皂化處理對中華管鞭蝦蝦青素提取物的蝦青素組成和體外抗氧化性的影響

賈 喆，張肖瑕，劉欣妍，許 艷，宋 茹

（浙江海洋大學食品與藥學學院,浙江舟山 316022）

中華管鞭蝦（Solenocera crassicornis）俗名紅蝦，外殼呈粉紅色，廣泛分布于我國黃海、南海及日本、印度尼西亞等海域，屬于一年生底棲甲殼動物[1]。中華管鞭蝦營養(yǎng)豐富、味甜鮮美，是我國重要的海捕蝦、經(jīng)濟蝦種類之一，大部分加工成蝦仁出口。但是，中華管鞭蝦在加工過程中產(chǎn)生30%～50%包括蝦頭、蝦殼等在內(nèi)的副產(chǎn)物同樣含有大量的營養(yǎng)成分，而這些副產(chǎn)物目前主要被用作低值飼料原料，深加工利用還較少，未充分挖掘其中的經(jīng)濟價值[2]。

蝦青素（astaxanthin，Asta）化學名稱3,3′-二羥基-4,4′-二酮基-β,β′-胡蘿卜素[3?5]，是一種橙紅色酮式類胡蘿卜素。蝦青素具有抗氧化、抗腫瘤、抗癌等多種生理功效[4?6]，其抗氧化性比β-胡蘿卜素及葉黃素強10 倍，比天然維生素E強100 倍[7?8]。因此，蝦青素在食品添加劑、醫(yī)藥、化妝品等領域有著廣泛應用。蝦青素分子含有兩個六元環(huán)結構，六元環(huán)上的羥基能夠與脂肪酸結合形成蝦青素脂肪酸酯（Astaxanthin esters），根據(jù)結合脂肪酸數(shù)量不同，又可以分為蝦青素單酯（Astaxanthin monoesters）和蝦青素雙酯（Astaxanthin diesters）[9?10]。同時，由于六元環(huán)結構中兩個手性中心的存在，可以使蝦青素產(chǎn)生三種光學異構體，即左旋（3S,3′S）、內(nèi)消旋（3S,3′R）和右旋（3R,3′R）[11?12]。蝦青素可以用化學法合成，也可以直接從藻類、酵母和甲殼類動物中提取天然蝦青素。化學合成蝦青素的抗氧化活性遠低于天然蝦青素，如：自由基消除能力比天然蝦青素低20 倍，淬滅單線態(tài)氧能力比天然蝦青素低50 倍[13]。此外，化學合成的蝦青素不可避免會有化學雜質(zhì)殘留問題，因此在食品中使用會受到一定程度限制[14?15]。

中華管鞭蝦的蝦青素提取物有顯著的抗氧化活性，且以酯型蝦青素為主[16?17]。因為游離型蝦青素化學結構比酯型蝦青素簡單，所以易通過一些修飾改性技術制備天然蝦青素高級產(chǎn)物[18?19]。蝦青素酯類經(jīng)皂化或酯酶水解轉化為游離型蝦青素，其中酶水解法所得副產(chǎn)物少，但是成本高。而皂化法需要嚴格控制皂化時間，否則蝦青素會發(fā)生嚴重降解。Su等[20]報道采用低溫皂化法將酯型蝦青素轉化為游離型蝦青素，經(jīng)低溫皂化后的蝦青素降解率低，且副產(chǎn)物生成量少。本研究以中華管鞭蝦的蝦殼為原料，采用低溫皂化法轉化蝦青素提取物中酯型蝦青素，系統(tǒng)研究皂化時間對蝦青素總量、抗氧化活性、游離型和酯型蝦青素相對含量和蝦青素光學異構體組成影響，旨在為中華管鞭蝦的蝦青素綜合應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮中華管鞭蝦 華潤萬家超市；人工合成蝦青素標準品（3S,3′S:3S,3′R:3R,3′R=1:2:1）純度>99%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）日本和光純業(yè)株式會社；羥自由基測試盒、總抗氧化能力測試盒 南京建成生物工程研究所；二氯甲烷、甲醇、甲基叔丁基醚、乙腈 色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑 分析純，上海國藥集團。

