湄潭白茶多糖提取工藝優(yōu)化及其抑菌活性研究

宋姍姍，楊艾華，王微微，王小敏

（遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州遵義 563000）

白茶（White tea）屬于我國傳統(tǒng)六大茶類之一，因其獨(dú)特的制作工藝，具有外形自然、滿披白毫、毫香清鮮、湯色清澈、滋味清淡回甘等品質(zhì)特點(diǎn)[1]。白茶主要產(chǎn)自我國福建、云南、貴州等地，以其清甜鮮爽的口感及清熱解毒、調(diào)節(jié)血脂等保健功效廣受消費(fèi)者認(rèn)可[2?4]。因其自然的制作工藝，白茶除含有常見的茶多酚、氨基酸、咖啡堿等活性成分外，還含有多糖類活性物質(zhì)[5]。多糖（polysaccharides）是由單糖連接形成的大分子物質(zhì)，具有降血糖、降血脂、提高免疫力和抗腫瘤等功能[6?10]，是部分天然食品提高免疫力、發(fā)揮保健功能的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[11?12]。Wang、Chen等[13?14]對(duì)粗茶中多糖成分進(jìn)行了提取分離，所得多糖具有抗氧化、清除自由基或保護(hù)人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用，說明茶多糖在調(diào)節(jié)人體機(jī)能方面具有重要藥理活性，為研究茶葉成分的藥理作用及茶多糖產(chǎn)品的開發(fā)提供了可能。

貴州省湄潭縣因其具有海拔高、緯度低、云霧多、日照少等獨(dú)特的地理?xiàng)l件，形成了集中種茶、專業(yè)制茶、統(tǒng)一交易及銷售等一系列的茶產(chǎn)業(yè)科學(xué)發(fā)展路線，目前當(dāng)?shù)夭璁a(chǎn)品制作與加工已覆蓋到六大茶類，具有較好的綜合經(jīng)濟(jì)效益[15?16]。本研究以湄潭白茶為對(duì)象，探討湄潭白茶提取工藝中料液比、提取時(shí)間、提取溫度與多糖得率的關(guān)系，利用正交試驗(yàn)確定提取最優(yōu)條件，并對(duì)湄潭白茶多糖抑菌活性進(jìn)行了測(cè)定，以期為湄潭白茶的應(yīng)用開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白茶 購于貴州省湄潭縣沁園春茶業(yè)；苯酚、濃硫酸、三氯甲烷、正丁醇、無水乙醇、無水葡萄糖（均為分析純）購自成都化學(xué)試劑廠；供試菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC26003、大腸桿菌（Escherichia coli）CMCC44102、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC10104、白色念珠菌（Candida Albicans）CMCC98001 由遵義醫(yī)科大學(xué)微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

BCM-1000A超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HH·W21·600S恒溫水浴鍋 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；TD5M-WS高速離心機(jī) 上海盧湘儀；101-2AB電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；HH-B11·600BY電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；LGJ-10D真空冷凍干燥機(jī) 四環(huán)科儀（天津）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 湄潭白茶樣品預(yù)處理及多糖提取 將茶葉在55 ℃下烘至恒重，粉碎過篩（40 目），置于干燥器內(nèi)保存。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量白茶粉末，在合適的料液比、溫度、時(shí)間條件下提取，離心得到粗多糖提取液。向提取液中加入等體積Sevage試劑（氯仿:正丁醇=4:1，mL/mL），震蕩混勻，靜置20 min，收集上清液，即為脫蛋白的多糖提取液[17?18]。再向上述提取液中加入4 倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置24 h。4000 r/min離心并收集醇沉物質(zhì)，經(jīng)真空冷凍干燥處理，得湄潭白茶多糖樣品[19]。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 料液比對(duì)提取率的影響 稱取1.0 g白茶粉（40 目）于三角瓶中，加入蒸餾水（料液比分別為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL），設(shè)置水浴溫度80 ℃，提取時(shí)間3 h，考察料液比與湄潭白茶多糖得率的關(guān)系。

1.2.2.2 提取溫度對(duì)提取率的影響 稱取1.0 g白茶粉（40 目）于三角瓶中，加入料液比1:20 g/mL蒸餾水，設(shè)置提取時(shí)間3 h，改變水浴溫度為60、70、80、90、100 ℃，考察提取溫度與湄潭白茶多糖得率的關(guān)系。

