利用比重分選技術(shù)的福建柏種子分選

康淑琴，姬 莉，褚宣佑，吳小建，馬祥慶

(福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院，福建 福州350002)

福建柏（Fokienia hodginsii（Dunn）Henry et Thomas）是柏科建柏屬的重要造林樹種，多分布在我國南方 102°～120°E、22°～28.5°N 范圍內(nèi)，適生于海拔 580～1 500 m 的溫暖濕潤山地森林中[1-2]，其中在福建中部地區(qū)分布最多。福建柏生長迅速，材性優(yōu)良，樹形優(yōu)美，木材含抗菌和抗腫瘤的芳香油，是一種集材用、觀賞、生態(tài)保護(hù)于一體的優(yōu)良造林樹種[3-6]。由于長期以來人為的破壞，福建柏天然分布面積變小，且多處于散生狀態(tài)，天然更新能力差，被列為國家二級(jí)瀕危保護(hù)植物[7]。因此，如何加強(qiáng)福建柏種苗繁育研究，擴(kuò)大其人工種群，成為當(dāng)前林業(yè)生產(chǎn)急需解決的重大課題。

眾多學(xué)者對(duì)福建柏進(jìn)行了大量研究，但主要集中在福建柏人工造林成效方面，有關(guān)福建柏種苗繁育研究相對(duì)較少，僅有福建柏扦插和組培育苗的研究報(bào)道[8]，目前生產(chǎn)上還主要以種子育苗為主。由于福建柏種子存在大量空粒、癟粒和無活力種子，導(dǎo)致育苗過程中福建柏種子發(fā)芽率低[9]，因此，如何精準(zhǔn)分選出福建柏的高活力種子，剔除空粒、癟粒和無活力種子，提高其種子的發(fā)芽率，顯得極為迫切。

長期以來，有關(guān)林木種子的高效分選技術(shù)一直是林木種子研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[10-11]。種子分選主要是利用正常有活力種子與異常種子在質(zhì)量、密度、性狀、大小、表面結(jié)構(gòu)、光澤度、顏色、彈性、斑點(diǎn)等物理性質(zhì)的差異及不同種子在生理化學(xué)特性、光學(xué)響應(yīng)特征的差異進(jìn)行分離[12-13]。利用種子在生理化學(xué)特性、光學(xué)響應(yīng)特征的差異進(jìn)行分選的技術(shù)有介電分選[14]、代謝物電子鼻裝置、內(nèi)含物核磁共振分析儀、色選-光電分選[15-16]、近紅外光譜[17]、X-ray成像、種皮葉綠素?zé)晒鈁18]、計(jì)算機(jī)視覺和圖像技術(shù)[19]等，這些技術(shù)的分選精度高，但均需要借助昂貴的儀器和較高的操作技術(shù)要求，在生產(chǎn)上較難普及應(yīng)用。而傳統(tǒng)林木種子風(fēng)選、水選等物理方法，不需要大型儀器，操作容易，成本低，實(shí)用性強(qiáng)，在生產(chǎn)上有廣泛的應(yīng)用前景。水選（液選）技術(shù)只要有合適的比選介質(zhì)及其比重，就可將種子分離。不同林木種子的比選介質(zhì)和處理方法均會(huì)對(duì)分選精度產(chǎn)生影響，比重小的種子可通過浸泡增加其比重，或是利用有機(jī)溶劑進(jìn)行分選，比重大的種子可利用蔗糖、氯化鈉等溶液進(jìn)行分選[20]。但目前有關(guān)福建柏種子的比重分選技術(shù)研究還比較缺乏。

