七氟烷對(duì)心肌缺血再灌注損傷模型大鼠心肌的保護(hù)作用及其機(jī)制

白雪 宋思宜 郭海燕 趙洋 王士雷 李瑜

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，山東 青島 266003)

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是臨床常見的病理過程，是冠心病發(fā)病以及心肌血運(yùn)重建治療過程中心肌損傷的核心環(huán)節(jié)，如何減輕缺血再灌注損傷一直是國(guó)際研究的熱點(diǎn)之一。七氟烷是目前臨床應(yīng)用最為廣泛的吸入性麻醉藥。研究發(fā)現(xiàn)，圍手術(shù)期吸入七氟烷對(duì)心肌有保護(hù)作用[1-2]。隨著研究的深入，SARKAR等[3]證實(shí)七氟烷后處理(SPC)可調(diào)節(jié)圍手術(shù)期患者心血管系統(tǒng)的功能，如增加心肌收縮力、減輕MIRI所致心肌梗死等。在糖尿病大鼠受損的心肌組織中，SPC可顯著上調(diào)HIF1α及其下游遞質(zhì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子蛋白的表達(dá),減少心肌梗死面積，改善心臟功能[4]。研究表明，HIF2α可以誘導(dǎo)雙調(diào)蛋白(AREG)的表達(dá)[5]，該研究首次提出心肌細(xì)胞特異性HIF2α能增加心肌缺血耐受性，并且AREG可抑制HIF2α缺失小鼠的MIRI。但七氟烷對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用是否與HIF2α-AREG通路有關(guān)，目前尚不明確。本研究通過構(gòu)建大鼠MIRI模型，檢測(cè)經(jīng)不同方式處理的大鼠血流動(dòng)力學(xué)、心肌梗死面積的變化，以及大鼠心肌組織中促凋亡蛋白Bax及抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)的變化，探討七氟烷對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其與HIF2α-AREG通路的相關(guān)性。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年清潔級(jí)雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量280～320 g，由山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)20140007。實(shí)驗(yàn)前大鼠于安靜環(huán)境下，24 ℃恒溫飼養(yǎng)3～4 d，正常飲食，12-12 h明暗交替光照。所有大鼠實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。

1.1.2主要試劑及實(shí)驗(yàn)設(shè)備 AREG蛋白購自加拿大Biomatik公司，PT2385購自美國(guó)MCE公司，兔抗大鼠Bax、Bcl-2抗體購自武漢三鷹公司，正置白光顯微鏡(日本Olympus公司)，HX-100E小動(dòng)物呼吸機(jī)購自成都泰盟科技有限公司。蛋白電泳系統(tǒng)購自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組及處理 根據(jù)處理方法不同將大鼠隨機(jī)分為A、B、C、D、E組，每組9只大鼠。

A組在MIRI模型制備過程中[6]，分離出左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)后，在LAD下方穿線但不結(jié)扎，觀察160 min；B組在建立大鼠MIRI模型后，結(jié)扎LAD 40 min，隨后松開結(jié)扎線再灌注120 min；C組在B組操作的基礎(chǔ)上，再灌注開始時(shí)大鼠先吸入體積分?jǐn)?shù)0.024的七氟烷15 min，然后停止吸入七氟烷繼續(xù)再灌注105 min；D組于MIRI模型制備前1 h先腹腔注射HIF2α阻滯劑10 mg/kg，其后操作同C組；E組大鼠于LAD結(jié)扎前15 min經(jīng)頸內(nèi)靜脈注射AREG蛋白50 μg，其余操作同D組。處理過程中每組隨機(jī)選取5只大鼠，分別檢測(cè)缺血前、缺血15 min及再灌注2 h末的心率和血壓。

