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    樟葉木脂素的提取純化及其抗氧化性、抗癌活性

    2021-07-23 07:29:14周海旭蘇同超冉軍艦余夢薇薛靜麗李婧瑜李曉晴李忠海
    食品工業(yè)科技 2021年13期
    關鍵詞:木脂素脂素松脂

    周海旭,蘇同超,李 姝,冉軍艦,李 波,高 晗,余夢薇,薛靜麗,李婧瑜,李曉晴,李忠海,2,

    (1.河南科技學院食品學院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院,湖南長沙 410004)

    樟樹主要生長于中國長江以南地區(qū),因其可作為中藥而具有極高的開發(fā)價值[1]。樟樹葉含有多種天然活性成分,例如多酚[2]、黃酮[3]、生物堿[4]、木脂素[4?5]等。其中木脂素是由兩分子C6C3組成的苯丙素及其衍生物組成[6]。目前已從樟樹葉中提取得到的木脂素有芝麻素、(+)-diasesamin[3],新芝麻脂素[4],maculation[5]等。研究表明木脂素具有抗氧化[7]、抗癌[8]、抑菌[9]、抗病毒[10]、保護肝臟[11?12]、抗炎[13?14]等功效。在實際生活中,樟葉凋落后經常被當成垃圾丟棄或進行焚燒處理,這不僅造成資源的浪費,而且還造成環(huán)境的污染。

    現有的文獻表明木脂素的提取方法主要有加熱回流法[15]、微波提取技術[1]、超聲波提取技術[6]、超臨界提取技術[16]等。超聲波提取法利用其空穴效應、熱效應和機械作用來提高天然產物得率[17],具有耗時短、操作簡單的優(yōu)點[18]。與本團隊已研究的微波法[1]相比,超聲波技術具有高效、便捷的優(yōu)勢。響應面分析技術采用多元二次回歸方程來擬合影響因素與響應值之間的關系,是有效優(yōu)化工藝條件的方法,可精確表述各個因素與響應值之間的關系[19?20]。

    因此本研究擬用超聲波提取法輔助提取樟樹葉中的木脂素,并利用響應面法優(yōu)化提取工藝以獲得樟葉木脂素的最優(yōu)值。在此基礎上,通過HPLC分析純化后樟樹葉木脂素的純度;同時利用對DPPH自由基、羥基自由基的清除效果研究樟樹葉木脂素的抗氧化活性;以肝癌細胞(HepG2)、人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)為研究對象分析樟葉木脂素的細胞毒性作用,以期將樟葉變廢為寶,為樟葉木脂素應用于食品行業(yè)提供理論依據。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    樟葉 采自校園內小葉樟葉樹種;五味子酯甲標準樣品 純度≥98%,上海金穗生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)合肥博美生物公司;芝麻素標準品、松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷標準品純度≥98%,Sigma公司;肝癌細胞(HepG2 cells ATCC HB-8065)、人臍靜脈內皮細胞(HUVEC cells ATCC CRL-1730)索萊寶生物科技有限公司;胎牛血清(FBS)BI公司;1640 培養(yǎng)基、雙抗(antianti)、0.25%胰酶(1×)Gibco公司;MTS試劑盒美國貝博生物;其他試劑 均為分析純。

    SHB-Ⅲ循環(huán)水式旋轉蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿有限公司;JY92-11 超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;UV3700 紫外可見分光光度儀 日本島津公司;S111CO2培養(yǎng)箱 Thermo公司;TC20 細胞計數儀 BIO-RAD公司;DW-HL388?80℃超低溫冰箱 中科美菱低溫科技有限責任公司;RT-6000 酶標儀 深圳雷杜生命科學股份有限公司;ICX41 倒置顯微鏡 舜宇光學科技(集團)有限公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 工藝流程 樟樹葉→風干→粉碎→超聲波輔助提?。? 次)→常溫下浸提提?。?5 ℃,2 h)→離心(4000 r/min,15 min)→濃縮→冷凍干燥(?40 ℃,48 h)→粗木脂素

    1.2.2 單因素實驗設計 以料液比、超聲時間、乙醇濃度、浸提時間為因素,考察各因素對木脂素提取量的影響。

    1.2.2.1 料液比對樟樹葉木脂素提取量的影響 以超聲波功率300 W,超聲時間20 min,乙醇濃度60%,浸提時間60 min為固定條件,考察液料比(g/mL)分別為1:5、1:10、1:15、1:20、1:25 對樟葉木脂素提取量的影響。

