N. europaea/Nc. mobilis譜系在垃圾滲濾液處理中的脫氨貢獻

熊 英,向 斯,程 凱

./.譜系在垃圾滲濾液處理中的脫氨貢獻

熊 英1,2,向 斯1,2,程 凱1*

(1.湖北工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院,河湖生態(tài)修復(fù)與藻類利用湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430068；2.武漢凱諾金環(huán)境生物科技有限公司,湖北 武漢 430068)

為了解垃圾滲濾液處理系統(tǒng)中菌群結(jié)構(gòu)與脫氨效果的關(guān)系,采用16S rRNA基因高通量測序技術(shù)分析了15個實際垃圾滲濾液處理系統(tǒng)中的自養(yǎng)氨氧化細(xì)菌(AOB)的群落結(jié)構(gòu),監(jiān)測了其中1個處理系統(tǒng)中的AOB群落結(jié)構(gòu)的周年變化,并采集實際垃圾滲濾液開展了為期45d的模擬試驗.結(jié)果表明,屬是垃圾滲濾液處理系統(tǒng)中的優(yōu)勢自養(yǎng)氨氧化細(xì)菌,其相對豐度與脫氨活性呈顯著正相關(guān)(<0.05).在此菌屬中,和的相對豐度與脫氨活性顯著正相關(guān)(<0.05),這3種菌在系統(tǒng)發(fā)育上同屬于/譜系,說明該譜系是實際垃圾滲瀝液處理系統(tǒng)中的優(yōu)勢AOB類群,并對垃圾滲濾液脫氨有重要貢獻.

垃圾滲濾液；氨氧化；二代測序；生物多樣性

生物法是現(xiàn)階段國內(nèi)外污水處理技術(shù)的核心,而微生物的氨氧化是其中的重要組成部分[1],具有氨氧化功能的微生物主要包括自養(yǎng)氨氧化細(xì)菌(AOB)[2]、異養(yǎng)氨氧化細(xì)菌[3]、厭氧氨氧化細(xì)菌[4]和氨氧化古菌[5-6]等,其中,AOB是眾多實際污水處理系統(tǒng)中氨氧化的主要菌群[2,7].根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和胞質(zhì)內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的不同可將AOB分為亞硝化單胞菌屬()、亞硝化螺菌屬()、亞硝化球菌屬()、亞硝化葉菌屬()和亞硝化弧菌屬()等5個屬[7].在現(xiàn)有的污水處理系統(tǒng)中,屬和屬是最為常見的2個屬[2,8],其中又以屬對氨氧化的貢獻最大[2,9].如Wagner等[10]認(rèn)為(該菌在系統(tǒng)發(fā)育上屬于屬)是高氨氮污水處理系統(tǒng)中AOB的優(yōu)勢菌;Mobarry等[11]發(fā)現(xiàn)在活性污泥和生物膜樣品中,屬是AOB中的優(yōu)勢菌屬;Purkhold等[8]也發(fā)現(xiàn)市政和印染廢水中AOB的優(yōu)勢屬也是屬.

垃圾滲濾液成分復(fù)雜、水質(zhì)水量變化大,含有高濃度的氨氮、難降解有機物和重金屬.以往對于垃圾滲濾液處理系統(tǒng)中氨氧化菌群結(jié)構(gòu)的研究主要集中在解析不同處理工藝、滲濾液的成分、溫度、溶解氧和光照等的影響,如Xiong等[12]通過在實驗室內(nèi)模擬的移動床生物膜反應(yīng)器(MBBR)中,接種市政污水處理廠中的活性污泥處理成熟垃圾滲濾液,發(fā)現(xiàn)的相對豐度與脫氨活性有一定的關(guān)系;Isaka等[13]在實驗室氣升式反應(yīng)器中,通過固定化微生物處理垃圾滲濾液,發(fā)現(xiàn)在低溫環(huán)境(10℃)下,屬是垃圾滲濾液氨氧化階段的主要微生物;Chen等[1]在實驗室采用缺氧-好氧-好氧-缺氧AOOA工藝處理實際垃圾滲濾液,將反應(yīng)器中的溶解氧長期控制在低水平(0.1mg/L)時,發(fā)現(xiàn)主要由屬積累亞硝酸鹽;孫洪偉等[14]在實驗室內(nèi)采用單級上流式厭氧污泥床-序批式活性污泥法(UASB—SBR)聯(lián)用工藝處理實際垃圾滲濾液,發(fā)現(xiàn)AOB中以屬和屬為主.如上所述,雖然有部分研究認(rèn)為某些AOB菌“屬”在垃圾滲濾液中分布較廣,但對具體AOB菌“種”的分布規(guī)律尚缺乏認(rèn)識,其與脫氨活性的關(guān)系也不清楚,特別是上述研究通常都是對實驗室內(nèi)的模擬垃圾滲濾液處理系統(tǒng)[1,15-17]或少數(shù)幾個實際垃圾滲濾液處理系統(tǒng)[18]研究所得,缺乏較大空間和時間尺度的系統(tǒng)調(diào)查,故難以全面評價具體AOB菌種在實際垃圾滲濾液處理系統(tǒng)中的貢獻.

