15%～28%，而硝化作用和反硝化作用對甲烷氧化混合菌群的氧化亞氮排放貢獻(xiàn)較低?；谝陨涎芯拷Y(jié)果可以推斷，甲烷氧化混合菌群氧化甲烷過程的氧化亞氮主要來源是硝化細(xì)菌反硝化作用。

圖7 甲烷氧化混合菌群甲烷氧化過程N(yùn)2O 生成途徑變化規(guī)律Fig.7 The variation of N2O production pathways of the mixed methane oxidation bacteria during methane oxidation process

3 討論

3.1 氮源類型對甲烷氧化混合菌群的影響

氮源類型對甲烷氧化混合菌群氧化甲烷具有明顯影響，以NO3--N 為氮源時，甲烷氧化混合菌群的甲烷氧化效率最高，而高濃度的含銨態(tài)氮的無機(jī)鹽對菌體甲烷代謝具有抑制作用。魏文平等［20］也得出相同的結(jié)論，原因是NH4+作為甲烷的結(jié)構(gòu)類似物，會與甲烷競爭性地結(jié)合MMO 酶的甲烷結(jié)合活性位點(diǎn)，起到抑制CH4氧化的作用［21］。此外，氮源類型對甲烷氧化混合菌群N2O 排放有明顯影響，以NH4+-N 為主要氮源時，N2O 的排放量最高，何志龍等也在試驗(yàn)中得出NH4+-N 濃度越高，N2O 排放越多的結(jié)論，以NO3--N 為氮源的N2O 的排放均明顯低于以NH4+-N 和NO2--N 為氮源［22］。

3.2 氮源濃度對甲烷氧化混合菌群的影響

在本實(shí)驗(yàn)中，以NH4+-N 為氮源時，高濃度的 NH4+-N 對甲烷氧化產(chǎn)生抑制作用。而以NO3--N 為氮源時，氮源濃度對甲烷氧化效率的影響不大，甲烷氧化效率均處于90.0%左右。Dam 等［23］同樣發(fā)現(xiàn)甲烷氧化菌Methylocustissp strain SC2的甲烷氧化效率隨著NH4+-N 濃度提高而下降。Willison［24］等在草地試驗(yàn)中也證明了上述結(jié)論，草地在長期施用(NH4)2SO4可完全抑制CH4氧化，然而長期施用等量NaNO3并未導(dǎo)致CH4氧化能力下降，表明NO3--N 對甲烷氧化無抑制作用。

高濃度NH4+-N 對N2O 排放有促進(jìn)作用。而氮源為NO3--N 時，濃度變化對N2O 排放量無明顯影響。N 為氮源時，濃度升高對N2O 的排放有抑制作用，Law 等［25］同樣發(fā)現(xiàn)，亞硝化系統(tǒng)中極高濃度的亞硝酸鹽會降低N2O 的產(chǎn)生速率，Peng 等［26］研究卻認(rèn)為N2O 的產(chǎn)生速率和釋放因子隨亞硝酸鹽濃度的增大而增大。高濃度NO2--N 導(dǎo)致N2O 積累顯著差異的原因可能是由于不同脫氮系統(tǒng)內(nèi)部微生物種類的不同［27］。

3.3 甲烷氧化過程的N2O 產(chǎn)生途徑

甲烷氧化混合菌群在氧化甲烷過程會伴有N2O的產(chǎn)生，其濃度與培養(yǎng)體系中的氮源類型和氮源濃度有關(guān)。由于CH4的氣體全球變暖潛能值（GWP）為25，而N2O 的GWP 值高達(dá)298［28］，這使得甲烷氧化過程的溫室氣體減排效應(yīng)大大降低。甲烷氧化混合菌群氧化甲烷過程中產(chǎn)生的N2O，在培養(yǎng)初期以非生物作用貢獻(xiàn)最多。隨著氧化過程的進(jìn)行，非生物作用貢獻(xiàn)逐漸降低，而硝化細(xì)菌反硝化作用對N2O 的貢獻(xiàn)則不斷增加。原因是培養(yǎng)過程中甲烷氧化混合菌群氧化甲烷消耗了大量氧氣，低氧的環(huán)境更適合硝化細(xì)菌反硝化作用［29］。Kool 等［30］在試驗(yàn)中得出相同結(jié)論，硝化細(xì)菌反硝化作用占純培養(yǎng)物中N2O 排放量的30%～66%。

4 結(jié)論

以甲烷氧化混合菌群為供試對象，開展了不同氮源類型和氮源濃度對其甲烷氧化混合菌群甲烷氧化能力和N2O 排放的影響，并采用乙炔抑制試驗(yàn)，研究了甲烷氧化混合菌群培養(yǎng)過程的N2O 生成途徑，主要結(jié)論如下：

（1）甲烷氧化混合菌群的甲烷氧化過程會伴有N2O 的生成，培養(yǎng)體系的CH4濃度與N2O 濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

（2）氮源類型和濃度對甲烷氧化混合菌群的甲烷氧化效率和N2O 生成有顯著影響，以NO3--N 為氮源的甲烷氧化能力最高，且N2O 排放低。高濃度的N 對甲烷氧化有抑制作用，且會導(dǎo)致高濃度的N2O 生成。

（3）甲烷氧化混合菌群氧化甲烷過程的N2O，主要產(chǎn)生途徑為硝化細(xì)菌反硝化作用。