1.2.2標(biāo)本處理及各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè) ①上述各組大鼠處理結(jié)束后，每組隨機(jī)選取3只大鼠切取的心尖組織，HE染色后，顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)；②每組再隨機(jī)選取3只大鼠，均再次結(jié)扎LAD后，在頸內(nèi)靜脈注射伊文斯藍(lán)溶液3 mL，當(dāng)大鼠眼睛內(nèi)出現(xiàn)伊文斯藍(lán)時(shí)，快速取下心臟，保留左心室部分，生理鹽水沖洗后，于-80 ℃冰箱冷凍后切薄片，TTC染液脫色，置于37 ℃水浴箱中15 min，然后用組織固定液固定過夜，分離左心室和梗死部分(白色部分)并分別稱質(zhì)量,比較各組大鼠心肌梗死質(zhì)量占左心室質(zhì)量的比值；③每組取剩余3只大鼠，快速取下心臟，切取包含心尖的1/3體積心臟，去掉右心室，保留左心室部分，稱質(zhì)量。用組織裂解液裂解組織，獲取組織液，離心后取上清液，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。以40 μg蛋白量計(jì)算每組的上樣體積,加入上樣緩沖液,煮沸變性，并按照Western Blot試劑盒說明書進(jìn)行操作；封閉結(jié)束后，分別加入兔抗大鼠單克隆抗體Bax(稀釋比1∶5 000)、Bcl-2(稀釋比1∶4 000)4 ℃孵育過夜；次日洗膜以后加入二抗，室溫孵育以后加入顯影液，采用凝膠成像儀觀察。用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白的條帶灰度值表示目的蛋白的表達(dá)水平，計(jì)算各組大鼠的Bax/Bcl-2比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心率及平均動(dòng)脈壓變化

時(shí)間、分組、時(shí)間與分組交互作用對(duì)大鼠心率無明顯影響(P>0.05)，對(duì)大鼠平均動(dòng)脈壓有明顯影響(F時(shí)間=101.41，F(xiàn)組間=10.23，F(xiàn)交互=6.93，P<0.05)。各組缺血前心率及平均動(dòng)脈壓比較差異無顯著性(P>0.05)。除A組外，其余各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)平均動(dòng)脈壓比較差異有顯著性(F=16.07～34.08，P<0.05)，其中各組大鼠缺血15 min和再灌注2 h末與缺血前平均動(dòng)脈壓相比均具有明顯下降(P<0.05)，C組和E組再灌注2 h末平均動(dòng)脈壓較缺血15 min時(shí)明顯上升(P<0.05)。再灌注2 h末，與B組相比，C、E組平均動(dòng)脈壓均有明顯上升(F=13.62，P<0.05)，而D組與B組比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠缺血前、缺血15 min及再灌注2 h末心率及平均動(dòng)脈壓比較

2.2 各組大鼠心肌梗死質(zhì)量占左心室質(zhì)量比值

B～E組大鼠的心肌梗死質(zhì)量占左心室質(zhì)量比值為0.207±0.003、0.115±0.009、0.207±0.010、0.112±0.008，組間比較差異有顯著性(F=193.26，P<0.05)，其中C、D組與B組及D組與E組大鼠心梗質(zhì)量占左心室質(zhì)量比值比較差異有顯著性(t=14.24～20.01，P<0.05)。

2.3 各組大鼠心肌組織Bax/Bcl-2比值比較

A～E組大鼠心肌組織Bax/Bcl-2比值分別為2.56±0.11、20.92±4.37、5.30±0.29、11.34±1.22、3.54±0.34，各組間比較差異均具有顯著意義(F=27.92，P<0.05)，A、C組與B組以及C、E組與D組大鼠心肌組織Bax/Bcl-2比值比較差異有顯著意義(t=5.04～6.79，P<0.05)。

2.4 各組大鼠光鏡下心肌細(xì)胞形態(tài)比較

光鏡下觀察，A組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，無水腫(圖1A)；B組大鼠心肌細(xì)胞嚴(yán)重水腫，心肌細(xì)胞周圍可見炎性細(xì)胞聚集，心肌纖維組織周圍紅細(xì)胞滲漏(圖1B)；C組大鼠心肌細(xì)胞輕度水腫，心肌細(xì)胞周圍可見少量炎性細(xì)胞聚集，心肌細(xì)胞排列比較整齊(圖1C)；D組大鼠心肌細(xì)胞水腫、核固縮嚴(yán)重，心肌細(xì)胞周圍可見大量炎性細(xì)胞積聚(圖1D)；E組大鼠心肌細(xì)胞水腫程度較輕，心肌細(xì)胞排列略為紊亂，心肌細(xì)胞周圍炎性細(xì)胞聚集不明顯(圖1E)。

A～E分別為A～E組，HE染色法，400倍圖1 光鏡下各組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果