本文采用16S rRNA基因高通量測序技術(shù),分析了來源于15個實際垃圾滲濾液污水處理系統(tǒng)的AOB菌群結(jié)構(gòu),監(jiān)測了其中1個處理系統(tǒng)中AOB菌群結(jié)構(gòu)的周年變化,并采用實際垃圾滲濾液開展了為期45d的模擬試驗,有助于精細(xì)評價不同AOB菌種在實際垃圾滲濾液處理系統(tǒng)中的貢獻.

1 材料和方法

1.1 不同垃圾滲濾液處理系統(tǒng)的調(diào)查

1.1.1 樣品來源 從湖南會同(S1)、麻陽(S2)、靖州(S3)、通道(S4)、安江(S5)、洪江(S6)、益陽(S7)、懷化(S8)、溆浦(S9)、芷江(S10)、宜章(S11)、郴州(S12)和澧縣(S13),四川大英(S14)和威遠(yuǎn)(S15)等地(圖1)垃圾滲濾液處理站的一級好氧池分別采集了15個泥水混合物樣品.這些垃圾滲濾液處理站均采用非膜法處理工藝,生化系統(tǒng)則主要采用SBR- AOAO工藝,處理量為50～300m3/d,進水氨氮濃度為400～1300mg/L.

圖1 采樣點的分布

1.1.2 脫氨速率的測定 分別取100mL樣品裝入250mL錐形瓶,于31℃,200r/min振蕩培養(yǎng),0和24h時測氨氮濃度并計算脫氨速率[mg/(L×h)],計算公式如下:

式中:C表示24h的氨氮濃度,mg/L;0表示0h的氨氮濃度,mg/L.

1.1.3 AOB菌群結(jié)構(gòu)分析 使用DNA提取試劑盒從采集的15個泥水混合物樣品中提取DNA,使用Qubit? dsDNA HS Assay Kit 檢測DNA濃度.16S rRNA基因序列V3和V4區(qū)的PCR擴增以20～30ng DNA為模板,上/下游引物[19]分別為CCTACGG- RRBGCASCAGKVRVGAAT和GGACTACNVGG- GTWTCTAATCC,反應(yīng)體系為25μL:Takara taq酶(15U/μL) 0.5μL;緩沖液2.5μL;dNTP混合液 (2.5mmol/L) 2μL;模板 20ng;上下游引物各1μL;超純水18μL.反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3min;94℃變性5s; 57℃退火90s;72℃延伸10s;24個循環(huán);72℃最終延伸5min.PCR產(chǎn)物采用基于Illumina平臺的16S rRNA宏基因組測序(蘇州金唯智),最終得到的序列使用VSEARCH(1.9.6)進行序列聚類(序列相似性設(shè)為97%),再用RDP classifier貝葉斯算法對OTU的代表性序列進行物種分類學(xué)統(tǒng)計(分類到屬).進一步,對于能夠分類到屬的結(jié)果,其序列再經(jīng)Blastn比對后,按相似度大于99%的標(biāo)準(zhǔn)分類到種[20].

1.2 湖南芷江某垃圾填埋場的周年監(jiān)測

1.2.1 樣品來源 樣品取自湖南芷江某垃圾滲濾液處理站的一級好氧池,取樣時間為2017年4月～2018年4月,取樣間隔為2個月,分析其AOB菌群結(jié)構(gòu).

