參附注射液對燒傷合并海水浸泡大鼠血清及肺組織炎癥因子及氧化應(yīng)激的影響

喬媛媛, 熊 鳴, 馬 偉, 李丹丹, 劉東東

(中國人民解放軍海軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心， 北京市 100037)

隨著海洋活動半徑的增大，海上事故及海上沖突時有發(fā)生，燒傷合并海水浸泡傷的發(fā)生率較高〔1〕，傷員墜海后，高滲、高鹽海水造成傷員的二次打擊。有研究表明外傷合并海水浸泡后，會引起傷員高滲性脫水、電解質(zhì)紊亂、酸堿失衡、微循環(huán)障礙以及感染，造成多臟器功能衰竭，甚至死亡〔2〕。 參附注射液扶正補虛，是天然的急救藥物，臨床上常用于失血性、感染性休克等，作用機制涉及抗炎、抗氧化、抗凋亡、改善代謝等多個方面〔3〕。本實驗以燒傷合并海水浸泡大鼠為模型，通過觀察參附注射液改善模型大鼠血清和肺組織TNF-α、IL-1、IL-1β和MDA、SOD指標(biāo)的水平以及肺組織病理改變，探討參附注射液對此傷情可能的作用機理，為該類傷情救治的中醫(yī)藥治療提供基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)，具有一定的戰(zhàn)備意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與儀器設(shè)備選擇體重為 150-200 g，雄性 SD大鼠。動物由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實驗中心提供，許可證號：SCXK-(軍)2014-0001，實驗方案經(jīng)過解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心動物倫理委員會批準(zhǔn)。 參附注射液購自雅安三九藥業(yè)有限公司(國藥準(zhǔn)字Z20043117，5×10 ml ，雅安三九藥業(yè)有限公司出品)，每ml藥液中含生藥紅參100mg、附子100 mg。 自制垂直式圓柱狀鼠籠(高20 cm，直徑6 cm)、高速離心機(Thermo)、酶標(biāo)儀(Thermo)、IL-6、IL-1β、TNF-α、SOD和MDA 的ELISA試劑盒(南京建成生物科技有限公司)、甲醛、二甲苯、 乙醇、PBS和蘇木精等均由北京市化學(xué)試劑有限公司提供。顯微鏡為日本奧林巴斯公司產(chǎn)品，酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)。

1.2 人工海水的配制根據(jù)文獻(xiàn)報道的海水配方，配制成30‰的人工海水，參數(shù)指標(biāo)為：滲透壓(1250±11.25) mmol/L，PH 8.23，比重1.06，鈉離子濃度(630±5.33) mmol/L，鉀離子(10.88±0.68)mmol/L，氯離子 (658.8±5.52) mmol/L，室溫(26±1)℃。

1.3 實驗方法

1.3.1動物分組與實驗 56只SD大鼠隨機分組為正常組(NC)、燒傷合并海水浸泡組(SC)、和參附注射液組(SF6/12)及生理鹽水注射組(YW6/12)的等實驗組。實驗前大鼠禁食12 h，背部30%區(qū)域脫毛后，按文獻(xiàn)方法〔4〕電烙鐵燒5 s鐘，致背部30% TBSA深Ⅱ度燙傷。各組大鼠致傷后置于自制的圓柱狀鼠籠內(nèi)，直立浸泡于海水中(人工海水，水溫25～27℃)，浸泡平面超過傷口創(chuàng)面。 SF實驗組和YW組實驗安排為：分別在實驗前3天每天連續(xù)腹腔注射參附注射液或者生理鹽水，劑量為15ml/kg。燒傷致傷后， SF和YW組的大鼠分別再次注射參附注射液或生理鹽水(劑量和濃度同上)，再將大鼠放置在自制籠具中于海水中浸泡6小時或者12小時，分別采集樣本。

1.3.2血液及組織收集及測定 腹主動脈采血于抗凝采血管，1 h后4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，取上清液于-80 ℃保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說明，檢測大鼠血清中的炎癥因子和氧化應(yīng)激指標(biāo)。 稱取0.1 g肺臟組織，經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗，拭干，加入0.9 ml生理鹽水，制備成10%的組織勻漿，低溫3000 轉(zhuǎn)/min離心15 min，取上清冷凍備用。按照試劑盒說明，檢測大鼠組織勻漿中的炎癥因子和氧化應(yīng)激指標(biāo)。

