基因突變與轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌患者VEGF靶向治療預(yù)后的關(guān)系

劉睿 張銘鑫 李丹 梁曄 梁志娟 王麗萍 牛海濤

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，山東 青島 266003)

腎細(xì)胞癌是人類最常見的惡性腫瘤之一[1]，全世界每年新確診的患者超過30萬，其中腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)占腎細(xì)胞癌的70%～85%，死亡率也最高[2]。近年來，隨著治療技術(shù)的不斷發(fā)展，靶向治療已經(jīng)成為晚期腎癌患者除手術(shù)外的常規(guī)治療方案。目前美國(guó)食品藥物監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的一線治療方案主要有舒尼替尼、帕佐帕尼等[3]，其中晚期腎癌臨床最常用的是以血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)為靶點(diǎn)的藥物，如舒尼替尼和索拉非尼等。另外，隨著對(duì)腎癌基因組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，某些基因如PBRM1、BAP1和SETD2等的突變能夠抑制腫瘤的進(jìn)展[4]，但目前尚不清楚這些基因突變與VEGF靶向治療臨床反應(yīng)的相關(guān)性。為了進(jìn)一步研究ccRCC基因突變與患者VEGF靶向治療反應(yīng)之間的相關(guān)性，本研究收集了轉(zhuǎn)移性ccRCC患者的腫瘤組織標(biāo)本，通過全外顯子組測(cè)序分析高頻突變基因在轉(zhuǎn)移性ccRCC患者VEGF靶向治療中的臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取我院15例轉(zhuǎn)移性ccRCC患者進(jìn)行全外顯子測(cè)序。納入標(biāo)準(zhǔn)：轉(zhuǎn)移性ccRCC患者，且進(jìn)行了舒尼替尼或索拉非尼靶向治療。同時(shí)選取TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中符合納入標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)移性ccRCC患者5例，納入其全外顯子組測(cè)序結(jié)果。共20例接受一線VEGF靶向治療的ccRCC患者被納入本研究，患者中男17例，女3例?；颊咧形浑S訪時(shí)間為3年,中位無進(jìn)展生存期(PFS)為14.5個(gè)月。有11例患者從診斷到接受靶向治療的時(shí)間小于1年。其中IMDC風(fēng)險(xiǎn)分層低、中、高度風(fēng)險(xiǎn)的患者分別為3、14和3例。使用索拉非尼和舒尼替尼的患者分別為15、5例。有3例患者曾接受過免疫因子治療。腫瘤最常見的轉(zhuǎn)移部位是肺和淋巴結(jié)。本研究獲得青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(審批號(hào)：QDFYWZLL26239)，并嚴(yán)格按照《人類和動(dòng)物權(quán)利聲明》以及《赫爾辛基宣言》的要求進(jìn)行相關(guān)研究工作。

1.2 全外顯子測(cè)序方法

1.2.1石蠟標(biāo)本DNA的提取 取患者術(shù)中切除的腎癌病理組織制成的石蠟切片，進(jìn)行脫蠟并以無水乙醇干燥。用石蠟樣本DNA提取試劑盒(MagMax FFPE DNA/RNA Ultra Kit,cat# A31881, Thermo Fisher)在全自動(dòng)核酸提取儀 (Thermo Fisher)上提取DNA并純化。

1.2.2全外顯子測(cè)序樣本庫(kù)的制備 將純化后的DNA在超聲波破碎儀(Covaris S220 sonicator)上打斷為長(zhǎng)度小于350 bp的片段；用核酸純化試劑盒(AMPureXP，cat#A63881,Agencourt/Beckman) 磁珠純化后加上接頭的DNA片段；通過Herculase Ⅱ Fusion HS DNA聚合酶系統(tǒng)進(jìn)行捕獲前PCR預(yù)擴(kuò)增并同時(shí)添加引物；隨后，在PCR儀上進(jìn)行外顯子雜交捕獲(65 ℃ 1 min，37 ℃ 3 s，循環(huán)60次)；利用鏈霉親和素磁珠(T1 Steptavidin magnetic beads)凈化提純捕獲到的DNA外顯子庫(kù)；最后，進(jìn)行捕獲后PCR擴(kuò)增并再次用磁珠(AMPure XP)凈化提純。

