雷氏普羅威登斯菌耐藥性及耐藥基因的單中心研究

石 嬌, 王光西,丁曼琳, 周英順

(1. 西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，四川 瀘州 646000； 2. 成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610500)

普羅威登斯菌屬?gòu)V泛分布于環(huán)境，屬于條件致病菌，常引起腹瀉和腸道外感染，如尿路感染、腦膜炎和敗血癥等[1]。雷氏普羅威登斯菌屬于普羅威登斯菌屬，常在食品加工運(yùn)輸中大量繁殖從而引起食物中毒等[2]。近年來，雷氏普羅威登斯菌導(dǎo)致的感染不斷發(fā)生，多重耐藥菌的檢出率不斷升高，耐碳青霉烯雷氏普羅威登斯菌引起的感染不斷出現(xiàn)[3]，已成為引起醫(yī)院感染的病原菌之一，給臨床疾病診治帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。研究顯示，金屬β-內(nèi)酰胺酶相關(guān)耐藥基因(如blaNDM、blaIMP、blaVIM)是耐碳青霉烯類藥物革蘭陰性菌攜帶的主要耐藥基因[4]。本研究擬通過分析某院雷氏普羅威登斯菌的耐藥性，測(cè)定耐碳青霉烯類菌株全基因組，闡明其遺傳特征，為臨床抗菌藥物治療選擇及醫(yī)院感染防控提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究嚴(yán)格按照病原微生物標(biāo)本采集規(guī)范，收集2017年1月—2019年12月臨床送檢標(biāo)本，排除同一患者相同部位重復(fù)送檢標(biāo)本。

1.2 細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn) 待檢標(biāo)本經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)分純后采用法國(guó)梅里埃全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行菌株鑒定，質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC 27853、大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 70603，均購(gòu)自國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心。同時(shí)采用配套的藥敏分析儀進(jìn)行抗菌藥物敏感性檢測(cè)，藥敏結(jié)果參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1.3 細(xì)菌全基因組測(cè)序 選取碳青霉烯類耐藥菌，使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取其所選取菌株全基因組DNA，提取的DNA送諾禾致源進(jìn)行illumina PE150建庫(kù)和全基因組測(cè)定，獲得序列進(jìn)行質(zhì)控、組裝、注釋，并使用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用WHONER 5.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，計(jì)數(shù)資料采用構(gòu)成比和率表示，采用生物信息軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株來源 某院2017年1月—2019年12月臨床分離鑒定雷氏普羅威登斯菌25株，分布在12個(gè)臨床科室，其中神經(jīng)外科檢出最多(7株，占28.00%)，其次為重癥醫(yī)學(xué)科(5株，占20.00%)，感染科、泌尿外科和燒傷整形科各2株(占8.00%)，肝膽外科、骨外科一區(qū)、康復(fù)醫(yī)學(xué)科、老年醫(yī)學(xué)院科、神經(jīng)內(nèi)科、神經(jīng)外科重癥和消化內(nèi)科各1株(占4.00%)。

25株雷氏普羅威登斯菌標(biāo)本來源包括6類，其中檢出最多的標(biāo)本為尿(13株，52.00%)，其次為傷口分泌物和腦脊液，分別為4株(16.00%)、3株(12.00%)，全血和痰各2株(8.00%)，胸腔積液1株(4.00%)。

2.2 耐藥情況 25株菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(氨芐西林、阿莫西林)均耐藥，耐藥率為100.0%；對(duì)碳青霉烯類(亞胺培南、厄他培南、美洛培南)耐藥率分別為36.00%、40.00%、28.00%。見表1。

表1 25株雷氏普羅威登斯菌對(duì)常見抗菌藥物的藥敏結(jié)果

2.3 耐碳青霉烯雷氏普羅威登斯菌基因組基本特性 對(duì)3株耐碳青霉烯類雷氏普羅威登斯菌進(jìn)行全基因組測(cè)序，結(jié)果顯示A1菌株基因組最大，為4 725 540 bp；A1菌株開放閱讀框數(shù)最多，為4 601個(gè)；A3菌株G+C含量最多，為40.86%；A3菌攜帶的RNAs數(shù)和耐藥基因個(gè)數(shù)最多，分別為83個(gè)和26個(gè)。見表2。