    1.2.2.2 超聲時間對樟樹葉木脂素提取量的影響以超聲波功率300 W,1.2.3.1 中最優(yōu)料液比,乙醇濃度60%,浸提時間60 min為固定條件考察超聲時間為2、3、4、5、6 min時對樟樹葉中木脂素提取量的影響。

    1.2.2.3 乙醇濃度對樟樹葉木脂素提取量的影響以超聲波功率300 W,1.2.3.1 中最優(yōu)料液比,1.2.3.2中最優(yōu)超聲時間,浸提時間60 min為固定條件,考察乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%、100%時對樟樹葉中木脂素提取量的影響。

    1.2.2.4 浸提時間對樟樹葉木脂素提取量的影響以超聲波功率300 W,1.2.3.1 中最優(yōu)料液比,1.2.3.2中最優(yōu)超聲時間,1.2.3.3 中最優(yōu)乙醇濃度為固定條件,分別考察浸提時間為40、60、80、100、120 min時對樟樹葉中木脂素提取量的影響。

    1.2.3 響應面試驗設計 根據單因素實驗結果,以木脂素提取量為指標,采用Box-Behnken設計原理進行響應面試驗設計,優(yōu)化超聲波提取技術提取樟樹葉木脂素工藝條件,響應面試驗中各因素及水平見表1。

    表1 Box-Behnken試驗因素與水平設計Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

    1.2.4 木脂素提取量的測定 標準曲線制定:按照周海旭等[1]的測定方法進行測定。最終得到標準曲線為Y=0.0088X+0.1328,R2=0.9992,其中:X為標準液的濃度(mg/L),Y為吸光度值。

    樣品測定:稱取樟樹葉粉末1.0 g,置于50 mL的燒杯中,加入95%乙醇溶液20 mL,超聲輔助提取5 min(300 W),冷卻至室溫,常溫下浸提2 h,真空過濾后離心10 min,取上清液備用[21]。根據標準曲線制定方法測定樣品中木脂素的濃度,并參照李應洪等[22]的計算方法進行木脂素提取量的計算。計算公式如式(1)所示:

    其中:y—樟樹葉中木脂素提取量,mg/g;c—樟樹葉中木脂素濃度,mg/L;v—樣品體積,L;m—樟樹葉粉末質量,g。

    1.2.5 木脂素的純化及純度的計算 按照響應面實驗所得到的最優(yōu)組合進行多次提取,收集提取液進行濃縮后得到深綠色的膏狀物質。按照本團隊前期研究的方法[21]進行萃取、分離、純化,高效液相法進行純度鑒定。純度計算公式如式(2)所示:

    1.2.6 樟葉木脂素的抗氧化活性研究

    1.2.6.1 清除DPPH自由基的能力 參考Lu等[23]的方法并進行稍微修改。將處理好的樣品用無水乙醇溶解,VC溶液作為陽性對照。向DPPH乙醇溶液(3.5 mL,30 mg/L)中分別加入濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的提取液0.5 mL,于517 nm處測定吸光值(X1);向3.5 mL無水乙醇溶液中分別加入0.5 mL相同濃度的樣品溶液并測定吸光度(X2);向DPPH乙醇溶液(3.5 mL,30 mg/L)中加入0.5 mL無水乙醇溶液并測定其吸光值(X0),此為空白組。

    通過式(3)計算DPPH·清除率:

    其中:X1—樣品在DPPH溶液中的吸光值;X2—樣品在無水乙醇溶液中的吸光值;X0—空白組吸光值。

    1.2.6.2 清除·OH的能力 參考牛廣財等[24]的方法并進行稍微修改。向1 mL濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的樣品溶液中依次加入5 mmol/L鄰二氮菲0.6 mL,pH7.4 磷酸鹽緩沖液0.4 mL,0.01 mol/L FeSO4溶液0.3 mL,0.02 mol/LEDTA溶 液0.3 mL,蒸餾水0.6 mL,0.1%H2O20.8 mL于37 ℃下反應1 h,冷卻后于511 nm處測定吸光值A1(樣品)。同樣操作不加入樣品液和H2O2測定吸光值A2(未損傷);同樣操作不加入樣品液測定損傷吸光度值A0(損傷)通過以下公式計算清除率。VC溶液作為陽性對照。通過式(4)計算·OH清除率:

    1.2.7 MTS法測定木脂素的細胞毒性作用 利用MTS法檢測純化后樟葉木脂素對肝癌細胞HepG2和人臍靜脈內皮細胞HUVEC毒性作用。參照Ma等[25]方法進行測定。HepG2 和HUVEC細胞經過活化培養(yǎng)后,調整其細胞濃度分別為9×104、6×104個/mL。分別取100 μL于96 孔板中并于37 ℃下培養(yǎng)5 h。吸走舊培基,將含有不同終濃度樣品溶液的培養(yǎng)基(0、50、100、200、300、400 μg/mL)加入到96 孔板中并進行培養(yǎng)。顯微鏡下觀察經樣品處理后HepG2 和HUVEC細胞的狀態(tài)以確定培養(yǎng)時間。每個濃度重復3 次。培養(yǎng)完全后,避光下向各孔中加入 10 μL的MTS溶液并培養(yǎng)2 h。之后在490 nm處測定各孔的吸光度(OD值)。

    細胞生長存活率的計算方法如式(5)所示:

    1.3 數據處理

    每個實驗重復三次。實驗數據以Excel進行統(tǒng)計分析,并通過Origin 8.0 作圖;響應面試驗通過Design expert 8.0.5 進行實驗設計和數據統(tǒng)計分析。

    2 結果與分析

    2.1 單因素實驗

    2.1.1 料液比對樟葉木脂素提取量的影響 樟葉木脂素提取過程中主要受到擴散作用的影響,溶劑的量越大,則擴散速率越大[26]。由圖1 可知,料液比在1:5~1:20 g/mL范圍內,木脂素提取量隨著料液比的變化,木脂素提取量由6.89 mg/g增加到23.67 mg/g,當達到1:20 g/mL,木脂素提取量達到最大值,繼續(xù)改變料液比值,木脂素提取量降低,因此確定最適料液比為1:20 g/mL。

    圖1 料液比對木脂素提取量的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of lignans

    2.1.2 超聲時間對樟葉木脂素提取量的影響 從圖2可以看出,當超聲時間2~3 min時,木脂素提取量不斷增加,由27.69 mg/g增加到34.39 mg/g;當超聲時間超過3 min,木脂素提取量增加的幅度比較緩慢。這是因為超聲波破壞樟樹葉細胞,可以促進木脂素的提取。但當超聲時間大于3 min,木脂素提取量增加平緩。超聲時間太久,整個系統(tǒng)的溫度會逐漸升高,并且超聲時間延長會使部分木脂素被超聲剪切力降解或者高頻運動產熱降解,這將不利于木脂素的提取[27]。因此確定最適超聲時間為3 min。

    圖2 超聲時間對木脂素提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the yield of lignans

    2.1.3 乙醇濃度對樟葉木脂素提取量的影響 木脂素類物質屬于中等極性物質,根據相似相溶的原理,提取液濃度的極性不能太小。從圖3 中可以看出,當乙醇由50%到60%時,木脂素提取量由19.82 mg/g增加到31.54 mg/g。當乙醇濃度大于60%以后,木脂素提取量有所降低。因此確定最適乙醇濃度為60%。

    圖3 乙醇濃度對木脂素提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of lignans

    2.1.4 浸提時間對樟葉木脂素提取量的影響 從圖4中可以看出,在40~80 min內,隨著提取時間的增加,木脂素提取量由31.63 mg/g增加到37.94 mg/g;當提取時間超過80 min,隨著提取時間的增加,木脂素提取量呈降低趨勢,這可能是因為提取時間過長導致木脂素在空氣中暴露時間長,部分木脂素被氧化[28],所以確定最適提取時間為80 min最合適。

    圖4 提取時間對木脂素提取量的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of lignans

    2.2 響應面法優(yōu)化分析

    2.2.1 響應面試驗結果 根據單因素實驗結果,以考察的單因素為自變量,以木脂素提取量為響應值,利用響應面試驗進行分析,試驗設計及結果見表2。

    2.2.2 響應面回歸模型的建立 通過響應面相關軟件對表2 中的提取量進行擬合回歸,得到以下方程:

    表2 Box-Benhnken試驗設方案及結果Table 2 The program and result of Box-Benhnken experiment design