1.2.3全外顯子測(cè)序及基礎(chǔ)變異分析 將制備好的全外顯子DNA庫(kù)在測(cè)序儀(Illumina NovaSeq-6000)上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序原始照片用RT3(Illumina)軟件進(jìn)行堿基識(shí)別，然后用cutadapt程序進(jìn)行適配性調(diào)整，用Sentieon(San Jose, CA, USA)軟件集成環(huán)境濾去低質(zhì)量讀數(shù)量，并調(diào)用BWA算法與NCBI hg19人類參考基因組比對(duì)，GATV 3.5軟件處理后得到患者全外顯子序列。VarscanIndel, CNVnator軟件分別得到患者的單核苷酸變異、插入缺失和拷貝數(shù)變異等基因突變數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行有關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Kaplan-Meier方法對(duì)PFS進(jìn)行分析，并且基于Logrank檢驗(yàn)對(duì)基因變異情況進(jìn)行比較。結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)準(zhǔn)和突變狀態(tài)，利用Cox回歸評(píng)價(jià)突變型(MT)與野生型(WT)患者發(fā)生腫瘤進(jìn)展概率的比值即風(fēng)險(xiǎn)率(HR)。

2 結(jié) 果

本研究結(jié)果顯示，突變率最高的基因?yàn)閂HL(55%)，其次為BRM1(35%)，后依次為SETD2(20%)、PRDM16(15%)和BAP1(15%)。見圖1。為了保證數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確度，本研究?jī)H選取了研究隊(duì)列中突變頻率≥5%的基因進(jìn)行分析，其中VHL和PBRM1基因的突變頻率與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的結(jié)果基本吻合，而BAP1和SETD2基因的突變頻率較TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)基因的突變頻率高。同時(shí)，在本研究中被發(fā)現(xiàn)的具有較高突變頻率的PRDM16基因在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的突變率較低，僅為0.6%。

圖1 入組患者高頻突變基因分布情況

本組患者PFS為3～32個(gè)月，大部分患者的PFS小于20個(gè)月。VHL、SETD2、BAP1、MTOR以及ARID1A基因突變與患者PFS無明顯關(guān)聯(lián)。PBRM1基因MT患者的中位PFS較WT患者明顯延長(zhǎng)(χ2=5.45,P<0.05；HR=0.34,95%CI=0.12～0.96)。PRDM16基因MT患者的PFS較WT患者明顯延長(zhǎng)(χ2=8.22，P<0.05；HR=0.09，95%CI=0.01～0.76)。見表1。

表1 患者PFS、HR與基因突變的關(guān)系

3 討 論

近年來已有多種VEGF靶向藥物用于ccRCC的一線治療，臨床獲得明顯療效。本研究通過全外顯子測(cè)序技術(shù)探討轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌的基因突變與患者VEGF靶向治療預(yù)后的相關(guān)性，為VEGF靶向治療提供與預(yù)后相關(guān)的基因突變標(biāo)志物。

本研究結(jié)果顯示，PBRM1和PRDM16基因突變與患者VEGF靶向治療預(yù)后相關(guān)聯(lián)。研究顯示PBRM1和PRDM16基因突變參與了HIF-VEGF軸的調(diào)控過程[5-6]，而BAP1與SETD2基因突變頻率增加可能與ccRCC患者的晚期進(jìn)展有關(guān)[7-8]。本研究中VHL基因突變對(duì)患者預(yù)后無明顯影響，迄今為止對(duì)VHL基因突變和VEGF靶向治療預(yù)后關(guān)系的研究結(jié)論并不一致，可能還需要深入研究進(jìn)行驗(yàn)證[9-12]。在ccRCC中，VHL基因是HIF軸最常見的調(diào)控因素[13]，而HIF是影響腎癌發(fā)展的關(guān)鍵因素，其靶基因編碼包括VEGF在內(nèi)的多種可以促進(jìn)腎癌發(fā)生和進(jìn)展的蛋白質(zhì)，而HIF積累會(huì)導(dǎo)致VEGF調(diào)節(jié)失控，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管化程度的升高。

