空氣中顆粒物對耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響

王麗芳， 孫紅衛(wèi)， 董輝偉， 陳鄭珊， 譚 蓉， 程春燕， 楊 棟*， 李君文*

(濱州醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與管理學(xué)院， 山東煙臺(tái) 264000)

顆粒物又稱粉塵，是空氣污染物的主要成分，顆粒物根據(jù)空氣動(dòng)力學(xué)直徑分為粗顆粒物(空氣動(dòng)力學(xué)直徑≤10 μm，PM10)，細(xì)顆粒物(空氣動(dòng)力學(xué)直徑≤2.5 μm，PM2.5)和超細(xì)顆粒物(空氣動(dòng)力學(xué)直徑≤0.1 μm，PM0.1)〔1-2〕。三者統(tǒng)稱為可吸入顆粒物，根據(jù)空氣動(dòng)力學(xué)直徑的大小決定其在呼吸系統(tǒng)沉積部位，PM10主要沉積在上呼吸道〔3〕，PM2.5和PM0.1可到達(dá)肺部,進(jìn)而影響人體的健康。流行病學(xué)研究表明，顆粒物不僅影響呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)、而且還可以通過影響體內(nèi)的物質(zhì)代謝進(jìn)而影響肝臟、腎臟以及腸道菌群〔4〕。空氣中顆粒物成分復(fù)雜多樣，主要包括有機(jī)碳(OC)、碳單質(zhì)(EC)、金屬元素、水溶性無機(jī)離子、細(xì)菌、內(nèi)毒素、抗生素耐藥基因(ARGs)等〔5-9〕。而不同時(shí)間、不同區(qū)域顆粒物的成分也存在差異，而其成分影響其毒性結(jié)果〔10-11〕。 細(xì)菌主要通過自身基因突變和水平轉(zhuǎn)移的方式獲得耐藥性，細(xì)菌自發(fā)突變率低，且不穩(wěn)定，而后者是細(xì)菌獲得耐藥性的主要方式。細(xì)菌間發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移主要有3種方式：接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)。接合轉(zhuǎn)移是環(huán)境中耐藥基因水平轉(zhuǎn)移最常見、最有效的方式，對細(xì)菌耐藥性的獲得具有重要作用〔12〕。土壤和水環(huán)境中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種耐藥基因甚至多重耐藥基因〔13-16〕，隨著人們對顆粒物成分研究的不斷加深，空氣中耐藥基因的擴(kuò)散和傳播引起人們的關(guān)注。本研究主要探討空氣中不同粒徑顆粒物對耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響。從而制定有效的環(huán)境保護(hù)措施，進(jìn)而減少耐藥基因的擴(kuò)散和傳播。

1 材料和方法

1.1 菌株和試劑

1.1.1菌種 供體菌為帶有RP4質(zhì)粒的大腸埃希菌E.coli MG1655，具有卡那霉素(Km)、氨芐青霉素(Amp)以及四環(huán)素(Tc)三重抗性。受體菌為具有美羅培南(Mem)抗性的肺炎克雷伯菌。菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2抗生素 Tc溶液(購置上海生工生物工程有限公司)，濃度50 mg/mL，用0.22 μm濾膜過濾后，-20 ℃保存 ，備用。Mem購置北京索萊寶科技有限公司，用滅菌水配置成濃度為5 mg/mL溶液，用0.22 μm濾膜過濾后，-20 ℃保存 ，備用。

1.1.3顆粒物 PM0.1用納米二氧化硅替代，購置Sigma公司。PM2.5、PM10購置美國Protein Technologies Inc(PTI)。SRM 1648a Urban Particulate Matter(1648a)：美國城市顆粒物標(biāo)準(zhǔn)品，購置東莞市景源實(shí)驗(yàn)科技有限公司。

1.1.4培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基：稱取10 gNaCL、10 g胰蛋白胨和5 g酵母粉(購置美國BD公司)，溶于1 L蒸餾水中，充分搖晃，混合均勻后，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后保存于4 ℃冰箱待用。LB瓊脂培養(yǎng)基：主要成分與LB液體培養(yǎng)基成分相同，在LB液體培養(yǎng)基溶解后再加入15 g瓊脂粉(購置上海生工生物工程有限公司)，121 ℃，20 min高壓滅菌后冷卻備用。使用前加熱煮沸，待冷卻至50 ℃左右加入抗生素?fù)u勻使用。

1.1.5試劑和儀器 0.9%的生理鹽水：稱取氯化鈉9 g(購置天津市匯杭化工科技有限公司)溶于1 L蒸餾水中，121 ℃，20 min高壓滅菌后冷卻備用?；钚匝?ROS)測定試劑盒購置南京建成生物工程研究所。