1.3.3病理組織學(xué)檢測 采集各組肺組織，用PBS清洗后，10%中性多聚甲醛溶液固定，進(jìn)行常規(guī)酒精梯度脫水、石蠟包埋切片，制備病理切片(厚度5 μm)，經(jīng)蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察肺臟病理改變情況。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清炎癥因子的表達(dá)變化實驗結(jié)果表明，燒傷合并海水浸泡組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α的含量均高于正常組(P<0.05)。生理鹽水注射6h和12h組和參附注射液6h和12h組血清中此三個炎癥指標(biāo)水平均有下降，與正常組和燒傷合并海水浸泡組大鼠血清中的炎癥因子差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。參附注射液6小時組的IL-6、IL-1β、TNF-α較生理鹽水注射6小時組的指標(biāo)均有降低，其中TNF-α的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；參附注射液12小時組的IL-6、IL-1β、TNF-α較生理鹽水12小時注射組的指標(biāo)均有降低，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-a的比較

2.2 大鼠肺組織炎癥指標(biāo)各組大鼠肺組織中IL-6、IL-1β、TNF-α水平比較見表2，結(jié)果顯示燒傷合并海水浸泡組大鼠的此三個炎癥指標(biāo)明顯升高，與正常組有顯著性差異(P<0.05)；參附注射液6 h組的IL-6、IL-1β、TNF-α與生理鹽水注射液6 h組指標(biāo)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。參附注射液12 h組和生理鹽水注射12 h組相比，IL-6、TNF-α差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，參附注射液12 h組大鼠的指標(biāo)接近正常組數(shù)值。

表2 各組大鼠肺組織炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-a比較

2.3 大鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)與正常對照組大鼠血漿中MDA比較，燒傷合并海水浸泡組明顯增加(P<0.05)，參附注射液6 h組大鼠血清中MDA降低，與正常組、燒傷合并海水浸泡組和生理鹽水6 h組均有差異(P<0.05)；12 h后的MDA值為4.52±1.99 μmol/L，與燒傷合并海水浸泡組及生理鹽水12 h組均有差異(P<0.05)。 燒傷合并海水浸泡組大鼠血清中T-SOD較正常組大鼠顯著降低(P<0.05)，參附注射液6 h和12 h的處理后，T-SOD明顯上升，12 h后數(shù)值基本與正常組接近，與正常組沒有差異(P>0.05)，參附注射液12 h組的T-SOD與生理鹽水12 h組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清氧化應(yīng)激因子MDA、T-SOD比較

2.4 大鼠肺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)與正常組大鼠肺組織MDA比較，燒傷合并海水浸泡組大鼠肺組織MDA明顯增加(P<0.05)，參附注射液處理后6、12 h后MDA降低，12小時后的MDA值接近正常組，與其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；6 h和12 h檢測點，參附注射液組MDA含量較注射鹽水組MDA均顯著降低(P<0.05)。 與正常組相比，燒傷合并海水浸泡組大鼠肺組織T-SOD的活力顯著降低(P<0.05)。經(jīng)過6 h和12 h，T-SOD活性增加，均與單純燒傷組有差異(P<0.05)；參附注射液6 h組大鼠肺臟SOD較生理鹽水注射組增加，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。參附注射液12 h組大鼠肺臟SOD和繼續(xù)好轉(zhuǎn)，與生理鹽水12 h組指標(biāo)的組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 各組大鼠肺組織氧化應(yīng)激因子MDA、T-SOD比較

2.5 肺臟組織學(xué)情況肺組織肉眼觀察見正常組的肺組織顏色淡粉紅色，表面光滑，質(zhì)地較軟，無明顯出血及壞死，顯微鏡下觀察到肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔較薄，肺泡腔內(nèi)未見炎癥細(xì)胞浸潤，管腔內(nèi)可見少量蛋白黏液及紅細(xì)胞。圖1顯示，單純燒傷組的肺組織結(jié)構(gòu)中度異常，部分動脈中膜明顯增厚，管腔狹窄，如黑色箭頭所示，外膜水腫間隙增大，并可見大量嗜中性粒細(xì)胞浸潤。生理鹽水注射12小時組大鼠的肺組織整體結(jié)構(gòu)中度異常，肺泡間隙明顯增寬，輕微實質(zhì)化，肺間質(zhì)可見明顯充血；參附注射液12組大鼠的肺組織結(jié)構(gòu)輕度異常，部分肺泡腔中巨噬細(xì)胞數(shù)量增多，如黑色箭頭所示，肺泡壁無明顯增厚。

圖1 肺組織的比較 A:空白對照；B：燒傷合并海水浸泡組； C：生理鹽水12小時后；D：參附注射液注射12小時后

3 討論

我國有豐富的中藥資源，中草藥的作用在多種疾病治療中凸顯其重要性〔5,6〕。參附注射液是重要的中藥制劑，組方源自參附湯，有效成分是人參皂苷、 烏頭生物堿類，主治元氣大虧，具有“多靶效應(yīng)”而應(yīng)用于心血管疾病及多種急癥危重病的治療，其療效顯著。有報道表明參附注射液對肺損傷及腎功能衰竭、心衰等具有保護(hù)作用〔7-9〕，但作用機制尚不明確，仍待進(jìn)一步研究。本研究應(yīng)用參附注射液對燒傷合并海水浸泡大鼠進(jìn)行探索性干預(yù)治療，觀察其對大鼠燒傷合并海水浸泡傷肺損傷的保護(hù)作用及其可能的機制。

