免疫組化烘蠟條件的探討

沈洪武，沈靜華

免疫組化切片的烘蠟條件目前尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。梁英杰主編的《臨床病理學(xué)技術(shù)》提供的烘蠟條件是62～65 ℃ 60～120 min[1]。北京中杉金橋公司《產(chǎn)品目錄》提供的烘蠟條件是70 ℃ 60 min。來茂德主編的《病理學(xué)高級教程》提供的烘蠟條件是60 ℃ 60 min[2]。羅氏診斷產(chǎn)品(上海)公司的清洗液說明書提供的烘蠟條件是65～75 ℃ 2～24 h。Dako公司IHC Microscope Slides說明書提供的烘蠟條件是切片在室溫下完全干燥后，56～60 ℃ 20～60 min。在實(shí)際工作中，烘蠟條件為60～70 ℃ 60 min，部分組織易脫片(例如子宮頸錐切組織和乳腺組織)；烘蠟條件為65～75 ℃ 120 min，組織不會(huì)脫片，但是太耗時(shí)，影響病理診斷時(shí)效(DAKO公司的烘蠟總時(shí)長也會(huì)超過120 min)。本科室對不同的烘蠟條件進(jìn)行試驗(yàn)，并通過130種抗體，歷經(jīng)8個(gè)月完成56 000張切片的實(shí)用測試，發(fā)現(xiàn)65 ℃ 120 min、75 ℃ 60 min、85 ℃ 30 min均是可行的免疫組化烘蠟條件，綜合考慮烘蠟時(shí)間，認(rèn)為85 ℃ 30 min對免疫組化結(jié)果影響較小、效果佳，值得臨床推廣應(yīng)用，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院病理科存檔的乳腺組織蠟塊(HER-2 3+)和子宮頸錐切組織蠟塊各30例。正電荷親水型防脫載玻片1號(漳州武德生物公司，U-004)，正電荷親水型防脫載玻片2號(日本松浪公司，PRO-04)，正電荷親水型防脫載玻片3號(Dako公司，K8020)。電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械公司，GZX-GF-MBS-2)。羅氏全自動(dòng)免疫組化染色儀(BenchMark ULTRA IHC/ISH Staining Module)。PR(羅氏公司，790-4296 E22157)，HER-2(羅氏公司，790-4493 E16719)，Ki-67(羅氏公司，790-4286 E30677)，EMA(福州邁新公司，Kit-001119040205 816)，EDTA抗原修復(fù)液(福州邁新公司，MVS-0098190314 4251)，蘇木精(福州邁新公司，CTS-1090 1903190459)，UltraView Universal DAB(羅氏公司，790-500 E18998)。

1.2 方法上述組織蠟塊4 μm厚切片，分別裱貼于上述防脫載玻片，分組烘片(表1)。

表1 組織切片分組和組織防脫試驗(yàn)

1.2.1 組織防脫試驗(yàn)上述分組烘片常規(guī)脫蠟水化，用EDTA(pH 9.0)高壓抗原熱修復(fù)(壓力鍋噴汽2 min，棄火置5 min，冷水浴至室溫)，蘇木精染色，干燥封片，觀察組織的完整性，組織有破損為(+)，組織完好為(-)。

1.2.2 烘蠟溫度試驗(yàn)烘蠟時(shí)間為60 min，烘蠟溫度分別為75、85、95 ℃的分組，烘蠟條件65 ℃ 120 min為對照組，選用正電荷親水型防脫載玻片1號(漳州武德生物公司，U-004)，在羅氏全自動(dòng)免疫組化染色儀上進(jìn)行PR、EMA、Ki-67、HER-2的免疫組化染色，與對照組比較，觀察顯色強(qiáng)弱情況和顯色定位情況，以判斷組織抗原在不同的烘蠟溫度下是否有影響。

1.2.3 烘蠟時(shí)間試驗(yàn)烘蠟溫度為85 ℃，烘蠟時(shí)間分別為30 min、60 min、120 min、24 h的分組，烘蠟條件85 ℃ 30 min為對照組，選用正電荷親水型防脫載玻片1號(漳州武德生物公司，U-004)，在羅氏全自動(dòng)免疫組化染色儀上進(jìn)行PR和HER-2免疫組化染色，與對照組比較，觀察顯色強(qiáng)弱和顯色定位情況，以判斷組織抗原在不同烘蠟時(shí)間下是否有影響。

1.2.4實(shí)用性試驗(yàn) 以85 ℃ 30 min作為烘蠟條件，選用正電荷親水型防脫載玻片1號(漳州武德生物公司，U-004)，在羅氏全自動(dòng)免疫組化染色儀上，抗體包括ER、PR、HER-2、CD20、ALK(D5F3)、CD117、DOG1、PD-L1、Syn、CgA、Ki-67、p53等130種，耗時(shí)8個(gè)月對56 000張切片進(jìn)行免疫組化染色，上述12種抗體均同片貼陽性外對照，其它抗體作陽性外對照，觀察顯色強(qiáng)弱和顯色定位情況，并觀察組織的完整性，判斷130種抗體在85 ℃ 30 min烘蠟條件下的免疫組化染色是否正常顯色和組織防脫性。