表2 耐碳青霉烯類雷氏普羅威登斯菌基因組基本特性

2.4 耐藥基因攜帶情況 3株耐碳青霉烯類雷氏普羅威登斯菌全基因組測(cè)序，結(jié)果顯示，均攜帶β-內(nèi)酰胺類(blaNDM-1、blaOXA-10和blaTEM-1B)、大環(huán)內(nèi)酯類[mph(A)、mph(E)、msr(E)]、甲氧芐啶(dfrA1)、氨基糖苷類[aadA1、aadA5、aph(3″)-Ib、aph(4)-Ia、acc(6′)-Ib3、aadB]、磺胺類(sul1)和氯霉素類(catB8)6類耐藥基因型，碳青霉烯類耐藥基因型均攜帶blaNDM-1、blaOXA-10。此外A3菌株還攜帶氟喹諾酮類基因型，見表3。

表3 耐碳青霉烯類雷氏普羅威登斯菌耐藥基因篩選結(jié)果

2.5 碳青霉烯類耐藥基因環(huán)境分析

2.5.1blaNDM-1基因環(huán)境分析 3株菌攜帶blaNDM-1耐藥基因型，遺傳結(jié)構(gòu)為IS30-blaNDM-1-bleMBL-trpF-dsbC-orf-groES-groEL-IS91。與參考序列肺炎克雷伯菌質(zhì)粒pC2343-2(序列號(hào)：CPO39824)、大腸埃希菌質(zhì)粒pJ53(序列號(hào)：MN604268)相比較，與pC2343-2相似，在blaNDM-1的上游有插入序列IS30，下游有插入序列IS91。但不同于pJ53，上游為插入序列ISAba125。見圖1。

圖1 耐碳青霉烯類雷氏普羅威登斯菌blaNDM-1基因環(huán)境

2.5.2blaOXA-10基因環(huán)境分析 3株菌均攜帶blaOXA-10，遺傳結(jié)構(gòu)均為：aac(6’)-Ib3-dfrA1-aadA1-blaOXA10-catB8-aadB。與參考序列海氏普羅威登菌質(zhì)粒p99101(序列號(hào)：CPO28385)相比較基因結(jié)構(gòu)高度相似；與普通變形桿菌質(zhì)粒pVsc3(序列號(hào)：CPO34667)相比較，下游基因不同，pVsc3攜帶的是磺胺類耐藥基因型sul1，而3株菌攜帶的是甲氧芐啶耐藥基因型dfrA1和氨基糖苷類耐藥基因型aadA1、aac(6’)-Ib3。見圖2。

圖2 耐碳青霉烯類雷氏普羅威登斯菌blaOXA-10基因環(huán)境

3 討論

首株普羅威登斯菌1904年由Relttger分離， Kauffmam在1951年首次提議命名，1971年第一株耐藥菌株被報(bào)道，而第一株完整的基因測(cè)序則是在2017年被報(bào)道，來源于一株產(chǎn)耐藥基因blaNDM-1的臨床菌株[6-8]。

普羅威登斯菌與變形桿菌和摩根菌種極為類似，不同于其他腸桿菌，雖然臨床少見但普遍存于在環(huán)境中，有潛在致病性，是一類罕見的醫(yī)院獲得性和社區(qū)獲得性感染病原體[1-2]。雷氏普羅威登斯菌可引起尿路感染和菌血癥，也可引起心內(nèi)膜炎、腹腔感染、腦膜炎等[1,9]。近年來，不同地區(qū)相繼報(bào)道雷氏普羅威登斯菌感染，從患者尿標(biāo)本中分離出該菌[10-12]。該菌易存活于尿液中，本研究中雷氏普羅威登斯菌的主要標(biāo)本來源也為尿。此外雷氏普羅威登斯菌感染還可引起腦膜炎，因Tanmoy Kamar Maiti[1]對(duì)雷氏普羅威登斯菌引起腦膜炎感染的案例進(jìn)行報(bào)告，因此神經(jīng)外科送檢率高。本研究中該菌對(duì)氨芐西林和阿莫西林均耐藥，耐藥率為100.00%；對(duì)碳青霉烯類藥物亞胺培南、厄他培南、美洛培南耐藥分別為36.00%、40.00%、28.00%。目前，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)對(duì)單株雷氏普羅威登斯菌的耐藥性進(jìn)行分析較多，而未大量的、系統(tǒng)的分析雷氏普羅威登斯菌耐藥性，因此缺乏可比性。