我們的前期工作也證明〔10〕，嚴(yán)重?zé)齻喜⒑Ｋ輰?dǎo)致消化道血供急劇減少，組織毛細(xì)血管微循環(huán)障礙，缺血缺氧引起酸中毒，自由基和炎性介質(zhì)等水平升高，與凋亡相關(guān)的基因表達(dá)增強，啟動了內(nèi)源性和外源性及其他細(xì)胞凋亡激活途徑，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡，誘發(fā)膿毒癥及 MODS；腸道緊密連接開放，腸道通透性增大，誘發(fā)胃腸屏障功能受損，中性粒細(xì)胞過度活化引起炎癥反應(yīng)，繼發(fā)肺內(nèi)炎性反應(yīng)失控造成肺的損傷。 在炎癥反應(yīng)過程中，內(nèi)源性炎癥介質(zhì)被激活，大量炎癥因子如TNF-α，IL-6等釋放，啟動炎癥反應(yīng)遞質(zhì)連鎖反應(yīng)，激活機體中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并造成更多炎癥因子的釋放〔11〕；外周循環(huán)炎癥細(xì)胞遷移至肺間質(zhì)及肺泡，造成肺部的炎癥〔12,13〕，與此同時炎性因子與炎癥細(xì)胞間相互促進(jìn)，加重感染癥狀。

TNF-α表達(dá)水平可反映機體損傷程度，被認(rèn)為是炎癥發(fā)生發(fā)展的指標(biāo)〔14〕。IL-6為遲發(fā)性細(xì)胞因子，有證據(jù)顯示，血清IL-6水平可作為細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)激活的標(biāo)志物，反映宿主炎癥反應(yīng)與疾病嚴(yán)重程度間的關(guān)系，它也是引起肺損傷急性炎癥反應(yīng)期的主要炎癥細(xì)胞因子。 IL-1β是白細(xì)胞介素家族常見的炎癥因子，由單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等組成〔15〕。IL-1β作為一種炎癥前調(diào)節(jié)因子，可以反映早期損傷的嚴(yán)重程度，并通過自分泌激活核因子NF-κB，增加IL-6和TNF-α的表達(dá)〔16〕。本實驗觀察到燒傷合并海水浸泡傷模型大鼠血清和肺組織的炎癥因子水平升高，應(yīng)用參附注射液干預(yù)組的大鼠血清炎癥水平較對照組明顯降低，肺臟病理顯示炎癥有所改善，提示參附注射液能夠通過抑制炎癥因子的表達(dá)，從而減輕肺臟炎癥損傷。

氧化應(yīng)激近年來也倍受關(guān)注，急性疾病過程中的氧化損傷是導(dǎo)致細(xì)胞損傷、器官功能失調(diào)的重要原因，氧化應(yīng)激反應(yīng)參與肺損傷的發(fā)生、發(fā)展。T-SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，可催化機體內(nèi)超氧離子發(fā)生歧化反應(yīng)，清除氧自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷〔17〕。MDA為膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量高低可反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平和氧自由基對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷程度〔18〕。因此T-SOD越低，MDA越高表明機體過氧化應(yīng)激反應(yīng)越嚴(yán)重。 蒲江濤等〔19〕報道參附注射液對肺損傷的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)參附注射液可以顯著降低供肺缺血-再灌注損傷后MDA的含量，提高SOD的活力，對肺水腫有較好的治療作用。本實驗表明燒傷合并海水浸泡組大鼠血清和肺組織的SOD水平明顯降低，MDA含量升高，提示炎癥發(fā)生后，SOD被大量消耗，氧化調(diào)節(jié)失衡，機體各組織在自由基的攻擊下受損。參附注射液組大鼠的氧化應(yīng)激指標(biāo)有所改善，炎癥因子降低，SOD升高而MDA含量下降，證實參附注射液能夠有效減輕炎性反應(yīng)程度，緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，緩解肺部的病理損傷。

本研究初步探索參附注射液對燒傷合并海水浸泡傷的中醫(yī)藥治療，為中醫(yī)方劑治療急危重癥提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。綜上所述，參附注射液能穩(wěn)定細(xì)胞膜，減少炎癥因子和氧化應(yīng)激的釋放，降低IL-6、IL-1β、TNF-α含量，干預(yù)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)；提高T-SOD，降低MDA水平，降低細(xì)胞氧耗，抑制氧化應(yīng)激水平，減輕脂質(zhì)過氧化損傷，加速自由基的排出，平衡機體氧化與抗氧化作用，從而保護(hù)肺臟組織。