1.2 接合實(shí)驗(yàn)將大腸埃希菌(RP4)接種于含有40 μg/mL Tc的LB培養(yǎng)基中，肺炎克雷伯接種于含有2 μg/mL Mem的LB培養(yǎng)基，在37 ℃，150 rpm，搖床過夜培養(yǎng)16小時(shí)后，6000 rpm/5 min離心。用生理鹽水清洗重懸2次，測OD600值，調(diào)整菌液濃度。取等量的供體菌和受體菌，各4.75 mL,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.1不同濃度顆粒物對耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響 (1)不同濃度的PM0.1對耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響。取9.5 mL初始濃度為108 CFU/mL供體菌和受體菌混合液5份，向其中4份分別加入0.5 mL濃度分別為1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL的PM0.1(納米二氧化硅)儲(chǔ)備液，使其終濃度分別達(dá)到62.5 μg/mL、125 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL，向剩余的1份中加入0.5 mL生理鹽水作為空白對照。將所有的接合菌液混勻后，迅速置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行接合，每2個(gè)小時(shí)混勻1次，接合8 h后取出進(jìn)行接合子篩選。(2)不同濃度的PM2.5、PM10和1648a對耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響。PM2.5、PM10和1648a實(shí)驗(yàn)條件和PM0.1保持一致。

1.3 接合子的篩選和鑒定把接合體系稀釋到一定濃度，用含有60 μg/mL的Tc和6 μg/mL的Mem LB固體培養(yǎng)基傾注平板篩選接合子。用6 μg/mL的Mem LB固體培養(yǎng)基傾注平板篩選受體菌。平板至于37 ℃培養(yǎng)箱36小時(shí)。計(jì)算接合子和受體菌的數(shù)量。為檢驗(yàn)選擇平板篩選的耐藥細(xì)菌均為接合子，排除E.coli MG1655(RP4)或肺炎克雷伯菌自發(fā)突變子的干擾，本實(shí)驗(yàn)在設(shè)立上述組別的同時(shí)還分別設(shè)立E.coli MG1655(RP4)對照組和肺炎克雷伯菌對照組，各對照組分別加入上述濃度的顆粒物處理,篩選方法與實(shí)驗(yàn)組相同。在雙抗篩選出的平板上，隨意挑單克隆在含有60 μg/mL的Tc和6 μg/mL的Mem LB進(jìn)行培養(yǎng)，觀察細(xì)菌的生長情況。

1.4 接合頻率的計(jì)算接合轉(zhuǎn)移率計(jì)算公式如下：F=No.t/No.m；F.接合轉(zhuǎn)移頻率，No. t.接合子數(shù)量(cfu/mL)，No.m.受體菌數(shù)量(cfu/mL)。

1.5 顆粒物對細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響使用DCFH-DA探針，按照制造商說明書測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。使用酶標(biāo)儀檢測激發(fā)波長500，發(fā)射波長525處的ROS水平。并通過實(shí)驗(yàn)組和對照組的熒光強(qiáng)度比值進(jìn)行評價(jià)。

2 結(jié)果

2.1PM0.1、PM2.5、PM10對耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響對照組接合轉(zhuǎn)移率為2.48×10-5，隨著PM0.1、PM2.5、PM10、1648a濃度的增加，耐藥基因的接合轉(zhuǎn)移率先增加后下降。濃度為62.5 μg/mL、125 μg/mL、250 μg/mL時(shí)，PM0.1、PM2.5、PM10、1648a對耐藥基因接合轉(zhuǎn)移表現(xiàn)出促進(jìn)作用，其中PM0.1組接合轉(zhuǎn)移率2.85×10-5～1.94×10-4;2.38×10-5～1×10-4;1.43×10-5～4.64×10-4。PM2.5組接合轉(zhuǎn)移率2.03×10-5～2.04×10-4;2.37×10-5～2.59×10-4;1.34×10-5～2.34×10-4。PM10組接合轉(zhuǎn)移率3.19×10-5～3.07×10-4;3.59×10-5～2.77×10-4;4.4×10-5～3.12×10-4。1648a組接合轉(zhuǎn)移率2.14×10-5～3×10-4;5.8×10-5～4.9×10-4;6.7×10-5～4.85×10-4。當(dāng)濃度為500 μg/mL，四者對耐藥基因的接合轉(zhuǎn)移都表現(xiàn)出抑制作用，但都無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這一結(jié)果表明顆粒物對耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的作用與顆粒物濃度和空氣動(dòng)力學(xué)直徑有關(guān)。見圖1。