3 討 論

心肌缺血治療的關(guān)鍵是盡快恢復(fù)缺血區(qū)域的血供，但是再灌注又會(huì)產(chǎn)生MIRI。迄今為止，溶栓療法仍然是目前治療急性心肌缺血的有效方法[7]。在心肌缺血期間，心肌組織氧供減少，缺氧嚴(yán)重[8]，而低氧誘導(dǎo)因子(HIFs)是低氧適應(yīng)性轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子[9]，在心臟適應(yīng)性反應(yīng)中發(fā)揮著作用，降低心肌梗死的程度[6]，抑制HIFs的降解，從而減輕MIRI[10-11]。遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理對(duì)疑似首次心肌梗死的患者具有心肌保護(hù)作用[12]，而這一保護(hù)作用在敲除了HIF1α基因的小鼠中消失，證明HIF1α在遠(yuǎn)程缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的心臟保護(hù)中起著重要作用[13]。

HIF2α是一種由缺氧敏感的HIF2α亞單位與其專一性伴侶亞單位ARNT二聚體形成的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子[14]。研究顯示，HIF2α是肝癌治療的首選靶點(diǎn)[15]，且HIF2α阻滯劑對(duì)腎細(xì)胞癌早期模型有效[16]。但HIF2α對(duì)心肌細(xì)胞的影響研究報(bào)道較少，并且其與七氟烷在心肌細(xì)胞保護(hù)作用中的相關(guān)性也不是很清楚。KOEPPEN等[5]研究發(fā)現(xiàn)，激活HIF2α-AREG通路可抑制小鼠MIRI，改善缺血后數(shù)周小鼠的心臟功能，同時(shí)在缺血性心肌病患者中AREG表達(dá)增強(qiáng)。這些發(fā)現(xiàn)表明重組AREG可用于預(yù)防性治療心臟手術(shù)患者，以增強(qiáng)心肌缺血耐受。因此本研究擬通過建立大鼠MIRI模型來探討七氟烷對(duì)心肌缺血的保護(hù)作用是否與HIF2α-AREG通路有關(guān)，明確七氟烷對(duì)心肌保護(hù)作用的具體機(jī)制。

SPC可以發(fā)揮類似于缺血預(yù)處理或缺血后處理的心肌保護(hù)作用，這是應(yīng)對(duì)圍手術(shù)期MIRI損傷的一種非常有效的手段[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)C組缺血15 min和再灌注2 h末平均動(dòng)脈壓均高于B組，且C組心梗質(zhì)量占左心室質(zhì)量比值小于B組，表明C組心肌損傷輕于B組，也證實(shí)了七氟烷對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。而在同樣使用了七氟烷的情況下，加入了HIF2α阻滯劑的D組心梗質(zhì)量占左心室質(zhì)量比值大于C組且Bax/Bcl-2比值上調(diào)，但是與B組相比差異無顯著性。Bax/Bcl-2比值上調(diào)表明細(xì)胞趨于凋亡狀態(tài)[19]，表明經(jīng)HIF2α阻滯劑預(yù)處理的心肌MIRI的大鼠，即使應(yīng)用了對(duì)心肌組織具有保護(hù)作用的七氟烷，心肌梗死仍然加重。由此推斷臨床上使用了HIF2α阻滯劑治療其他疾病的心肌缺血患者，七氟烷對(duì)患者的心肌組織可能不能發(fā)揮保護(hù)作用。與D組相比較，E組心梗質(zhì)量占左心室質(zhì)量比值顯著減小，光鏡下心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)更完整且Bax/Bcl-2比值下調(diào)，表明E組心肌細(xì)胞損傷輕于D組。由此猜測(cè)對(duì)于正在使用HIF2α阻滯劑治療其他疾病且伴有心肌缺血的患者，雖然七氟烷的心肌保護(hù)作用被抵消，但仍然可以考慮應(yīng)用重組AREG蛋白來減輕MIRI。

綜上所述，SPC能夠減輕大鼠MIRI，減輕心肌梗死面積，改善血流動(dòng)力學(xué)；HIF2α抑制劑可以抵消七氟烷的心肌保護(hù)作用，使心肌損傷加劇。而重組AREG則可以改善心功能、增強(qiáng)對(duì)血流動(dòng)力學(xué)的保護(hù)。但是本研究有一定的局限性，首先，本研究使用的是特定藥物阻滯劑而不是基因操作來阻斷HIF2α；第二，本研究?jī)H采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了SPC對(duì)心肌具有保護(hù)作用且該保護(hù)作用可以通過HIF2α-AREG通路來實(shí)現(xiàn)，沒有進(jìn)行臨床研究。因此，有必要進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)研究進(jìn)行驗(yàn)證。