基于高效液相色譜的BPTAP 純度分析方法

丁 歡，陳建波，趙海霞，劉 渝

（1. 中國工程物理研究院化工材料研究所，四川 綿陽 621900；2. 中北大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，山西 太原 030051）

1 引言

耐熱炸藥作為一類熱安定性能優(yōu)異的含能材料，不僅具有低的感度和高的能量輸出，還具有高的熔點(diǎn)（200 ℃以上）和低的蒸汽壓，在長期的高溫加載后仍能可靠起爆［1-2］。根據(jù)耐熱性能的不同，耐熱炸藥可分為高溫耐熱炸藥（耐熱溫度低于220 ℃）和超高溫耐熱炸藥（耐熱溫度高于250 ℃），其中超高溫耐熱炸藥更能適應(yīng)嚴(yán)苛的作戰(zhàn)環(huán)境，是含能材料領(lǐng)域未來的發(fā)展趨勢之一［3-4］。四硝基苯并-1，3a，6，6a-四氮雜戊搭烯并吡啶（BPTAP）的分子結(jié)構(gòu)為大π鍵的共軛稠環(huán)體系，使其具有高的熱分解溫度（375 ℃），且熔點(diǎn)大于300 ℃［5-6］。此外，BPTAP 還具有低的感度（摩擦感度為120 N，撞擊感度為26 N）和高的能量（爆速為7.43 km·s-1，爆壓為29.4 GPa）［7］。鑒于BPTAP 優(yōu)異的性能，被認(rèn)為是新一代的超高溫耐熱炸藥，近年來受到含能材料研究人員的廣泛關(guān)注。

純度是炸藥品質(zhì)評價(jià)的重要指標(biāo)之一，常用的純度測試方法主要包括凝固點(diǎn)下降法［8］、差熱分析法（DSC）［9］、滴定法［10］、核磁共振氫譜法（1H NMR）［11］、色譜法［12］/高效液相色譜（HPLC）等，其中HPLC 具有樣品用量少、靈敏度高、重現(xiàn)性好、自動(dòng)化程度高等優(yōu)勢，基于HPLC 的純度分析方法是有機(jī)化合物純度分析的主要研究手段，在含能材料領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。劉秀華等［13］針對8 種硝基化合物建立了基于HPLC 的含量分析方法，不但可同時(shí)檢測多種炸藥組分，還具有高的檢測靈敏度（檢測限≤0.8 ng）。趙允穎等［14］基于HPLC 方法實(shí)現(xiàn)了六硝基茋（HNS）與其雜質(zhì)六硝基聯(lián)苯（HNBB）的有效分離與定量分析，對HNS 和HNBB 的 檢 測 范 圍 分 別 為5～100 mg·L-1和2～50 mg·L-1，滿 足 了HNS 及 其 相 關(guān) 物 質(zhì) 的 質(zhì) 量 控制需求。劉園園等［15］針對3，4-二硝基吡唑及其雜質(zhì)3-硝基吡唑和1，3-二硝基吡唑，建立了基于HPLC 的純度分析方法，三種化合物的檢測限分別為1.19，0.60 mg·L-1和1.04 mg·L-1。可 見，HPLC的眾多優(yōu)點(diǎn)使其成為含能材料定性定量分析的重要手段之一，在含能材料的研制生產(chǎn)過程中發(fā)揮了重要作用。

BPTAP 作為近年來高度關(guān)注的一類新型耐熱炸藥，人們圍繞BPTAP 開展了一些合成與性能研究［16-17］，正努力推進(jìn)其工程化應(yīng)用，然而BPTAP 目前仍缺乏相應(yīng)的純度分析方法，不利于其研制過程的純度監(jiān)測與質(zhì)量控制。為此，本研究開展了基于反相高效液相色譜（RP-HPLC）的BPTAP 純度分析方法研究，通過建立相應(yīng)的色譜分析方法，為BPTAP 工程化應(yīng)用的純度分析與質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Shimadzu LC-20AT 高效液相色譜儀，配置有2 個(gè)LC-20AT 泵，SIL-20A 自動(dòng)進(jìn)樣器，SPD-20A 紫外檢測器，CTO-20A 柱溫箱。Agilent 1260 液相色譜儀，配置有DAD 檢測器。超純水出自Millipore-Q system（美國Millipore），電阻率為18.2 MΩ。炸藥樣品均在XPE26 微量天平（瑞士Mettler Toledo）上稱重，精度為0.001 mg。UA10MFD 超聲波清洗器（德國WIGGENS），Vortex Genie 2T 旋渦混合器（美國Scientific Industries），BL-240/2411 防爆冰箱（上海億思科技實(shí)業(yè)有限公司）。