PBRM1是晚期ccRCC中最常見的突變基因，其編碼的含溴結(jié)構(gòu)域蛋白BAF180參與多種DNA修復(fù)過程，而PBRM1基因突變通常表現(xiàn)為基因表達(dá)的缺失[14]。在腎癌細(xì)胞系當(dāng)中HIF-1α蛋白表達(dá)缺失非常常見，而HIF-1α缺失的細(xì)胞系主要通過HIF-2α調(diào)節(jié)VEGF產(chǎn)生[15]。因此當(dāng)HIF-1α不表達(dá)時(shí)，PBRM1作為HIF-1α和HIF-2α的共同激活因子會(huì)誘導(dǎo)HIF-2α的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[16]。已有研究表明，PBRM1基因突變?cè)诰窒扌院屯砥谀I癌中具有不同的作用，在局限性腎癌中PBRM1基因突變會(huì)導(dǎo)致預(yù)后不良，而在晚期腎癌中則與預(yù)后良好相關(guān)[17]。一份來自RECORD Ⅲ的臨床試驗(yàn)報(bào)告表明，PBRM1基因的突變可能是一種靶向治療預(yù)后良好的預(yù)測(cè)標(biāo)志物[6,12]。本研究的結(jié)果顯示，PRDM16基因突變與患者PFS延長(zhǎng)有關(guān)。研究表明PRDM16基因可以通過抑制HIF的靶基因SEMA5B來下調(diào)VEGF的表達(dá)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲[18]。通常，腎癌組織中的PRDM16基因甲基化水平會(huì)發(fā)生明顯升高，導(dǎo)致其表達(dá)量較正常組織顯著下降[19]。這會(huì)導(dǎo)致腎癌組織中本應(yīng)被PRDM16基因產(chǎn)物抑制的下游HIF應(yīng)答基因SEMA5B被激活，而激活的SEMA5B基因則會(huì)通過促進(jìn)VEGF表達(dá)來支持體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)[5]。由此我們推測(cè)PRDM16基因突變可能改變了其啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化修飾狀態(tài)，解除腎癌組織中PRDM16沉默?？傊?，以上研究揭示了PBRM1和PRDM16對(duì)VEGF表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制。

本研究中仍存在著一些局限性：①腫瘤的異質(zhì)性。這是一個(gè)重要的混雜因素，本研究?jī)H對(duì)所選取的20例患者全外顯子組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析評(píng)估，無法識(shí)別腫瘤進(jìn)化過程中的所有驅(qū)動(dòng)因素。一項(xiàng)針對(duì)原發(fā)性腎癌的多核心活檢研究指出，要保證腫瘤基因分型的準(zhǔn)確性至少需要在3個(gè)不同的腫瘤區(qū)域進(jìn)行采樣[20]，然而這在常規(guī)的臨床工作中比較困難。②納入本研究的患者存在接受多種靶向藥物治療的情況。雖然收錄使用多種VEGF靶向藥物治療的樣本會(huì)增加結(jié)果的異質(zhì)性，但這種分布卻也更符合臨床治療中患者的實(shí)際情況。③樣本數(shù)量限制。雖然在本次研究中得出了一些具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)論，但樣本數(shù)量有限，希望以后這些結(jié)論可以在更大的樣本中得到進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研探索ccRCC中VEGF靶向治療預(yù)后和基因突變之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PBRM1以及PRDM16基因突變與轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌VEGF靶向治療預(yù)后良好密切相關(guān)，有助于指導(dǎo)臨床治療中VEGF靶向藥物的應(yīng)用。雖然本研究?jī)H闡明了以上基因突變與患者VEGF靶向治療之間的潛在聯(lián)系，但在基因突變的基礎(chǔ)上預(yù)測(cè)靶向治療效果并篩選預(yù)后良好標(biāo)志物，有助于為患者選擇最佳個(gè)體化治療方案，從而為ccRCC患者的臨床靶向治療提供一定的理論指導(dǎo)和依據(jù)。