全基因組測(cè)序的優(yōu)點(diǎn)在于，不僅可以檢測(cè)出細(xì)菌的耐藥基因型，還可以發(fā)現(xiàn)可移動(dòng)元件，從而分析出耐藥基因型所處的基因環(huán)境[13]。引起細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的基因種類眾多，本研究在3株耐碳青霉烯類雷氏普羅威登斯菌菌中發(fā)現(xiàn)7類抗菌藥物耐藥基因，包括β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、甲氧芐啶、氨基糖苷類、磺胺類、氯霉素類和氟喹諾酮類。其中3株菌均同時(shí)攜帶β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaNDM-1、blaOXA-10和blaTEM-1B。與俞鳳等[14]僅發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶blaNDM-1和blaPER-4耐藥基因型的菌株，賈琴妹等[15]僅發(fā)現(xiàn)攜帶blaKPC-2的菌株結(jié)果不一致，可能原因是菌株存在地區(qū)差異性，不同醫(yī)院臨床醫(yī)生用藥習(xí)慣不同。

細(xì)菌耐藥性是通過存在于染色體或質(zhì)粒中的耐藥基因發(fā)生水平轉(zhuǎn)移或自身突變而獲得[16-17]。耐藥基因在各個(gè)菌株間水平轉(zhuǎn)移需借助可移動(dòng)元件(插入序列、轉(zhuǎn)座子和整合子等)的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合等形式完成復(fù)制[18]。本研究中3株菌均攜帶blaNDM-1和blaOXA-10耐藥基因型，遺傳結(jié)構(gòu)分別為IS30-blaNDM-1-bleMBL-trpF-dsbC-orf-groES-groEL-IS91、aac(6’)-Ib3-dfrA1-aadA1-blaOXA10-catB8-aadB。耐藥基因型blaNDM-1遺傳結(jié)構(gòu)分析表明，其與已報(bào)道的肺炎克雷伯菌質(zhì)粒pC2343-2(序列號(hào)：CPO39824)的遺傳結(jié)果高度一致，位于耐藥基因型blaNDM-1兩側(cè)的片段，下游通常為trpF、groES、groEL基因和insE基因的一部分，在上游發(fā)現(xiàn)插入序列IS30。插入序列IS30可介導(dǎo)耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移。耐藥基因型blaOXA10的遺傳結(jié)構(gòu)與已報(bào)道的海氏普羅威登菌質(zhì)粒p99101(序列號(hào)：CPO28385)高度相似，在耐藥基因型blaOXA10的兩側(cè)均為其他類抗菌藥物耐藥基因型，但其上下游是否存在插入序列或轉(zhuǎn)座子參與耐藥基因的構(gòu)成值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，既往對(duì)普羅威登斯菌耐藥情況缺乏系統(tǒng)性研究，對(duì)菌株分布，常見抗菌藥物耐藥率，尤其碳青霉烯耐藥基因型和遺傳特征均未見報(bào)道。本研究首次系統(tǒng)性地對(duì)普羅威登斯菌的耐藥性及碳青霉烯類耐藥菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序分析，具有一定的創(chuàng)新性。但仍存在測(cè)序菌株數(shù)量較少，耐藥基因型和耐藥基因環(huán)境分析不夠完善，有待進(jìn)一步擴(kuò)大對(duì)多種抗菌藥物的耐藥基因及基因環(huán)境的檢測(cè)，為臨床抗菌藥物規(guī)范化用藥提供指導(dǎo)。

通過對(duì)某院雷氏普羅威登斯菌耐藥性及碳青霉烯類耐藥菌株的全基因組測(cè)序分析，耐藥性結(jié)果顯示出多重耐藥現(xiàn)象，耐藥基因篩選結(jié)果顯示共有3株菌均攜帶β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、甲氧芐啶、氨基糖苷類、磺胺類和氯霉素類耐藥基因型，碳青霉烯類均攜帶blaNDM-1和blaOXA-10耐藥基因型。為防止多重耐藥菌株的出現(xiàn)，阻斷耐藥基因在病原菌和患者之間的傳播，在臨床治療過程中應(yīng)及早進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和耐藥基因分析，合理選擇抗菌藥物及聯(lián)合用藥。