本論文以福建柏種子為研究對(duì)象，利用比重分選技術(shù)，通過設(shè)計(jì)不同分選溶液、不同濃度和不同浸泡時(shí)間進(jìn)行處理，探討不同分選措施對(duì)福建柏種子分選精度的影響，篩選適合福建柏種子分選的適宜分選溶液、分選液濃度和浸泡時(shí)間，確定適合福建柏種子的比重分選方法，為福建柏人工育苗提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇福建安溪縣國有林場2019年11月采集的福建柏種子為試驗(yàn)材料。試驗(yàn)前將福建柏種子進(jìn)行揉搓去除種翅，用0.005 g/L的高錳酸鉀溶液浸泡消毒30 min，然后用清水沖洗10～15 min，最后用濾紙擦干備用[21]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇不同分選溶液、不同分選液濃度及不同浸泡時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。參考前人研究，選擇蔗糖、氯化鈉兩個(gè)不同比重的分選溶液，每種溶液分別設(shè)置4種分選濃度 (0、50、100和150 g/L)，同時(shí)在不同分選溶液和分選液濃度的處理中設(shè)置浸泡種子1、2、3 d處理。共設(shè)計(jì)24個(gè)不同試驗(yàn)處理，每個(gè)試驗(yàn)處理200粒種子，重復(fù)4次，同時(shí)設(shè)置水溶液的對(duì)照處理（CK）。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 測定方法

1.3.1 種子發(fā)芽試驗(yàn)

首先把經(jīng)消毒后的種子按照試驗(yàn)處理分別在燒杯（250 mL）中浸泡1、2、3 d；再把不同浸泡時(shí)間的種子放入不同濃度的氯化鈉和蔗糖溶液中震蕩3～5 min，隨后分別收集、清洗漂浮種子和下沉種子，計(jì)算漂浮種子和下沉種子的粒數(shù)。用漂浮和下沉種子分別開展發(fā)芽試驗(yàn)，每個(gè)9 cm的培養(yǎng)皿放50粒種子，放在培養(yǎng)試驗(yàn)箱中培養(yǎng)，每天觀測記錄種子發(fā)芽數(shù)，發(fā)芽結(jié)束后進(jìn)行種子活力測定。對(duì)照組種子僅進(jìn)行消毒和蒸餾水浸泡處理，種子不進(jìn)行沉浮分離，同樣進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)和種子活力測定。

隨機(jī)選取不同處理的上浮種子、下沉種子和對(duì)照組不分離種子各50粒，在25℃濕度85%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，每天觀測記錄發(fā)芽種子數(shù)（當(dāng)胚根長到2 mm時(shí)即為發(fā)芽種子），30 d后測定發(fā)芽種子根長。

1.3.2 休眠種子活力測定

選擇不同試驗(yàn)處理的種子取樣測定種子活力。采用TTC（2,3,5-氯化三笨基四氮唑）法測定種子活力[22]。30 d后將未萌發(fā)種子進(jìn)行種子活力測定，通過染色法來確定有活力和沒有活力種子，有活力的種子確定為休眠種子。

1.3.3 發(fā)芽指標(biāo)計(jì)算[23]

發(fā)芽率G（%）=n/N×100%（n:表示發(fā)芽種子數(shù)；N:表示供試種子數(shù)）?；盍ΨN子數(shù)m=發(fā)芽種子數(shù)+休眠種子數(shù)。種子活力比例Gm（%）=m/N×100%（m表示活力種子數(shù)；N表示供試種子數(shù)）。分選精度=Gs-Gf（Gf表示上浮種子活力比例；Gs表示下沉種子活力比例）。

1.3.4 種子酶活性測定

在不同試驗(yàn)處理中選擇分選效果最好的種子進(jìn)行酶活性測定[24-25]。采用氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法測定種子超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用愈創(chuàng)木酚比色法測定種子過氧化物酶（POD）活性；采用紫外吸收法測定種子氧化氫酶（CAT）活性；采用硫代巴比妥酸法測定種子丙二醛（MDA）含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel、SPSS 20.0（statistical product and service solutions,IBM 公司）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,用Origin 8.5（OriginLab公司）軟件進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分選處理對(duì)福建柏種子發(fā)芽指標(biāo)影響的方差分析

多因素方差分析結(jié)果表明（表2）：不同試驗(yàn)處理對(duì)福建柏分選后下沉種子的活力及其分選精度有不同影響。浸泡時(shí)間對(duì)福建柏種子發(fā)芽率無顯著影響，其它因素對(duì)種子發(fā)芽率有顯著影響；比選溶液、溶液濃度、浸泡時(shí)間及其交互作用對(duì)下沉種子的活力均有極顯著影響（P＜0.01），比選溶液、溶液濃度及其交互作用對(duì)下沉種子活力指數(shù)有極顯著影響（P＜0.01），種子浸泡時(shí)間與比選溶液交互作用對(duì)福建柏種子活力指數(shù)無顯著影響（P＞0.05）；比選溶液、溶液濃度、浸泡時(shí)間對(duì)福建柏種子分選精度有極顯著影響（P＜0.01）。可見，福建柏種子浸泡后利用不同濃度的比選溶液進(jìn)行種子分選有利于提高其種子的分選精度。