SSW-600-2S型電熱恒溫水槽 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；UV-5900 型紫外可見分光光度計 上海源喜儀器有限公司；RE-2000A型旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SM800 型酶標儀 上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司；Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀 德國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蝦青素提取 參考文獻[19]并適當修改，具體如下：新鮮中華管鞭蝦取殼、破碎，按照1:5（m:v）比例加入無水乙醇，37 ℃水浴振蕩提取1 h，然后6000×g離心10 min，收集上清液，沉淀重復提取2 次，合并上清液，旋轉蒸發(fā)濃縮，按1:2（v:v）比例加入石油醚萃取3 次，收集石油醚層，經(jīng)旋轉蒸發(fā)濃縮后，避光冷凍干燥24 h，干燥物充氮氣，?20 ℃保藏備用。

1.2.2 皂化處理 參考Su等[20]方法并適當修改，具體如下：蝦青素提取物用無水乙醇復溶，按4:1（v:v）比例加入0.105 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液，5 ℃水浴下分別皂化0、2、4、6、12 h，按1:2.5（v:v）加入去離子水終止反應。石油醚萃取皂化液3 次至基本無色，合并石油醚層，經(jīng)旋轉蒸發(fā)濃縮后，避光冷凍干燥24 h，干燥物充氮氣，?20 ℃保藏備用。

1.2.3 蝦青素濃度測定 采用齊宇等[21]分光光度法，將凍干的皂化和未皂化蝦青素提取物用無水乙醇復溶后，經(jīng)6000×g離心10 min，取上清液測定477 nm下吸光值（y），根據(jù)蝦青素標準曲線y=0.0947x+0.0108（R2=0.9926）計算樣品中蝦青素濃度（μg/mL）。

1.2.4 游離型和酯型蝦青素分析 參考Yuan等[22]方法，具體條件如下：采用ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫25 ℃，流動相A為二氯甲烷:甲醇:乙腈:水=5:85:5.5:4.5（v:v:v:v），流動相B為二氯甲烷:甲醇:乙腈:水=22:28:45.5:4.5（v:v:v:v），進樣量10 μL，0～10 min用100%流動相A洗脫，10～20 min用0～100%流動相B線性洗脫，20～35 min用100%流動相B洗脫，35～45 min用100%～0 流動相B線性洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長477 nm。蝦青素標準品（游離型）（40 μg/mL）在上述條件下洗脫，提取物中游離型與酯型蝦青素相對濃度按照公式（1）計算：

式中：C表示游離型、酯型蝦青素相對濃度，μg/mL；S表示游離型或酯型蝦青素總峰面積，mAU·s；S標準表示蝦青素標準品總峰面積，mAU·s；C標準表示蝦青素標準品濃度，μg/mL。

1.2.5 蝦青素光學異構體分析 采用楊澍[23]高效液相色譜法分析，具體條件如下：采用Chiralpak IC色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），進樣體積10 μL，甲基叔丁基醚（MBTE）/乙腈（95:5，v:v）為洗脫劑，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長477 nm。

人工合成蝦青素標準品（3S,3′S:3S,3′R:3R,3′R=1:2:1）用無水乙醇溶解，制備50 μg/mL工作液，然后用無水乙醇依次稀釋成40、30、20、10、5 μg/mL使用液，采用Chiralpak IC色譜柱分離，以各異構體的濃度（μg/mL）為橫坐標（x），峰面積（y）為縱坐標，將3S,3′S、3S,3′R和3R,3′R蝦青素異構體的濃度和峰面積進行擬合，得到三種光學異構體回歸方程，結果見表1。

表1 蝦青素三種光學異構體回歸方程Table 1 Standard curves of three Asta optical isomers

1.2.6 體外抗氧化性分析

1.2.6.1 清除DPPH自由基能力 參照Bersuder等[24]方法進行：將皂化（0～12 h）蝦青素提取物、無水乙醇和0.02%DPPH乙醇液，按1:4:1（v:v:v）混合，室溫下避光放置60 min，無水乙醇調(diào)零，測定517 nm處吸光值（A樣品），樣品對DPPH自由基清除率按照公式（2）計算：

式中：A對照用等體積無水乙醇代替樣品，A樣品空白用等體積無水乙醇代替0.02%DPPH乙醇液。

1.2.6.2 羥自由基清除能力及總抗氧化能力 使用羥自由基測試盒和總抗氧化能力測試盒測定，結果以U/μg蝦青素表示。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Origin 2018 軟件繪制圖形，結果以平均值±標準差（n=3）表示。采用SPSS19.0 軟件對組間差異性進行分析，P<0.05 表示差異顯著。