1.2.2.3 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 取1.0 g白茶粉（40 目）于三角瓶中，固定80 ℃的提取溫度，1:20 g/mL的料液比條件，分別提取1、2、3、4、5 h，考察提取時(shí)間與湄潭白茶多糖得率的關(guān)系。

1.2.3 正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）為影響因素，多糖提取率為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)[20?21]，確定最佳提取工藝參數(shù)，其因素水平表見表1。

表1 湄潭白茶多糖正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Levels and factors in orthogonal test of Meitan white tea polysaccharide

1.2.4 湄潭白茶多糖得率的計(jì)算

1.2.4.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 采用苯酚-硫酸法測(cè)定[22]。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為無水葡萄糖，配制成濃度為0、0.02、0.04、0.06、0.08 和0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，于490 nm測(cè)定吸光值。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、葡萄糖濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為y=2.927x±0.052，R2=0.996，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.4.2 多糖得率的計(jì)算 將多糖樣品加蒸餾水溶解，稀釋100 倍后參照標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法測(cè)定多糖吸光度，并根據(jù)公式(1)計(jì)算湄潭白茶多糖的得率：

式中：W表示湄潭白茶多糖得率，%；c表示根據(jù)吸光度值計(jì)算出的溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；D表示溶液稀釋倍數(shù)；V表示多糖溶液體積，mL；m表示白茶取樣量，mg。

1.2.5 湄潭白茶多糖抑菌活性研究

1.2.5.1 多糖溶液及供試菌液制備 按最佳工藝方案提取湄潭白茶多糖，配制成濃度為100 mg/mL的多糖溶液，過濾除菌后保存?zhèn)溆?。供試菌單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12～18 h，調(diào)整細(xì)菌密度為106cfu/mL。

1.2.5.2 茶多糖對(duì)供試菌株抑菌活性測(cè)定 取50 μL供試菌液均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，將已高壓滅菌的牛津杯放置其上，分別加入50 μL待檢溶液。實(shí)驗(yàn)組：100 mg/mL多糖溶液；陽性對(duì)照組：10 μg/mL環(huán)丙沙星；陰性對(duì)照組：無菌蒸餾水。37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.5.3 茶多糖對(duì)供試菌株最低抑菌濃度MIC及最低殺菌濃度MBC測(cè)定 將100μL待檢溶液與供試菌液等體積混合。實(shí)驗(yàn)組：不同濃度多糖溶液（100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.195 mg/mL）；對(duì)照組：供試菌液；空白對(duì)照組：營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察并記錄結(jié)果。以肉眼觀察未見細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度為MIC；每孔取50 μL溶液均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果，以完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度為MBC。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)隨機(jī)重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，用Excel 2016 軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 湄潭白茶多糖提取單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)湄潭白茶多糖提取率的影響 有效成分的提取與料液比有密切關(guān)系，充足的溶劑量可保證樣品充分浸沒和溶質(zhì)的溶出。如圖1 所示，隨著料液比的增加，多糖得率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并在1:25 g/mL時(shí)達(dá)到最大值。但當(dāng)料液比超過1:25 g/mL時(shí)，多糖得率開始下降。分析原因：在熱量一定情況下，固相與液相之間存在濃度差，溶劑量越多，細(xì)胞內(nèi)外的多糖濃度梯度就越大，使多糖擴(kuò)散到溶劑里的含量增加；但隨著溶劑量繼續(xù)增大，吸附作用增強(qiáng)而導(dǎo)致多糖提取率略有下降[23?24]。因此，湄潭白茶多糖提取料液比為1:25 g/mL比較適合。

圖1 料液比對(duì)湄潭白茶多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction liquid-solid ratio on the Meitan white tea polysaccharide yield rate

2.1.2 提取溫度對(duì)湄潭白茶多糖提取率的影響 如圖2 所示，當(dāng)提取溫度在50～90 ℃之間，多糖得率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并在90 ℃時(shí)達(dá)最大值，但當(dāng)溫度超過90 ℃后，多糖得率逐漸下降。分析原因：隨著溫度的升高，溶劑的滲透能力和溶解能力隨之提高，多糖分子運(yùn)動(dòng)加快，有利于多糖從細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)部溶解析出；但溫度過高，料液中多糖分子受到破壞，導(dǎo)致多糖分解，使多糖得率下降[25]。因此，初步確定湄潭白茶多糖提取溫度在90 ℃比較適合。