    Y=44.48+1.52A?1.02B+0.036C?1.60D+1.37AB?0.87AC?3.18AD+1.05BC?0.73BD?2.30CD?2.97A2?4.94B2?5.01C2?3.26 D2

    2.2.3 響應曲面分析 表3 中回歸模型的P<0.0001,表明該模型極為顯著,失擬項(P>0.05)不顯著,表明方程可以很好地分析數據[1]。因此可以利用該數學模型計算粗樟葉木脂素提取量[29]。R2=0.9861,說明木脂素提取量的變化中有98.61%來自于所選試驗因素,因此該回歸方程可以很好地描述各試驗因素與提取量之間的變化關系R2adj=0.9653,說明該模型能解釋96.53%響應值的變化[30]。

    由表3 可知,回歸方程中一次項A、B、D,二次項影響因素的P值均小于0.01,說明其對木脂素提取量的影響極為顯著;交互項因素影響P值均小于0.01,說明各個因素對木脂素提取量均具有極顯著性的影響且它們之間并非簡單的線性關系。F值表示各個變量對木脂素提取量的影響程度,F值越大,表明該因素的影響程度越大[31]。由表3 中F值大小可知,浸提時間對樟葉木脂素提取量的影響程度最大,乙醇濃度對樟葉木脂素提取量的影響程度最小。由圖5 可知,因素之間交互作用對木脂素提取量呈現的曲面圖均比較陡峭,說明了它們對木脂素提取量影響均比較顯著。

    圖5 料液比、超聲時間、乙醇濃度、浸提時間相互作用對樟葉木脂素提取量影響的曲面圖Fig.5 Response surface of the effect of the liquid-to-solid ratio,ultrasonic time,ethanol concentration,extraction time on the yield of lignans

    表3 木脂素提取量的方差分析結果Table 3 ANOVA analysis of the yield of lignans

    對回歸方程中的自變量求一階偏導從而得到四組二元一次方程[32]。對此方程組求解,得到A,B,C,D的 值分別為1:22.35 g/mL,3.09 min,63%,78.4 min,在此條件下木脂素提取量45.39 mg/g。為了方便實驗的進行各個變量最終取值為料液比1:22 g/mL,超聲時間3 min,乙醇濃度60%,提取時間78 min。

    利用所選取的最優(yōu)條件來驗證實驗模型的可靠性。在最優(yōu)條件下進行5 次試驗,木脂素提取量的平均值為45.31 mg/g,這與樟葉木脂素提取量理論值45.39 mg/g基本相同,相對誤差為0.16%,證明了該模型可以用來預測樟樹葉中木脂素的提取量。

    2.3 樟葉木脂素純度分析

    粗木脂素經過AB-8 大孔樹脂、硅膠柱色譜純化。運用紫外色譜、紅外光譜、質譜、核磁共振等方法進行結構鑒定[21],最終得到松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷(圖6)、芝麻素(圖7)。

    采用外標法對松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷的純度進行判定。由圖6A中可以看出在0.2~1.0 mg/mL范圍內隨著樣品濃度的增加,峰值也逐漸增加。峰高與標準品之間存在線性關系,其線性回歸方程:y=108.73x?0.124,R2=0.999,其中x表示標準品的濃度(mg/mL)。圖6B表示樣品中松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷峰高為82.9 mV。根據回歸方程可得松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷純度為90.14%。

    圖6 不同標準品濃度(A)和樟葉中松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷(B)的液相圖Fig.6 HPLC chromatograms of different concentrations of standard sample (A) and the pinoresinol-β-D-glucoside from Cinnamomum camphora leaves (B)

    由圖7A中可以看出0.2~1.0 mg/mL濃度范圍內隨著標準樣品濃度的增加,峰值也逐漸增加。內嵌圖表明峰高與標準品存在線性關系,回歸方程為y=90.70x+3.16,R2=0.996。圖7B表示樣品中芝麻素峰高為104.6 mV。根據回歸方程可以求出芝麻素的純度為94.84%。

    圖7 不同標準品濃度(A)和樟葉中芝麻素(B)的液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatograms of different concentrations of standard sample (A) and the sesamin from Cinnamomum camphora leaves (B)

    2.4 樟葉木脂素的抗氧化性研究

    2.4.1 清除DPPH自由基的作用 DPPH法是一種被國內外廣泛應用于評價天然物質抗氧化效果的方法。DPPH清除自由基的原理是指在含氫天然抗氧化物質存在下,DPPH將被還原為DPPH-H,從而導致試劑的顏色發(fā)生褪色[33]。研究表明,多糖屬于氫供體物質,可與自由基反應以生成更穩(wěn)定的產物[34]。從圖8 可知在濃度0.2~1.0 mg/mL范圍內隨著脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、芝麻素、VC濃度的增加,DPPH自由基清除率也在增加。由圖可知,VC對DPPH自由基的清除效果優(yōu)于木脂素,并且清除DPPH自由基的IC50小于0.2 mg/mL;松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷清除自由基的線性方程為y=51.84x+34.19,R2=0.906,經計算松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷清除DPPH自由基的IC50為0.31 mg/mL;芝麻素清除自由基的線性方程為y=50.84x+21.99,R2=0.994,經計算芝麻素清除DPPH自由基的IC50為0.55 mg/mL。由此可知樟葉木脂素具有良好的清除DPPH自由基能力;從IC50值可知清除DPPH自由基的能力為VC>松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷>芝麻素。