2.2 試劑與耗材

BPTAP 炸藥由中物院化工材料研究所提供，并進(jìn)行重結(jié)晶（純度≥98.0%）；甲醇（HPLC 級，百靈威化學(xué)試劑公司），乙腈（HPLC 級，百靈威化學(xué)試劑公司），四氫呋喃（HPLC 級，默克化工技術(shù)公司），乙酸銨（HPLC級，百靈威化學(xué)試劑公司），三氟乙酸（AR級，麥克林生化公司），N'，N'-二甲基甲酰胺（AR 級，麥克林生化公司），二甲基亞砜（AR 級，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；注射器（美國賽默飛世爾實(shí)驗(yàn)器材公司），0.46 μm 的過濾膜（日本AS One）。

2.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.00 mg 的BPTAP 樣品，置于100 mL 的容量瓶中，乙腈定容，超聲攪拌使其充分溶解，配制成20.00 μg·mL-1的溶液，用于HPLC 分析方法開發(fā)研究。稱取10.06 mg 的BPTAP 純度參比樣品，溶于50 mL 的DMSO 中，配制成201.20 μg·mL-1的儲備液；再分別對上述儲備液進(jìn)行稀釋，配制成100.60、50.30、10.06、5.03、1.01 μg·mL-1和0.50 μg·mL-1等不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、檢測限等相關(guān)研究。為調(diào)節(jié)HPLC 流動(dòng)相的pH 值，在水相中加入不同類型的添加劑，分別配制成含有0.05%（V/V）三氟乙酸、0.5%（V/V）四氫呋喃和1.5、1.0、0.5 mg·mL-1乙酸銨的流動(dòng)相。所有樣品在HPLC 分析前，均經(jīng)過0.45 μm 的過濾膜過濾，避免不溶物堵塞色譜柱。

2.4 HPLC 方法的優(yōu)化

HPLC 分析方法開發(fā)主要在Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀上進(jìn)行，檢測波長的優(yōu)化在Agilent 1260 液相色譜儀上進(jìn)行。色譜柱是影響HPLC 分離效果好壞的關(guān)鍵因素之一，其中Plus C18 色譜柱適用于大多數(shù)有機(jī)化合物的分離，應(yīng)用范圍最為廣泛。另外，Extend C18 色譜柱適用于堿性條件下分離，Phenyl-Hexyl 色譜柱適于分離芳香族化合物，SB-Phenyl 色譜柱適合在酸性條件下分離芳香族化合物。優(yōu)化后的HPLC 方法如下：色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6×150 mm，5.0 μm），流動(dòng)相為超純水（含0.1 mg·mL-1的乙酸銨）-乙腈混合液，梯度洗脫模式，乙腈含量在0～10 min 之間由35%線性增至90%并繼續(xù)保持5 min，從15.01 min 起，乙腈含量回到35%并保 持6 min；流 速 為1.0 mL·min-1，進(jìn) 樣 體 積 為10.0 μL，柱溫為30 ℃，檢測波長為230 nm。HPLC 分析、數(shù)據(jù)采集和定量分析均在Shimadzu LCsolution 軟件上進(jìn)行。

2.5 HPLC 方法驗(yàn)證

通過考察BPTAP 色譜分析的重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度、耐用性、標(biāo)準(zhǔn)曲線與靈敏度、檢測限等參數(shù)分析，對建立的HPLC 分析方法的性能進(jìn)行驗(yàn)證。

通過重復(fù)多次進(jìn)樣（n=6），分析BPTAP 的保留時(shí)間和峰面積等相關(guān)參量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），評估HPLC 方法的重復(fù)性。

通過HPLC 在48 h 內(nèi)不同時(shí)間間隔的連續(xù)分析，檢測不同時(shí)間段內(nèi)BPTAP 的保留時(shí)間和峰面積的變化，考察該方法的穩(wěn)定性。

基 于 不 同 濃 度（201.20、100.60、50.30、10.06、5.03、1.01 μg·mL-1和0.50 μg·mL-1）的BPTAP 標(biāo) 準(zhǔn)溶液建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以三倍的信噪比來分析方法的檢測限（LOD），以十倍的信噪比分析該方法的定量限（LOQ），以評價(jià)該方法的靈敏度。

為驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，在未知的樣品中添加不同濃度（200、100、50 μg·mL-1）的BPTAP 純度參比物，每個(gè)樣品重復(fù)測定三次并計(jì)算加標(biāo)回收率。

通過分析BPTAP 在日間（n=18，每天進(jìn)樣6 次）和日內(nèi)（n=6）峰面積的RSD 以評估色譜方法的日間/日內(nèi)精密度。

為研究方法的耐用性，對檢測波長±2.0 nm、柱溫±2.0 ℃等進(jìn)行細(xì)微調(diào)整，考察BPTAP 的保留時(shí)間（tR）、分離度（R）和半峰寬（full width at half maxima，簡稱FWHM）等參量的變化。

2.6 BPTAP 重結(jié)晶過程的純度分析

將BPTAP 粗產(chǎn)品加入DMF 中，80 ℃油浴加熱，500 r·min-1攪拌至充分溶解，冷卻到室溫加入反溶劑（甲醇）攪拌至樣品析出，靜置過濾，使用超純水洗滌，干燥得到一次重結(jié)晶的樣品。油浴溫度下降到50 ℃，將一次重結(jié)晶的樣品按照相同的方法進(jìn)行二次重結(jié)晶。

準(zhǔn)確稱取BPTAP 粗品、一次重結(jié)晶樣品和二次重結(jié)晶樣品各1.00 mg，分別置于100 mL 的容量瓶中，乙腈定容，超聲攪拌使其充分溶解，經(jīng)0.45 μm 的過濾膜過濾，并利用建立的HPLC 方法分析BPTAP 重結(jié)晶前后的純度變化。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜分析影響因素考察

BPTAP 的結(jié)構(gòu)如圖1 所示，鑒于BPTAP 在高極性溶劑（如乙腈、甲醇）中的溶解性明顯優(yōu)于低極性溶劑（如正己烷、氯仿），優(yōu)先采用HPLC 的反相模式進(jìn)行分析方法開發(fā)研究。由于BPTAP 合成得到的粗產(chǎn)品中存在多種雜質(zhì)，采用梯度洗脫的分離效果明顯優(yōu)于等度洗脫。因此，本研究將基于梯度洗脫模式的RP-HPLC 開展對BPTAP 純度分析方法研究，重點(diǎn)考察色譜柱、流動(dòng)相、進(jìn)樣量、流速等因素對分離結(jié)果的影響。

圖1 BPTAP 的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of BPTAP

3.1.1 色譜柱的優(yōu)化

本研究考察了四種色譜柱對BPTAP 的色譜分析的影響，結(jié)果如圖2a所示。由圖2a可知，Extend C18色譜柱的分離效果較差，雜質(zhì)峰都集中于BPTAP 色譜峰附近。Plus C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Phenyl-Hexyl（4.6 mm×150 mm，5 μm）和SB-Phenyl（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱的分離效果有所改進(jìn)，BPTAP 與其雜質(zhì)均能達(dá)到較好的分離。但是，不同的色譜柱在分離時(shí)間上差異較大，SB-Phenyl 色譜柱的分離時(shí)間最長（12.04 min），Phenyl-Hexyl 色 譜 柱 的 分 離 時(shí) 間 為10.46 min，Plus C18 色譜柱的分離時(shí)間較短，為8.99 min。另外，不同色譜柱下BPTAP的色譜峰面積也有所不同，SB-Phenyl色譜柱的峰面積（555158 mV·min）最強(qiáng)，Phenyl-Hexyl 色譜柱的峰面積（531337 mV·min）次之，Plus C18 色譜柱的峰面積（514818 mV·min）較強(qiáng)，而Extend C18 色譜柱的峰面積（309258 mV·min）最弱。為了在提高分離效率的同時(shí)達(dá)到好的分離效果，綜合考慮BPTAP 的保留時(shí)間、峰高和峰面積參數(shù)，最終選擇Plus C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱進(jìn)行BPTAP 純度分析。

圖2 BPTAP 在不同色譜柱（a）和不同流動(dòng)相（b）下的色譜圖Fig.2 Chromatographic analysis of BPTAP by using different columns（a）and different mobile phase（b）