圖1 不同濃度不同顆粒物對耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響(*P<0.05)

2.2 活性氧含量顆粒物干預(yù)后，供體菌細(xì)胞內(nèi)ROS明顯升高，且與對照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。受體菌細(xì)胞內(nèi)ROS變化不明顯，有時(shí)甚至下降。除了PM10,125 μg/mL，其他組都與對照組存在差異(P<0.05)。見圖2-5。

圖2 PM2.5對細(xì)胞內(nèi)ROS的影響(*P<0.05)

圖3 PM10對細(xì)胞內(nèi)ROS的影響(*P<0.05)

圖4 1648a對細(xì)胞內(nèi)ROS的影響(*P<0.05)

圖5 納米二氧化硅對細(xì)胞內(nèi)ROS的影響(*P<0.05)

3 討論

ARGs被認(rèn)為是存在于水、土壤和空氣環(huán)境中新型持續(xù)性污染物〔13-16〕。2020年CHINET中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測臨床分離菌種排名前五位分離株分別是大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、金葡菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌，呼吸道標(biāo)本中前5位占據(jù)其中4個(gè)，據(jù)報(bào)道，顆粒物可以載帶細(xì)菌或ARGs〔17, 18〕,而且顆粒物主要通過呼吸進(jìn)入體內(nèi)，進(jìn)而影響人體健康，可見顆粒物對耐藥基因轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散研究具有重要意義。在我國，生活在監(jiān)測空氣污染的城市地區(qū)的80%以上的人所接觸的空氣質(zhì)量水平超過了世界衛(wèi)生組織(WHO)的限值，而且顆粒物的長期暴露可使全球的預(yù)期期望壽命減少3年〔19〕。土壤和水中耐藥基因的擴(kuò)散傳播研究已相當(dāng)成熟，但大氣中不同粒徑顆粒物對耐藥基因傳播的影響還不太明確。故需要建立模型驗(yàn)證不同粒徑顆粒物對耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的影響。

在本研究中隨著顆粒物濃度的增加，顆粒物對耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用先增強(qiáng)后減弱。PM0.1的最佳促進(jìn)濃度為62.5 μg/mL，約為空白對照組的4.1倍。PM2.5和PM10、1468a最佳促進(jìn)濃度均為125 μg/mL，PM2.5約為空白對照組的3.9倍，PM10約為空白對照組的4.7倍。1648a約為空白對照組的8.5倍?？梢婎w粒物的空氣動(dòng)力學(xué)直徑不同，對耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的影響效果不盡相同。而顆粒物的作用效果隨濃度的增加，有峰值的出現(xiàn)，可能原因是顆粒物在促進(jìn)耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的過程中，能夠使細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生ROS和SOS。有研究表明SOS和中等濃度的ROS可以增加細(xì)胞膜的通透性，削弱細(xì)胞膜屏障，增加遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移，進(jìn)而促進(jìn)耐藥基因的接合轉(zhuǎn)移〔8〕。而顆粒物的濃度為500 μg/mL對耐藥基因的接合轉(zhuǎn)移表現(xiàn)出抑制作用，可能是高劑量的顆粒物對細(xì)菌有殺傷作用，導(dǎo)致細(xì)菌死亡〔20〕。有文獻(xiàn)報(bào)道，隨著初始菌量的減少，耐藥菌之間的接合轉(zhuǎn)移率呈現(xiàn)下降趨勢〔21〕。而且大量顆粒物存在時(shí)，會(huì)粘附在細(xì)菌表面，減少細(xì)菌之間物理接觸機(jī)會(huì)，從而減少耐藥基因的接合轉(zhuǎn)移。顆粒物還可以促進(jìn)接合轉(zhuǎn)移相關(guān)基因trbBp和trfAp的表達(dá)，從而增強(qiáng)耐藥基因的接合轉(zhuǎn)移〔8〕。

總的來說，空氣污染已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題，特別是在中國的很多城市，冬季空氣質(zhì)量狀況嚴(yán)重超過WHO空氣質(zhì)量限值，空氣中顆粒物有可能促進(jìn)空氣中耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移，引起耐藥菌的增加和遠(yuǎn)程擴(kuò)散，加重抗生素的負(fù)擔(dān)。所以，控制環(huán)境中顆粒物濃度至關(guān)重要。本研究結(jié)果可以對將來修訂空氣中顆粒物限值提供參考依據(jù),而且對控制空氣中耐藥基因的傳播具有指導(dǎo)意義。