2 結果與討論

2.1 皂化時間對蝦青素濃度影響

由圖1 可知，中華管鞭蝦的蝦青素提取物在477 nm處有最大吸收峰，皂化處理可以提高提取物的蝦青素濃度，其中皂化2 和4 h時，總蝦青素濃度分別達到8.71 和8.79 μg/mL，顯著高于未皂化的蝦青素濃度（P<0.05）。當皂化超過6 h時，總蝦青素濃度開始顯著下降（P<0.05），其中皂化12 h時，總蝦青素濃度降至4.66 μg/mL。圖1A光譜掃描結果顯示蝦青素提取物除了在477 nm有蝦青素特征吸收峰外，在280 nm附近吸收峰明顯，說明提取物中含有大量蛋白質(zhì)和肽類物質(zhì)。蝦蟹殼中蝦青素通常與蛋白質(zhì)結合在一起，活體蝦蟹殼表現(xiàn)為藍紫或青綠色[25]。圖1B中皂化2 和4 h時，提取物中總蝦青素濃度顯著高于未皂化的蝦青素（P<0.05），推測與皂化條件下蝦青素結合蛋白質(zhì)發(fā)生水解，釋放出來的蝦青素導致提取物中總蝦青素濃度增加有關。但是，當皂化時間過長時，蝦青素會發(fā)生不同程度的降解，結果導致提取物中總蝦青素濃度降低。Su等[20]報道了低溫皂化處理會導致半蝦紅素、蝦紅素及其它降解產(chǎn)物生成量增加，結果造成總蝦青素濃度降低。本研究采用分光光度法測定不同皂化時間下總蝦青素濃度變化，雖然未進一步檢測皂化物中蝦青素降解物的含量變化，但是從圖1B也能夠看出當皂化時間過長時，總蝦青素濃度急劇降低。

圖1 蝦青素提取物紫外可見光譜掃描及皂化時間對總蝦青素濃度影響Fig.1 UV-visible full wavelength scan of Asta extracts and effect of saponification time on the total concentration of Asta

2.2 皂化時間對蝦青素體外抗氧化活性影響

不同皂化時間下，蝦青素提取物的DPPH自由基清除率、羥自由基清除能力和總抗氧化性變化如圖2 所示。圖2A中，皂化2 h時，蝦青素提取物對DPPH自由基的清除率最高達到25.85%，顯著高于未皂化的15.16%（P<0.05）。隨著皂化時間的延長，蝦青素提取物清除DPPH自由基能力開始急劇下降，其中皂化6 h和12 h時蝦青素提取物對DPPH自由基清除率僅為5.75%和1.81%。同樣，皂化時間對蝦青素提取物的羥自由基清除能力和總氧化性也有顯著性影響，但是與DPPH自由基清除率呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。圖2B中隨著皂化時間的延長，蝦青素提取物對羥自由基的清除效果呈上升趨勢，其中皂化4～12 h時羥自由基清除能力無統(tǒng)計學上差異（P>0.05），皂化6 h時清除效果最強，為3.17 U/μg。而圖2C中蝦青素在皂化6 h時，總抗氧化能力最高達到0.62 U/μg，之后皂化時間延長至12 h時，總抗氧化能力急劇降低至0.133 U/μg。圖2 結果進一步說明不同皂化時間下，蝦青素提取物的抗氧化性發(fā)生變化，但是與總蝦青素濃度變化（圖1B）并未表現(xiàn)出完全的一致性，如：經(jīng)6 和12 h皂化，蝦青素提取物的總蝦青素濃度低于皂化2 和4 h的蝦青素濃度，同樣皂化6 和12 h的蝦青素提取物對DPPH自由基清除率顯著低于其他皂化時間下的DPPH自由基清除率（P<0.05）。皂化4～12 h時，提取物的總蝦青素濃度表現(xiàn)出差異性（圖1B），但是對羥自由基清除能力無統(tǒng)計學上差異（P>0.05）。因此，本研究進一步分析了不同皂化時間下蝦青素提取物中游離型和酯型蝦青素相對濃度變化。

圖2 不同皂化時間下蝦青素提取物的抗氧化能力比較Fig.2 Comparison of antioxidant activities of Asta extracts after saponification for different time