3.1.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

流動(dòng)相作為色譜分離的重要載體，對分析過程有著重要影響。反相液相色譜的流動(dòng)相通常由有機(jī)相和水相混合而成，其中常見的有機(jī)相為乙腈、甲醇等。考察以乙腈和甲醇為流動(dòng)相時(shí)，不同有機(jī)溶劑對BPTAP色譜分離的影響，結(jié)果如圖2b 所示。當(dāng)以甲醇為有機(jī)相時(shí)，BPTAP 的保留時(shí)間（6.83 min）較短，但與其相鄰的色譜峰發(fā)生重疊，未能充分分離。當(dāng)流動(dòng)相中有機(jī)溶劑改為乙腈時(shí)，BPTAP 的保留時(shí)間（9.36 min）有所延長，但分離效果明顯改善，對稱性較好，且BPTAP 的峰面積（637343 mV·min）和峰高（67304 mV）信號更強(qiáng)?？梢?，乙腈作為有機(jī)相更適合BPTAP 的色譜分離。

3.1.3 乙腈含量的優(yōu)化

在梯度洗脫模式下，從起始點(diǎn)到終點(diǎn)過程中有機(jī)相與水相的變化比例是決定分離效果的關(guān)鍵因素。首先考察了梯度起點(diǎn)乙腈含量分別為30%、35%、40%、45%和50%時(shí)，對BPTAP分離的影響，結(jié)果如圖3所示。乙腈含量越高，BPTAP的保留時(shí)間越短（見圖3b）。乙腈含量為25%時(shí)保留時(shí)間為20.78 min，當(dāng)乙腈含量升高至50%時(shí)，BPTAP 的保留時(shí)間縮短至14.36 min。從圖3a 可以看出，當(dāng)乙腈含量為35%時(shí)，色譜峰1、2和3 的分離效果最好。隨著乙腈含量的持續(xù)增加，色譜峰1、2 和3 對應(yīng)的分離度降低，甚至難以分開?？梢?，以35%乙腈含量作為BPTAP 梯度分離的起點(diǎn)具有更好的分離效果。

圖3 梯度起點(diǎn)不同乙腈含量下的BPTAP 色譜分析Fig.3 Chromatographic analysis of BPTAP by using different acetonitrile content at the starting point

在對梯度起點(diǎn)的乙腈含量優(yōu)化后，進(jìn)一步考察了梯度終點(diǎn)不同乙腈含量（分別為75%、80%、85%、90%和95%）對BPTAP 分離的效果。如圖4 所示，BPTAP 的保留時(shí)間隨乙腈含量的增加而略微減小，當(dāng)終點(diǎn)乙腈含量從75%升至95%時(shí)，其保留時(shí)間下降了1.198 min，但峰高從43602 mV 增加至48412 mV。當(dāng)梯度終點(diǎn)乙腈含量為90%時(shí)，BPTAP 及其雜質(zhì)的色譜峰的半峰寬均小于0.30，拖尾因子在1.047～1.228 之間，理論塔板數(shù)均大于40703，對稱性好，柱效高。因此，選擇90%作為BPTAP 梯度分析終點(diǎn)的乙腈含量。

3.1.4 流動(dòng)相中添加劑的影響

當(dāng)流動(dòng)相中未加入添加劑時(shí)，保留時(shí)間為2 min處存在數(shù)個(gè)難以分離的色譜峰。為改善分析效果，考察了在流動(dòng)相中加入不同添加劑對BPTAP 分離的影響。如圖5a 所示，加入0.05%（V/V）三氟乙酸時(shí)，基線漂移嚴(yán)重；加入0.5%（V/V）四氫呋喃時(shí)，對色譜分離效果沒有明顯改善；而加入1.5 mg·mL-1的乙酸銨時(shí)，保留時(shí)間為2 min 處各峰的分離有一定改善。進(jìn)一步考察了不同濃度的乙酸銨（濃度分別為0.5、1.0 和1.5 mg·mL-1）對這些峰的分離效果。如圖5b 所示，1.0 mg·mL-1的乙酸銨作為添加劑即可達(dá)到較好的分離。因此，以1.0 mg·mL-1的乙酸銨作為流動(dòng)相中的添加劑。

圖5 流動(dòng)相中不同的添加劑對BPTAP 色譜分析的影響Fig.5 Chromatographic analysis of BPTAP by using different additives in mobile phase