1.2.2 脫氨速率的測定 根據(jù)該處理站一級好氧池每日的進水流量、進水氨氮濃度和出水氨氮濃度,計算月平均脫氨速率,計算公式如下:

1.3 模擬垃圾滲濾液處理系統(tǒng)搭建與監(jiān)測

1.3.1 模擬反應(yīng)裝置的搭建與運行 如圖2所示,模擬反應(yīng)裝置主體材質(zhì)為PVC,有效容積為10L.進水流量根據(jù)出水氨氮濃度調(diào)整(進水速度為(5.5± 3.3)L/d,對應(yīng)的水力停留時間為27～111h),溶解氧控制為0.5～2.0mg/L,環(huán)境溫度控制為30℃以促進亞硝化[21],pH值為7.6～8.5;出水經(jīng)沉淀后的活性污泥的回流比為150%～200%.試驗共運行45d,每天監(jiān)測進出水的氨氮和亞硝酸鹽氮濃度、反應(yīng)器內(nèi)溶解氧量和pH值.還采集了第3, 13, 25, 35, 45d的活性污泥樣品,分析其AOB菌群結(jié)構(gòu).

圖2 試驗裝置示意

1.3.2 試驗用水和接種污泥 試驗所用垃圾滲濾液取自湖南芷江垃圾滲濾液處理站的一級好氧池,其基本水質(zhì)如表1所示.所用污泥為好氧池剩余污泥壓濾所得,其含水率為70%,接種至模擬反應(yīng)裝置后的SV30為30%.

表1 垃圾滲濾液的水質(zhì)情況

1.4 檢測與計算方法

氨氮的測定采用納氏試劑比色法,亞硝酸鹽氮的測定采用N-(1-奈基)-乙二胺光度法[22],DO和pH值采用YSI Pro Plus多參數(shù)水質(zhì)測量儀測定.

通過SPSS Statistics 22.0進行相關(guān)分析,用Origin 8.0軟件作圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 垃圾滲濾液處理系統(tǒng)的AOB群落結(jié)構(gòu)

如表2所示,在15個不同垃圾滲濾液處理站的活性污泥中,MLSS的波動范圍為0.30～11.38g/L, AOB占總菌的相對豐度的波動范圍為0.20%～ 28.98%,其中:大多數(shù)自養(yǎng)氨氧化菌屬占AOB的平均比例均低于1%,但科的屬和屬在AOB中的平均占比分別高達87.24%和9.54%,特別是,在其中12個來源的樣本中,屬占AOB的比例超過了90%.進一步的分析還表明,和是屬的主要成員,它們在屬的平均占比分別為26.67%和45.24%.此外,這2種菌在屬中的占比波動范圍較大(0～100%),考慮到這15個污水處理站的生化處理工藝是相似的,推測造成此差異的主要原因是各污水處理站的進水水質(zhì)及具體的運行操控方法[23].

表2 不同采樣點的AOB相對豐度(%)

圖3 不同采樣點的脫氨速率及主要AOB的相對豐度

由圖3可見,脫氨速率的波動范圍為0.5～ 14.3mg/(L×h),平均值為4.7mg/(L×h).進一步的相關(guān)分析表明,脫氨速率不但與AOB占總菌的相對豐度及屬占總菌的相對豐度顯著正相關(guān)(<0.05),也與占總菌的相對豐度顯著正相關(guān)(<0.05),而與屬和占總菌的相對豐度無顯著相關(guān)(分別為0.834和0.829).

2.2 某垃圾填埋場污水處理系統(tǒng)AOB群落結(jié)構(gòu)的周年變化

如表3所示,AOB占總菌的相對豐度波動范圍為0.62%～3.66%,其中大多數(shù)自養(yǎng)氨氧化菌屬占AOB的平均比例均低于1%,但屬在AOB中的平均占比高達82.42%,同時,從9月份開始,屬占AOB的比例均超過了90%.進一步分析還發(fā)現(xiàn),、和是屬的主要成員,其在屬的平均占比分別為30.45%、40.43%和26.47%.

表3 不同月份樣品中的AOB相對豐度(%)

圖4 不同月份的脫氨速率與主要AOB的相對豐度

由圖4可見,脫氨速率的波動范圍為8.1～ 12.4mg/(L×h),平均值為9.6mg/(L×h).進一步的相關(guān)性分析表明,脫氨速率不但與AOB占總菌的相對豐度及屬占總菌的相對豐度顯著正相關(guān)(<0.05),也與占總菌的相對豐度顯著正相關(guān)(<0.05),而與和占總菌的相對豐度無顯著相關(guān)性(分別為0.734和0.852). 此外,這3種菌在屬中的占比波動范圍也較大(0～99.61%),推測其原因除了包括進水水質(zhì)變化和運行操控方法外,還可能受水溫的影響[24].