2.3 皂化時間對游離型和酯型蝦青素的影響

采用高效液相色譜分離法可以直觀看出酯型蝦青素轉化為游離型蝦青素程度[22]，中華管鞭蝦的蝦青素提取物經(jīng)過不同時間皂化后蝦青素的分布變化如圖3 所示。蝦青素酯化后疏水性增強，而雙酯又強于單酯，因此HPLC采用C18柱分析檢測蝦青素時，依次洗脫下來游離型蝦青素、蝦青素單酯、蝦青素雙酯[26]。通過對比標準品及參考文獻[17]確定未皂化的中華管鞭蝦的蝦青素提取物中含有游離型蝦青素（其中峰1～3 分別為全反式蝦青素、9-順異構體、13-順異構體）和酯型蝦青素。隨著皂化的進行，蝦青素提取物中游離型蝦青素中的全反式、9-順式和13-順式峰值增加明顯，當皂化6 h時，蝦青素提取物中的酯型蝦青素峰明顯減少，至皂化12 h時完全消失。圖3 結果表明經(jīng)過6～12 h皂化處理，蝦青素提取物中酯型蝦青素基本完全轉為游離型蝦青素。

圖3 不同皂化時間下蝦青素提取物中游離型和酯型蝦青素分布情況Fig.3 Distribution of free Asta and Asta esters in the Asta extracts after saponification for different time

由圖4 可知，未皂化中華管鞭蝦的蝦青素提取物中酯型蝦青素相對濃度顯著高于游離型蝦青素（P<0.05）。經(jīng)過皂化后，酯型蝦青素轉化為游離型蝦青素效果顯著，其中皂化2 h時游離型蝦青素相對濃度由皂化前的8.14 μg/mL增至27.11 μg/mL，而酯型蝦青素則由10.20 μg/mL降至5.60 μg/mL（P<0.05）。當皂化時間大于6 h，游離型蝦青素的相對濃度趨于穩(wěn)定，保持在34 μg/mL左右。提取物中的酯型蝦青素在皂化12 h時基本水解完全，但皂化物中游離型蝦青素相對濃度無顯著性增加（P>0.05），應與長時間皂化處理游離型蝦青素發(fā)生部分降解有關。因此，要合理控制皂化時間。

圖4 不同皂化時間下蝦青素提取物中游離型和酯型蝦青素相對濃度比較Fig.4 Comparison of relative concentration of free Asta and Asta esters in the Asta extracts after saponification for different time

2.4 皂化時間對蝦青素光學異構體濃度影響

人工合成蝦青素是三種光學異構體的混合物（3S,3′S:3S,3′R:3R,3′R=1:2:1）[27]，在 Chiralpak IC手性柱上洗脫順序為3S,3′S、3S,3′R、3R,3′R[23]。自然界不同生物體的蝦青素光學異構體組成存在明顯差異，如：雨生紅球藻主要為3S,3′S型[28]，紅發(fā)夫酵母中蝦青素光學異構體主要是3R,3′R型[29]，三文魚中蝦青素光學異構體以3S,3′S為主[30]，甲殼動物對蝦和螃蟹則是存在較為獨特的3S,3′S/3S,3′R/3R,3′R異構體混合物[29]。從圖5 結果可以看出：未皂化的中華管鞭蝦的蝦青素提取物中含有上述三種光學異構體，并且以3S,3′S和3S,3′R為主。當皂化2 h時，三種光學異構體的峰高及峰面積增加明顯，說明蝦青素脫酯及脫蛋白后有助于三種光學異構體含量增加。

圖5 不同皂化時間蝦青素提取物中光學異構體分布比較Fig.5 Distribution comparisons of three Asta optical isomers in the Asta extracts after saponification for different time