圖2 提取溫度對(duì)湄潭白茶多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the Meitan white tea polysaccharide yield rate

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)湄潭白茶多糖提取率的影響 有效成分的提取與時(shí)間有密切關(guān)系，充足的時(shí)間可保證有效成分充分溶解釋放。如圖3 所示，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率呈現(xiàn)平緩升高趨勢(shì)，但提取時(shí)間超過4 h后，提取率逐步下降。分析原因：提取時(shí)間較短時(shí)，產(chǎn)物不能充分溶解；但時(shí)間過長(zhǎng)，多糖穩(wěn)定性下降，結(jié)構(gòu)部分易被破壞，影響提取效果[26?27]。因此，初步確定湄潭白茶多糖提取時(shí)間在4 h比較適合。

圖3 提取時(shí)間對(duì)湄潭白茶多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the Meitan white tea polysaccharide yield rate

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)提取溫度、提取時(shí)間及液料比3 個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定最佳提取工藝條件，正交試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。分析可知，影響多糖得率的因素中，影響程度依次為：B﹥A﹥C。提取的最佳工藝條件為A2B3C2，即提取溫度為90 ℃，提取時(shí)間為4 h，料液比1:20 g/mL。

表2 湄潭白茶多糖提取正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 2 The orthogonal results of polysaccharide extraction from Meitan white tea

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果得到的最優(yōu)提取條件（提取溫度為90 ℃，提取時(shí)間為4 h，料液比1:20 g/mL）提取湄潭白茶多糖。試驗(yàn)重復(fù)三次，得到多糖平均得率為1.163%±0.011%。

2.4 湄潭白茶多糖的抑菌活性

2.4.1 湄潭白茶多糖對(duì)供試菌株抑菌活性測(cè)定 根據(jù)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法[28]，判定供試菌株對(duì)湄潭白茶多糖的敏感性。如表3 所示，湄潭白茶多糖對(duì)4 種供試菌株的抑菌圈直徑大小均在11～16 mm范圍內(nèi)，皆表現(xiàn)為中度敏感。其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最為明顯，抑菌圈直徑達(dá)到15.47±0.12 mm。表明湄潭白茶多糖對(duì)革蘭氏陽性菌抑制效果顯著，而對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌等革蘭氏陰性菌及真菌的抑制作用相對(duì)較弱。

表3 湄潭白茶多糖抑菌圈直徑Table 3 Diameter of inhibition zone of polysaccharides from Meitan white tea

2.4.2 湄潭白茶多糖對(duì)供試菌株最低抑菌濃度MIC及最低殺菌濃度MBC測(cè)定 湄潭白茶多糖對(duì)各供試菌株均有一定的抑制作用，因此，采用適當(dāng)?shù)亩嗵窍♂対舛葘?duì)各供試菌株進(jìn)行敏感實(shí)驗(yàn)。如表4所示，湄潭白茶多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果強(qiáng)于大腸桿菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌，與抑菌活性結(jié)果一致。其中對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度MIC為3.125 mg/mL，最低殺菌濃度MBC為6.25 mg/mL。

表4 湄潭白茶多糖MIC及MBC測(cè)定結(jié)果Table 4 MIC and MBC of polysaccharides from Meitan white tea

3 結(jié)論

通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化湄潭白茶多糖提取工藝，研究表明：在提取溫度為90 ℃，提取時(shí)間為4 h，料液比1:20 g/mL條件下，湄潭白茶多糖最高得率為1.163%±0.011%。抑菌活性試驗(yàn)中，分別探索了湄潭白茶多糖對(duì)屬于革蘭氏陰性菌的大腸桿菌、銅綠假單胞菌，屬于革蘭氏陽性菌的金黃色葡萄球菌和屬于真菌的白色念珠菌的抑制作用，確定了其對(duì)4 種供試菌株的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度，說明湄潭白茶多糖具有較好的抑菌能力。本研究為湄潭白茶多糖的綜合利用和資源開發(fā)提供相關(guān)理論支持，對(duì)促進(jìn)湄潭白茶多糖在功能性食品中的應(yīng)用具有重大意義。