2.3 模擬垃圾滲濾液處理系統(tǒng)中脫氨活性與AOB群落結(jié)構(gòu)

表4顯示,AOB占總菌比例的波動范圍為0.54%～2.17%,其中:大多數(shù)自養(yǎng)氨氧化菌屬占AOB的平均比例均低于1%,僅屬在AOB中的平均占比高達86.43%.進一步的分析還表明,、和是o屬的主要成員,其在屬的平均占比分別為35.36%、32.41%和29.20%.

表4 反應(yīng)器中AOB相對豐度(%)

由圖5可見,出水亞硝酸鹽氮濃度的波動范圍為0.2～184.2mg/L,平均值為32.7mg/L.進一步的相關(guān)性分析表明,出水亞硝酸鹽氮濃度不但與AOB占總菌的相對豐度及屬占總菌的相對豐度顯著正相關(guān)(<0.05),也與占總菌的相對豐度顯著正相關(guān)(<0.05),而與和占總菌的相對豐度無顯著相關(guān)性(分別為0.129和0.216).

采用高通量測序技術(shù)對15個實際垃圾滲濾液處理系統(tǒng)的系統(tǒng)調(diào)查、湖南芷江某垃圾填埋場的周年監(jiān)測以及模擬垃圾滲濾液處理系統(tǒng)中的AOB菌群結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)屬占AOB的平均比例超過了80%,是AOB中的優(yōu)勢屬.而近年來針對垃圾滲濾液的研究則多基于單個污水處理系統(tǒng)或室內(nèi)模擬處理裝置,如何曉紅等[25]采用變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù),對實驗室內(nèi)模擬的連續(xù)式好氧硝化混合反應(yīng)器(CSTR)中活性污泥進行菌群結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)了屬是AOB中的優(yōu)勢屬;曾薇等[26]采用PCR-DGGE技術(shù)對實驗室內(nèi)模擬的UASB-A/O反應(yīng)器中活性污泥進行菌群結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)屬是AOB中的優(yōu)勢屬;Chen等[1]對實驗室內(nèi)AOOA反應(yīng)器中的活性污泥中進行了分析,也發(fā)現(xiàn)了屬是AOB中的優(yōu)勢屬;王秀杰等[27]采用16S rRNA基因克隆文庫技術(shù)分析了實驗室內(nèi)模擬的膜生物反應(yīng)器(MBR)中的活性污泥的菌群結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)屬占AOB的41.1%;Isaka等[13]采用PCR-DGGE和FISH技術(shù)分析了實驗室內(nèi)氣升式反應(yīng)器中活性污泥的菌群結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)屬占AOB的60%;Kim等[17]通過熒光原位雜交(FISH)技術(shù)分析了實驗室內(nèi)BAF(生物濾池)反應(yīng)器中菌群結(jié)構(gòu),也發(fā)現(xiàn)屬占AOB的60%以上.表5對比了本研究與上述文獻報道的異同:本研究在較大空間尺度和較長時間尺度上證明屬是實際垃圾滲濾液處理系統(tǒng)中AOB的優(yōu)勢屬,且優(yōu)勢度(占比平均超過80%)明顯高于以往基于實驗室模擬系統(tǒng)的研究(占比最高為60%,平均為42%).

圖5 反應(yīng)器中主要AOB的相對豐度與出水亞硝酸鹽氮濃度

本研究還發(fā)現(xiàn),AOB和屬占總菌的相對豐度與脫氨速率(或出水亞硝酸鹽氮濃度)呈顯著正相關(guān)(<0.05).類似的,廖小兵等[30]利用熒光定量PCR技術(shù)對實驗室內(nèi)SBR反應(yīng)器中AOB的含量變化進行分析,發(fā)現(xiàn)AOB的含量與脫氨活性有著顯著正相關(guān)性.通常,污水處理系統(tǒng)中細(xì)菌的數(shù)量為1012～ 1013cells/L[31],而根據(jù)本文測出的AOB豐度(0.2%～ 29.0%)和氨氧化速率[0.46～14.34mg/(L×h)],可推算出本文中單個AOB細(xì)胞的氨氧化能力為2.3× 10-12～ 6.9×10-10mgN/cell/h,這與實際污水處理系統(tǒng)的研究結(jié)果是基本吻合的:Harms等[32]發(fā)現(xiàn)市政污水處理系統(tǒng)中單個AOB細(xì)胞的氨氧化能力范圍為1.1×10-10～ 1.7×10-10mgN/(cell×h),Limpiyakorn等[31]對12個污水處理廠活性污泥的研究發(fā)現(xiàn)單個AOB細(xì)胞的氨氧化能力為不超過6.9×10-10mgN/(cell×h),而Gabarró等[16]也發(fā)現(xiàn)垃圾滲濾液處理系統(tǒng)中單個AOB細(xì)胞的氨氧化能力為1.8×10-11～6.0×10-11mgN/(cell×h).