進一步分析了不同皂化時間下，蝦青素提取物中三種光學異構體的濃度和相對含量變化，結果見圖6，其中，圖6A為三種光學異構體濃度隨時間變化關系，圖6B為不同皂化時間下三種光學異構體相對含量變化。從圖6A可知，皂化處理后蝦青素提取物中三種光學異構體濃度增加顯著，皂化2 h時3S,3′S濃度由未皂化的2.41 μg/mL增加到13.83 μg/mL，3R,3′R也從低于檢出限增至5.66 μg/mL。皂化時間大于2 h，三種光學異構體的濃度并未隨著皂化時間的延長而快速增加。皂化至12 h時，3S,3′S、3S,3′R和3R,3′R濃度依次為16.65、12.47和8.63 μg/mL，與皂化2 h時相比仍有顯著性提高（P<0.05）。進一步比較了三種光學異構體間比例組成發(fā)現(xiàn)（圖6B）：皂化2 h時，3S,3′S、3S,3′R和3R,3′R的相對含量分別為49.27%±2.98%、30.54%±0.24%和20.19%±4.53%，即：3S,3′S:3S,3′R:3R,3′R的相對含量比為2.4:1.5:1.0。而皂化12 h時，3S,3′S:3S,3′R:3R,3′R相對含量比為2.4:1.7:1.0，表明皂化過程中游離型蝦青素三種光學異構體間的相對含量比較為穩(wěn)定，并未隨著皂化時間的變化而發(fā)生明顯變化。

圖6 不同皂化時間蝦青素提取物中光學異構體的濃度及相對含量比較Fig.6 Comparisons of Asta optical isomers concentrations and relative contents in the Asta extracts after saponification for different time

2.5 不同皂化時間下提取物中光學異構體濃度與抗氧化能力相關性分析

蝦青素提取物經(jīng)過皂化，總蝦青素濃度、體外抗氧化能力及蝦青素組成均發(fā)生了改變（見圖1～圖6）。據(jù)報道蝦青素的三種光學異構體表現(xiàn)出不同的抗氧化能力[31?32]，所以實驗進一步研究了皂化處理后，提取物中蝦青素3S,3′S、3S,3′R和3R,3′R三種光學異構體濃度與羥自由基清除能力關系，結果見圖7。

圖7 不同皂化時間下蝦青素提取物中三種光學異構體濃度與羥自由基清除能力關系Fig.7 Relationships between the three Asta optical isomers concentrations and scavenging hydroxyl radicals of the Asta extracts after saponification for different time

圖7 結果表明，不同皂化時間下，蝦青素提取物的羥自由基清除能力與三種光學異構體濃度有較為顯著的線性相關性（P<0.05），說明蝦青素提取物的羥自由基清除能力與三種光學異構體有明顯的劑量依賴性。當清除羥自由基能力相近時，所需光學異構體濃度越低，表示該異構體的抗氧化能力越強，可以看出蝦青素提取物中蝦青素光學異構體對羥自由基清除能力依次為：3R,3′R>3S,3′R>3S,3′S，即：皂化后中華管鞭蝦的蝦青素提取物中3R,3′R羥自由基清除能力強于另外兩種光學異構體。張瑞蓮[32]報道蝦青素三種光學異構體抑制亞油酸自動氧化的能力為3S,3′S=3R,3′R>3S,3′R，說明不同來源的蝦青素光學異構體在不同抗氧化評價體系中會表現(xiàn)出不同的抗氧化能力。一般來講，外消旋型蝦青素（3S,3′S和3R,3′R）的抗氧化活性強于內(nèi)消旋型（3S,3′R）[27]，而本研究中蝦青素內(nèi)消旋體3S,3′R也表現(xiàn)出較強的羥自由基清除能力，推測可能與皂化物中三種光學異構體之間的相互協(xié)同作用有關，具體還需后續(xù)實驗深入研究。

3 結論

中華管鞭蝦的蝦青素提取物經(jīng)適當皂化處理，可以明顯提高蝦青素濃度及體外抗氧化活性，其中皂化2～4 h，總蝦青素濃度在8.70 μg/mL左右，DPPH自由基清除能力在皂化2 h達到25.85%，而皂化6 h時蝦青素提取物的羥自由基和總抗氧化能力分別達到3.17 和0.62 U/μg。HPLC分析結果表明皂化前2 h時，酯型蝦青素快速轉化為游離型蝦青素，且3S,3′S、3S,3′R和3R,3′R三種光學異構體生成速率高。中華管鞭蝦的蝦青素的光學異構體以3S,3′S型為主，不同皂化時間下蝦青素提取物中3S,3′S:3S,3′R:3R,3′R的相對含量比保持在2.4:1.5～1.7:1.0 之間。研究發(fā)現(xiàn)中華管鞭蝦的蝦青素提取物中的三種光學異構體與羥自由基清除表現(xiàn)出較強的線性相關性，且3R,3′R清除羥自由基能力最強。皂化后蝦青素各異構體間相互作用，以及與生物活性關聯(lián)性有待于進一步研究。