表2 不同處理對(duì)福建柏種子發(fā)芽指標(biāo)影響的方差分析

2.2 不同比選溶液對(duì)福建柏種子分選效果的影響

從圖1可知，不同比選溶液對(duì)福建柏種子的活力比例有不同影響。隨氯化鈉溶液濃度增加，福建柏下沉種子的比例下降，下沉種子中具有活力種子的比例下降。其中，150 g/L氯化鈉處理中超過55%福建柏種子上浮，特別是含水量較低處理種子均呈上浮狀態(tài)。因此利用小于100 g/L的氯化鈉溶液進(jìn)行福建柏種子分選效果更好。

圖1 不同溶液分選處理對(duì)福建柏種子活力比例的影響

從圖1可知，隨蔗糖溶液濃度增加，福建柏上浮種子中具有活力種子的比例增加，下沉種子中具有活力種子的比例下降。其中浸泡2、3 d福建柏種子在100～150 g/L濃度分選時(shí)，下沉有活力種子比例超過47.5%，上浮種子中具有活力種子的比例低于4.5%，最低為0.8%?？梢娎么笥?00 g/L的蔗糖溶液進(jìn)行福建柏種子分選效果更好，可將大部分空粒種子剔除。

從圖1看出,蔗糖溶液分選處理不僅下沉種子的比例高于氯化鈉分選溶液，而且下沉種子中有活力種子比例也高于氯化鈉分選溶液，因此，利用蔗糖溶液進(jìn)行福建柏種子分選效果比氯化鈉溶液處理的效果更佳。

2.3 不同比選液濃度對(duì)福建柏種子分選效果的影響

選擇種子浸泡3 d后進(jìn)行不同比選液濃度的分選效果見表3。不同氯化鈉濃度處理種子的發(fā)芽率、活力指數(shù)和分選精度存在差異，其中以50 g/L濃度的氯化鈉溶液處理的分選精度較高，但均低于純水對(duì)照，可見利用氯化鈉溶液進(jìn)行福建柏種子分選的效果不好，還不如用水的分選效果。這可能與本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的氯化鈉溶液濃度偏高有關(guān)。

表3 浸泡三天條件下不同比選液濃度對(duì)福建柏種子分選效果的影響

從表3看出，不同蔗糖濃度處理福建柏種子的發(fā)芽率、活力指數(shù)和分選精度存在差異，其中以100 g/L濃度蔗糖處理的發(fā)芽率、活力指數(shù)和分選精度最高，發(fā)芽率、活力指數(shù)和分選精度分別為30%、68.6%和91.9%，分別是水選對(duì)照的1.4、0.9和1.1倍。可見，利用100 g/L濃度的蔗糖溶液進(jìn)行福建柏種子分選效果最好。

2.4 不同浸泡時(shí)間對(duì)福建柏種子分選效果的影響

選擇分選液濃度100 g/L條件下不同浸泡時(shí)間處理的分選效果見圖2。在氯化鈉100 g/L濃度條件下不同浸泡時(shí)間處理福建柏下沉種子的發(fā)芽率、活力指數(shù)、活力比例及分選精度隨著浸泡時(shí)間的增加而上升。其中種子發(fā)芽率以浸泡3 d處理最高，與浸泡1 d處理相比提高了1.9倍，活力指數(shù)、活力比例和分選精度以浸泡2 d處理最高，與浸泡1 d處理相比分別提高了4.6、9和4.7倍。可見福建柏種子浸泡2、3 d后進(jìn)行氯化鈉溶液分選效果更好。