表5 不同(模擬)垃圾滲濾液處理系統(tǒng)中的AOB群落結(jié)構(gòu)比較

注:“—”表示未測定.

本研究的3個不同試驗中脫氨速率(或出水亞硝酸鹽氮濃度)分別與和占總菌的相對豐度顯著正相關(guān)(<0.05),而這3種菌在系統(tǒng)發(fā)育上同屬于/譜系[7].此前有少量研究表明該譜系在污水中較其它AOB更容易生長[12,33],如Limpiyakorn等[34]在實驗室內(nèi)的模擬高氨污水處理系統(tǒng)中,采用PCR-DGGE技術(shù)發(fā)現(xiàn)譜系是AOB中的優(yōu)勢菌,并發(fā)揮了主要的氨氧化作用;Siripong等[35]調(diào)查了7個不同生活污水處理廠,采用基于16S rRNA和基因的T-RFLP技術(shù)也發(fā)現(xiàn)譜系是低氨污水處理系統(tǒng)中的優(yōu)勢AOB,但該譜系在垃圾滲濾液中對高氨污水脫氨的貢獻尚未見諸報道.本研究結(jié)果說明/譜系對垃圾滲濾液脫氨有重要貢獻,究其原因,可能與該譜系的AOB具有較強的抗逆性有關(guān):如該譜系中的的終端氧化酶具有高度的多樣性,其基因組也編碼有多種重金屬的抗性基因[36],導(dǎo)致其能夠適應(yīng)垃圾滲濾液這種污染成分復(fù)雜的高氨污水.此外,生態(tài)分布較廣的菌種通常具有較強的環(huán)境適應(yīng)性,故其在生物增效(Bioaugmentation)工程中往往具有更好的效果[37].而本研究發(fā)現(xiàn)譜系在垃圾滲濾液中廣泛分布,這為應(yīng)用該譜系的微生物來提高垃圾滲濾液的脫氨效率[38]提供了理論支持.

3 結(jié)論

3.1屬在AOB中的占比平均超過80%,/譜系在屬中的占比平均超過55%,分別是實際垃圾滲瀝液處理系統(tǒng)中AOB的優(yōu)勢屬和優(yōu)勢譜系.

3.2/譜系中的、和的相對豐度與脫氨活性顯著正相關(guān),說明該譜系對垃圾滲瀝液脫氨有重要貢獻.

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The contribution oflineage to the deamination in full-scale landfill leachate treatment systems.

XIONG Ying1,2, XIANG Si1,2, CHENG Kai1*

(1.Hubei Key Laboratory of Ecological Restoration for River-Lakes and Algal Utilization for College of Resources and Environmental Engineering, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China；2.Wuhan Cyano-King Environmental Technology Co.Ltd, Wuhan 430068,China)., 2021,41(6)：2602～2609

In order to study the relationship between the microbial community structure and the deamination effect in landfill leachate treatment systems, 16S rRNA high-throughput sequencing technology was used to analyze the community structure of autotrophic ammonia oxidizing bacteria (AOB) in 15 full-scale landfill leachate treatment systems. Meanwhile, the annual change of the community structure of AOB in one of the treatment systems was monitored. Moreover, a 45-day simulation test using real landfill leachate was carried out to study the deamination activity. The results showed thatwas the dominant AOB genus in landfill leachate treatment systems, and its relative abundance was positively correlated with the deamination activity (<0.05). Within the genus, the relative abundance of,and, which all belongs to thelineage, were positively correlated with deamination activity (<0.05). The results indicated that thelineage was the dominant AOB group in the full-scale landfill leachate treatment systems, and greatly contributed to the deamination in landfill leachate.

landfill leachate；ammonia oxidation；next-generation sequencing；biodiversity

X703.1

A

1000-6923(2021)06-2602-08

熊 英(1994-),女,湖北孝感人,湖北工業(yè)大學(xué)碩士研究生,主要研究方向為氨氧化微生物技術(shù).發(fā)表論文1篇.

2020-10-15

國家科技重大專項(2017ZX07602002)

* 責(zé)任作者, 教授, chengkaicn@163.com