    圖8 芝麻素和松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷對DPPH自由基清除作用Fig.8 Effect of sesamin and pinoresinol-β-D -glucoside on DPPH free radical

    2.4.2 清除羥基自由基的作用 由圖9 可知,VC和木脂素物質對羥基自由基具有強烈的清除效果。VC清除羥基自由基的線性方程為y=95.45x?1.34,R2=0.966,經該方程計算VC的IC50為0.54 mg/mL;松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷清除羥基自由基的線性方程為y=86.31x?11.76,R2=0.984,經計算松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷清除羥基自由基的IC50為0.71 mg/mL;芝麻素清除自由基的線性方程為y=67.31x?12.96,R2=0.974,經計算芝麻素清除羥基自由基的IC50為0.94 mg/mL。根據IC50值的大小可以看出VC清除羥基自由基的能力最強,其次是松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷,最后是芝麻素。松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷與芝麻素清除羥基自由基的差異可能是因為兩者分子結構存在差異。例如羥基數量越多,抗氧化性能越強;葡萄糖苷配基的數量多,抗氧化性能越強[35]。

    圖9 芝麻素和松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷對羥基自由基清除作用Fig.9 Effect of sesamin and pinoresinol-β-D -glucoside on ·OH radical

    2.5 細胞毒性作用

    采用MTS法檢測松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、芝麻素對肝癌細胞和HUVEC細胞生長抑制作用,結果如圖10、圖11 所示。由圖10 可知,隨著松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、芝麻素濃度的不斷增加,HepG2 細胞存活率逐漸減少。兩者濃度在0~400 μg/mL范圍內,芝麻素對肝癌細胞的生長抑制作用強于松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷。由圖11 可知芝麻素對HUVEC的毒性作用大于松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷。因此,如果將芝麻素應用于食品當中,它不僅對肝癌細胞有作用還對人體的正常細胞HUVEC有毒性作用;而松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷對HUVEC毒性作用則相對小些。這主要跟芝麻素和松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷影響細胞周期及凋亡過程中的相關蛋白和基因的表達有關。楊永丹[36]研究芝麻素對肝癌細胞的影響,結果表明芝麻素可以影響細胞周期蛋白Cyclin A和Cyclin B的轉錄與表達,增強抑癌基因p53、p21 和促凋亡因子Bax的表達量。

    圖10 芝麻素與松脂素-β-D-葡萄糖苷對肝癌細胞HepG2 的影響Fig.10 Effect of sesamin and pinoresinol-β-D-glucoside on HepG2 cells

    圖11 芝麻素與松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷對人臍靜脈內皮細胞HUVEC的影響Fig.11 Effect of sesamin and pinoresinol-β-D-glucoside on HUVEC cells

    3 結論

    本實驗在單因素實驗的基礎上,根據響應面優(yōu)化試驗條件得到樟葉木脂素的超聲輔助提取最優(yōu)工藝條件:料液比1:22 g/mL、超聲時間3 min、乙醇濃度60%、提取時間78 min條件下,木脂素提取量45.31 mg/g。經驗證,實際值與預測值之間的相對誤差僅為0.16%,表明了該模型具有較高實用性。粗提物經過分離純化、結構鑒定后確定出兩種木脂素類物質即芝麻素、松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷。利用高效液相色譜法確定芝麻素、松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷的純度分別為94.84%和90.14%。對所得的木脂素進行抗氧化活性研究表明了芝麻素、松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷對DPPH自由基和羥基自由基有較好的清除效果,且清除效果隨著濃度的增加而增加;MTS實驗表明芝麻素、松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷均對HepG2、HUVEC有不同程度的抑制作用,其中芝麻素對肝癌細胞的毒性作用強于松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷,這可能與兩者之間的結構有關系,需要進一步的研究。芝麻素、松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷對肝癌的毒性作用機理需要深入研究。

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