3.1.5 檢測波長的優(yōu)化

利用帶有二極管陣列檢測器的液相色譜考察不同檢測波長對BPTAP 分離的影響。如圖6所示，當(dāng)以BPTAP的最大紫外吸收波長460 nm 為檢測波長時(shí)，BPTAP 具有最大的峰高和峰面積。同時(shí)，以200～230 nm 為檢測波長時(shí)，BPTAP 也有較強(qiáng)的色譜信號。此外，相對于460 nm 的檢測波長，200～230 nm 的檢測波長下能看到更多的雜質(zhì)峰，更有利于BPTAP 制備過程的雜質(zhì)控制。然而，當(dāng)以200 nm、210 nm 為檢測波長時(shí)，基線漂移嚴(yán)重，背景噪音較強(qiáng)。而在230 nm 檢測波長時(shí)，基線更為平滑。因此，選擇230 nm 作為BPTAP 色譜分析的最佳檢測波長。

圖6 不同波長下BPTAP 的色譜圖Fig.6 Chromatographic analysis of BPTAP by using different detection wavelengths

3.1.6 梯度分離時(shí)間的優(yōu)化

在梯度洗脫程序中，梯度分離時(shí)間不僅影響著樣品的分離效果，也決定了分析的效率。本研究考察了不 同 的 梯 度 分 離 時(shí) 間（8、10、15、20 和25 min）對BPTAP 色譜分離的影響。由圖7a 可知，梯度分離時(shí)間的縮短，分析效率也有所提升，且BPTAP 的峰高和峰面積均隨之增加。然而，當(dāng)梯度分離時(shí)間為8 min 時(shí)，BPTAP 與其相鄰的色譜峰（保留時(shí)間為8.25 min）分離較差，未達(dá)到基線分離。因此，選擇10 min 作為梯度分離的最佳運(yùn)行時(shí)間。

3.1.6 進(jìn)樣量的優(yōu)化

增大進(jìn)樣量可以有效的提高色譜的峰高和峰面積，但過大的進(jìn)樣量會造成色譜柱飽和，進(jìn)而影響分離效果。如圖7b 所示，為不同進(jìn)樣量（5、10、20、30 和40 μL）下BPTAP 的分離情況。當(dāng)進(jìn)樣量為5 μL 時(shí)，色譜峰1、2 的峰面積較弱，甚至小于1000 mV·min，難以進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。進(jìn)樣量為10 μL 時(shí)，色譜峰1、2的峰面積增加，均大于1500 mV·min，且分離效果良好，對稱性高。當(dāng)進(jìn)樣量為20～40 μL時(shí)，保留時(shí)間為0～4 min處各峰未能分離，色譜峰2的對稱性下降。當(dāng)進(jìn)樣量為40 μL 時(shí)，色譜峰2 與BPTAP 重疊，難以區(qū)分。因此，選擇10 μL為BPTAP色譜分析的最佳進(jìn)樣量。

圖7 梯度洗脫不同分離時(shí)間（a）和不同進(jìn)樣量（b）下BPTAP 的色譜分析Fig.7 Chromatographic analysis of BPTAP by using different separation time（a），and different injection volumes（b）

3.1.7 流速的優(yōu)化

適當(dāng)?shù)牧魉倌苡行У販p小被分析物的保留時(shí)間，節(jié)約時(shí)間成本的同時(shí)提高分析效率。本研究考察了流速分別為0.6、0.8、1.0、1.2 和1.5 mL·min-1時(shí)BPTAP的色譜分析效果（圖8a）。隨著流速的增加，BPTAP 的保留時(shí)間明顯的縮短，由0.6 mL·min-1流速時(shí)的13.37 min 下 降 到1.5 mL·min-1流 速 時(shí) 的6.84 min。與此同時(shí)，BPTAP 的峰高（113507～69892 mV）和峰面積（917211～354022 mV·min）也隨流速的增加而下降。當(dāng)流速為1.0 mL·min-1時(shí)，BPTAP 具有合適的峰高（95258 mV）和峰面積（546268 mV·min），保留時(shí)間為9.16 min，且各峰的分離度良好（均大于1.95），基線平穩(wěn)，信噪比低。因此，選擇1.0 mL·min-1作為BPTAP 色譜分析的檢測流速。