2 結(jié)果

2.1 組織防脫試驗(yàn)結(jié)果烘蠟條件：溫度65 ℃，時(shí)間≥120 min，或溫度75 ℃，時(shí)間≥60 min，或溫度85 ℃，時(shí)間≥30 min，或溫度95 ℃，時(shí)間≥15 min，組織均完好不脫片；溫度65 ℃，時(shí)間<120 min，或溫度75 ℃，時(shí)間<60 min，或溫度85 ℃，時(shí)間<30 min，組織均會(huì)有不同程度脫片；不同公司三種防脫載玻片在相同的烘蠟條件下，組織防脫性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.2 烘蠟溫度試驗(yàn)結(jié)果烘蠟時(shí)間為60 min，烘蠟溫度分別為75、85、95 ℃的PR、EMA、HER-2和Ki-67的免疫組化染色結(jié)果與對照組比較，顯色強(qiáng)弱情況和顯色定位情況差異無顯著性(圖1)。

圖1 A.對照組HER-2：烘蠟條件65 ℃ 120 min；B.試驗(yàn)組HER-2：烘蠟條件75 ℃ 60 min；C.試驗(yàn)組HER-2：烘蠟條件85 ℃ 60 min；D.試驗(yàn)組HER-2：烘蠟條件95 ℃ 60 min

2.3 烘蠟時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果烘蠟溫度為85 ℃，烘蠟時(shí)間分別為60、120 min的PR和HER-2免疫組化染色結(jié)果與對照組比較，顯色強(qiáng)弱和顯色定位情況差異無顯著性。烘蠟時(shí)間為24 h的PR和HER-2免疫組化染色結(jié)果與對照組比較，顯色有輕微減弱，顯色定位情況差異無顯著性(圖2)。

圖2 A.對照組HER-2：烘蠟條件85 ℃ 30 min；B.試驗(yàn)組HER-2：烘蠟條件85 ℃ 60 min；C.試驗(yàn)組HER-2：烘蠟條件85 ℃ 120 min；D.試驗(yàn)組HER-2：烘蠟條件85 ℃ 24 h

2.4 實(shí)用性分析烘蠟條件為85 ℃ 30 min，130種抗體的陽性對照組織的免疫組化染色顯色強(qiáng)，定位準(zhǔn)確，56 000張切片免疫組化染色均能正確輔助病理診斷，并且組織均完整無脫片。

3 討論

由于免疫組化切片的烘蠟條件目前無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，免疫組化技師常使用的烘蠟條件是65 ℃ 60 min，結(jié)果顯示有些組織易脫片。組織防脫試驗(yàn)證明免疫組化可行的烘蠟條件是65 ℃ 120 min，或75 ℃ 60 min，或85 ℃ 30 min，或95 ℃ 15 min。

3.1 烘蠟溫度烘蠟條件為95 ℃ 60 min，對組織抗原的不利影響不顯著。脫蠟后的組織切片經(jīng)65 ℃ 60 min，則組織抗原被明顯破壞。因此，作者認(rèn)為組織抗原在熔蠟的保護(hù)下，能夠耐受95 ℃ 60 min。因此，免疫組化烘蠟條件為85 ℃ 30 min，對組織抗原是安全的。

3.2 烘蠟時(shí)間烘蠟條件為85 ℃ 120 min，對組織抗原的不利影響不顯著；烘蠟條件為85 ℃ 24 h，會(huì)使組織抗原輕微的損失。因此，烘蠟溫度為85 ℃時(shí)，烘蠟時(shí)間<120 min，對組織抗原是安全的。

3.3 實(shí)用性烘蠟條件為85 ℃ 30 min，經(jīng)本免疫組化室8個(gè)月56 000張切片的實(shí)用免疫組化染色，130種抗體的陽性外對照均強(qiáng)顯色，準(zhǔn)確定位。實(shí)踐證明烘蠟條件為85 ℃ 30 min對組織抗原幾乎沒有損壞，切實(shí)可行，為免疫組化染色縮短了時(shí)間，可提高病理診斷的效率。

3.4 注意事項(xiàng)干燥箱應(yīng)提前升溫到恒定85 ℃。干燥箱門打開時(shí)間不宜太長，以免溫度驟降。計(jì)時(shí)期間，為了恒定85 ℃，干燥箱門不宜打開。正在烘蠟的多架切片不宜緊密排列，架子之間要有適當(dāng)間隔，從而使所有切片快速均勻受熱。

綜上所述，65 ℃ 120 min、75 ℃ 60 min、85 ℃ 30 min均是可行的免疫組化烘蠟條件，考慮烘蠟時(shí)間，認(rèn)為85 ℃ 30 min對免疫組化結(jié)果影響小、效果佳，是值得推廣應(yīng)用的烤片溫度和烤片時(shí)間，各單位可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。