圖2 100g/L濃度條件下不同浸泡時(shí)間對(duì)福建柏種子分選效果的影響

在蔗糖100 g/L濃度條件下不同浸泡時(shí)間處理福建柏下沉種子的發(fā)芽率、活力指數(shù)、活力比例及分選精度存在不同程度差異。其中種子發(fā)芽率和活力指數(shù)均以浸泡2 d處理最高，分選精度以浸泡3 d處理最高。可見福建柏種子浸泡3 d后進(jìn)行蔗糖溶液分選效果更好。

2.5 分選效果較好處理的有活力福建柏種子的酶活性分析

鑒于不同試驗(yàn)處理中以浸泡3 d后在100 g/L濃度蔗糖溶液中分選處理的效果最好，本研究選擇該試驗(yàn)處理的上浮、下沉種子進(jìn)行種子酶活性測定。

從表4看出，不同分選處理種子的酶活性存在顯著差異。與對(duì)照相比，上浮和下沉種子中的POD和SOD活性均顯著降低（P＜0.05）。在有活力種子中，分選后種子與對(duì)照相比CAT和MDA含量有所下降；在無活力種子中，分選后種子酶活性高于對(duì)照組，總體來看下沉種子酶活性比上浮種子更高。在種子萌發(fā)過程中種子的吸漲作用促進(jìn)發(fā)芽，從而導(dǎo)致種子酶活性發(fā)生明顯變化。

表4 有活力的上浮和下沉種子酶活性的比較

3 討論

利用正常有活力種子與異常種子在物理性質(zhì)和生理化學(xué)特性的差異進(jìn)行種子分選是常見的提高林木種子發(fā)芽率方法，其中利用不同溶液進(jìn)行種子分選技術(shù)操作容易，成本低，實(shí)用性強(qiáng)，在林業(yè)生產(chǎn)上有廣泛應(yīng)用前景。Daneshvar利用蔗糖溶液進(jìn)行刺柏種子分選研究，收集到的下沉刺柏種子發(fā)芽率可達(dá)77%，分選精度為74%，而去除掉的漂浮種子中活種子僅占4%[23]。于文來[26]等利用小麥種子蛋白質(zhì)吸收水分比淀粉多的原理，將浸泡后的種子進(jìn)行分選，能夠獲得高蛋白小麥種子。陳榮振[27]等利用不同比重的氯化鈉與蔗糖溶液分選小麥種子，可獲得高蛋白小麥種子。朱麗偉等[28]利用硫酸溶液分離烏拉爾甘草等種子發(fā)現(xiàn)：溶液比重越大，分選出的種子發(fā)芽率和活力越高，而且蟲蝕率越低。本研究表明：不同分選溶液對(duì)福建柏種子發(fā)芽率、活力指數(shù)、活力比例及分選精度均有顯著影響，用100 g/L蔗糖溶液分選的福建柏種子分選精度達(dá)91.9%。但氯化鈉溶液的分選效果不佳，在100、150 g/L濃度處理中福建柏種子多呈上浮狀態(tài)，可能與設(shè)計(jì)的氯化鈉溶液濃度偏高有關(guān)。

本研究中氯化鈉溶液的福建柏種子分選效果低于蔗糖溶液，這可能在同種濃度梯度條件下氯化鈉溶液的比重大于蔗糖有關(guān)。水的比重為1 kg/m3，在0～150 g/L濃度下氯化鈉溶液的比重為1～1.1047 kg/m3，蔗糖溶液比重為1～1.084 kg/m3，而且研究表明種子在溶液中的沉浮還與溶液的粘度有關(guān)，氯化鈉溶液的粘度小于蔗糖溶液的粘度[29]，可見蔗糖溶液比氯化鈉溶液更適合福建柏種子的分選。

4 結(jié)論

不同分選溶液、不同分選液濃度和不同浸泡時(shí)間對(duì)福建柏種子的發(fā)芽率、活力指數(shù)、活力比例及分選精度均有顯著影響。利用蔗糖溶液進(jìn)行福建柏種子的分選效果優(yōu)于氯化鈉溶液，浸泡3天后利用100 g/L蔗糖溶液處理種子的分選精度最高，為91.9%。利用比重分選技術(shù)進(jìn)行福建柏種子的分選效果顯著，可剔除種子中絕大部分的無活力種子，提高保留種子的發(fā)芽率，該技術(shù)是值得生產(chǎn)上推廣的種子分選技術(shù)。