3.1.8 柱溫的優(yōu)化

為避免色譜柱的溫度對BPTAP 的色譜分析產(chǎn)生不利影響，本研究考察了柱溫箱分別為25、30、35、40 ℃和45 ℃時(shí)的色譜分析效果。結(jié)果如圖8b 所示，柱溫的升高會略微降低BPTAP 的保留時(shí)間。保留時(shí)間由25 ℃時(shí)的8.80 min 降至45 ℃的8.04 min，對應(yīng)峰高由576509 mV 下降到545171 mV，相應(yīng)峰面積由100381 mV·min下降到96671 mV·min。參考實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度，柱溫為30 ℃時(shí)，BPTAP的保留時(shí)間為8.65 min，峰面積為572358 mV·min，峰高為100139 mV，且對稱性好、柱效高。因此，最終選擇30 ℃作為BPTAP 色譜分析的柱溫。

圖8 不同流速（a）和不同柱溫（b）下BPTAP 的色譜分析Fig.8 Chromatographic analysis of BPTAP by using different flow rates（a）and column temperatures（b）

3.1.9 最佳的色譜分析條件

經(jīng)上述優(yōu)化，本文建立了基于HPLC 的BPTAP 純度分析方法，并獲得了最佳的色譜分析條件，其色譜柱為Plus C18 色譜柱（4.6×150 mm，5.0 μm），流動(dòng)相為乙腈-水混合液（含0.1 mg·min-1的乙酸銨），梯度分離模式，乙腈含量在10 min內(nèi)從35%線性增至90%并保持5 min，進(jìn)樣量為10.0 μL，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為230 nm。最佳條件下BPTAP 的色譜圖如圖9a 所示，BPTAP 的保留時(shí)間為9.13 min，保留因子（K'）為5.85，拖尾因子（T）為1.22，半峰寬（FWHM）為0.18，各個(gè)峰的分離度（R）均大于1.90，展現(xiàn)了良好的分離效果。BPTAP及其雜質(zhì)的分離參數(shù)如表1所示。

表1 優(yōu)化的HPLC 條件下BPTAP 及雜質(zhì)的分離參數(shù)Table 1 The separation parameters of BPTAP and the impurities under optimum condition of HPLC

3.2 BPTAP 方法驗(yàn)證

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與靈敏度

為建立BPTAP 定量分析的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，將BPTAP 參比溶液逐級稀釋，配制成201.20、100.60、50.30、10.06、5.03、1.01 μg·mL-1和0.50 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使用外標(biāo)法結(jié)合峰面積定量，獲得BPTAP 的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（見圖9b）。在0.5～200 μg·mL-1的范圍內(nèi)，BPTAP 的濃度與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性方程為Y=33455.72X-45404.95，相關(guān)系 數(shù)R2=0.9997，檢 測 限 為0.02 μg·mL-1，定 量 限 為0.07 μg·mL-1，表明該方法具有良好的靈敏度。

圖9 優(yōu)化HPLC 條件下BPTAP 的色譜圖（a）及BPTAP 的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（b）Fig.9 The chromatogram of BPTAP under optimum condition of HPLC（a）and the standard curve for BPTAP（b）

3.2.2 準(zhǔn)確度

在待測的BPTAP 樣品中，分別加入50.30、100.60、201.20 μg·mL-1不同濃度的純度參比溶液，在最佳HPLC 條件下，每個(gè)樣品重復(fù)測定3 次，記錄峰面積并計(jì)算加標(biāo)回收率。如表2 所示，BPTAP 的加標(biāo)回收率在101.68%～104.58%之間，且RSD 在0.19%～0.28%之間，說明本方法具有良好的準(zhǔn)確性。

表2 BPTAP 在不同濃度下的加標(biāo)回收率（n=3）Table 2 The recovery of BPTAP after adding different standard solutions

3.2.3 精密度

日間/日內(nèi)精密度是分別對同一批樣品在連續(xù)不同天數(shù)/同一天進(jìn)行測試，用于表示儀器的環(huán)境條件發(fā)生微小變化時(shí)測定結(jié)果的差異性。為考察BPTAP 的HPLC 分析方法的精密度，同一樣品分別制備6 份供試品，分別進(jìn)樣，連續(xù)測定3d，并以BPTAP 峰面積的RSD作為日間/日內(nèi)精密度的評價(jià)依據(jù)。由表3 可知，BPTAP 峰 面 積 的 日 內(nèi)RSD 均≦1.56%，日 間RSD 為1.17%，表明本方法的精密度良好。

表3 日間/日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)Table 3 The inter-day and intra-day precision

3.2.4 重復(fù)性

基于已建立的HPLC 分析方法，將BPTAP 配制成20 μg·mL-1的溶液，重復(fù)分析6 次，以考察BPTAP 色譜方法的重復(fù)性。如表4 所示，BPTAP 的保留時(shí)間、峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.04%、0.81%，表明BPTAP 分析方法具有良好的重復(fù)性。

表4 BPTAP 色譜方法的重復(fù)性Table 4 The repeatability of BPTAP method

3.2.5 穩(wěn)定性

使用新配制的20 μg·mL-1的BPTAP 溶液，分別在1 h、12 h、24 h 和48 h 等不同時(shí)間段內(nèi)測量BPTAP 的保留時(shí)間和峰面積，以考察本方法對BPTAP 分析的穩(wěn)定性。如表5 所示，BPTAP 在48 h 內(nèi)保留時(shí)間、峰面積的RSD 分別為0.20%、0.93%。可見，基于HPLC 的BPTAP 分析方法在48 h 內(nèi)是相對穩(wěn)定的。

表5 基于HPLC 的BPTAP 分析方法的穩(wěn)定性Table 5 The stability of BPTAP method base on HPLC

3.2.6 耐用性

實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中存在一些影響B(tài)PTAP 色譜分析的細(xì)微變化，如檢測波長、色譜柱溫的波動(dòng)。為評估某些因素發(fā)生波動(dòng)時(shí)對分析結(jié)果的影響，對這些因素進(jìn)行細(xì)微調(diào)整如柱溫（±2 ℃）、檢測波長（±2 nm），考察變動(dòng)因素對檢測結(jié)果的影響。由表6 可知，在柱溫（±2 ℃）和檢測波長（±2 nm）的細(xì)微調(diào)整下，保留時(shí)間（tR）、分離度（R）和半峰寬（FWHM）均保持良好?？梢姡痉椒ň哂袃?yōu)良的耐用性，色譜條件的細(xì)微波動(dòng)不影響分離效果。

表6 BPTAP 的HPLC 方法在不同條件下的耐用性Table 6 The robustness of BPTAP method under different conditions

3.3 實(shí)際樣品分析

為考察本方法在BPTAP 中的實(shí)際應(yīng)用前景，還將本方法應(yīng)用于BPTAP 實(shí)際樣品重結(jié)晶過程中的純度分析研究。如表7 所示，不同批次（20190601 批、20190917 批、20191015 批和20191119 批）的BPTAP樣品的純度存在差異，粗品純度最低為80.37%，經(jīng)過一次重結(jié)晶后純度提升至94.32%，二次重結(jié)晶后的純度提升至95.47%。結(jié)果表明，本研究建立的BPTAP 色譜分析方法適合用于BPTAP 的純度分析研究。

表7 不同批次的BPTAP 和重結(jié)晶之后的純度分析Table 7 The purity analysis of BPTAP in different batches and after the recrystallization

4 結(jié)論

針對BPTAP 研制生產(chǎn)及應(yīng)用過程中對純度分析的需求，開展了基于高效液相色譜（HPLC）的分析方法構(gòu)建、驗(yàn)證及實(shí)際應(yīng)用研究。

（1）首先，通過優(yōu)化影響色譜分析的相關(guān)因素如色譜柱、進(jìn)樣量及分析時(shí)間等，建立了基于HPLC 的BPTAP 純度分析方法。基于該方法，BPTAP 及其雜質(zhì)得到高效分離，BPTAP 的保留時(shí)間為9.13 min，各個(gè)峰的分離度均大于1.9。

（2）接著，對該分析方法進(jìn)行了系統(tǒng)驗(yàn)證，該方法在0.5～200 μg·mL-1范圍內(nèi)展現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，檢測限為0.02 μg·mL-1，定量限為0.07 μg·mL-1，并體現(xiàn)了良好的精密度和重現(xiàn)性。

（3）此外，還將該方法應(yīng)用于BPTAP 實(shí)際樣品重結(jié)晶過程的純度監(jiān)測研究，分析發(fā)現(xiàn)不同批次的BPTAP 樣品存在純度差異，且經(jīng)過重結(jié)晶可以有效提高BPTAP 的純度。

總之，本研究建立的BPTAP 色譜分析方法具有準(zhǔn)確、高效、靈敏等優(yōu)勢，可用于BPTAP 的純度分析、含量檢測和質(zhì)量控制等研究。