超聲組織處理儀在胃鏡標本HE及幽門螺桿菌PCR檢測中的應用

向 雙，段 松，袁懷志，沈昌瓊

近年來，大量研究顯示我國高達50%人群感染幽門螺桿菌(helicobacter pylori, HP)。隨著內(nèi)鏡技術在各級醫(yī)院的廣泛開展，胃鏡已成為常規(guī)體檢項目。對于胃鏡初步檢查有問題的患者需進一步行病理檢查明確診斷，但出具病理報告需較長時間。為滿足患者對報告時限的需求，有的病理科會根據(jù)組織類型和大小編輯不同處理程序或更換不同的處理試劑[1]，來加快報告速度，但耗時也需10～14 h，而運用快速超聲組織處理技術則不到2 h。目前，快速組織處理儀的應用已經(jīng)有相關報道，但對于在常規(guī)工作中量大且時限要求短的胃鏡組織中卻鮮有報道。本實驗選取同一組織來源的胃鏡標本使用超聲組織處理技術，觀察其處理效果能否達到與傳統(tǒng)方式一樣效果，并對HE染色和HP檢測結(jié)果進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織來源 選取重慶大學附屬三峽醫(yī)院病理科，2019年6月內(nèi)鏡醫(yī)師診斷為胃炎并送檢2塊胃組織的患者，共40例80個蠟塊，分為實驗組和常規(guī)組，每組40個蠟塊。其中男性23例，年齡(59±10)歲；女性17例，年齡(56±11)歲。

1.1.2主要儀器和試劑 常規(guī)組：賽默飛Excelsior AS自動組織脫水機、10%中性福爾馬林(無錫江原實業(yè)公司)、無水乙醇(重慶川東化工公司)、環(huán)保透明劑[2](武漢宏茲生物公司)、切片石蠟56～58 ℃(滬試)。實驗組：深圳美雅潔MAGTS-1200超聲快速組織處理儀、美雅潔組織固定、脫水、透明三合一復合試劑、切片石蠟56～58 ℃(滬試)。熒光定量儀：賽默飛Qubit4.0、羅氏CobasZ480熒光定量PCR分析儀、DAKO CoverStainer全自動HE染色機、石蠟包埋組織基因組DNA提取試劑盒(北京厚生博泰公司)、HP核酸檢測試劑盒(北京新基永康公司)。

1.2 方法

1.2.1取材方法 將同一患者胃竇部位2塊組織，取材時分別放入2個包埋盒，每盒一塊，分為常規(guī)組和實驗組，實驗組在編號后加字母S便于區(qū)分。

1.2.2組織處理方法 常規(guī)組：采用常規(guī)程序，經(jīng)賽默飛Excelsior AS自動組織脫水機進行處理，全部完成需要約14 h。實驗組：采用快速超聲組織處理儀。(1)開啟儀器，將標本放入脫水缸；(2)選擇內(nèi)鏡組織程序，儀器加熱至20 ℃處理8 min，加熱至50 ℃處理40 min，自動降溫到35 ℃處理4 min，即完成固定脫水透明；(3)將標本架轉(zhuǎn)入蠟缸，啟動浸蠟程序，62 ℃處理5 min，63 ℃處理10 min。全部完成共需約70 min。兩組處理完成后均進行包埋切片，所用試劑和處理程序見圖1。

圖1 兩種處理儀流程圖

1.2.3HE染色 每個蠟塊連續(xù)4 μm厚切片3張攤在一張玻片上。同時上載到Dako CoverStainer自動染色機[3]，選擇相同程序進行染色。

1.2.4DNA提取及濃度檢測 將每個蠟塊均連續(xù)5 μm厚切片10張，放入EP管中，此過程每切1個標本均進行清潔消毒，防止交叉污染。石蠟包埋組織基因組DNA提取按試劑盒說明書操作。提取完成后，將每例樣本使用熒光定量儀檢測DNA濃度，并編號登記。

1.2.5PCR檢測 使用羅氏CobasZ480PCR分析儀進行檢測，HP核酸檢測[4]按照試劑盒說明書進行程序設定。將兩組共80例樣本全部上機，按編號順序依次加樣至96孔位PCR反應板。每批次加陰性、陽性、臨界陽性3個外標對照品。實驗全程按照同一操作規(guī)程進行，嚴格遵守臨床基因擴增檢驗工作導則及實驗操作規(guī)范。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果兩組切片均用HE自動染色機染色，共80張切片，經(jīng)1名技師、1名醫(yī)師根據(jù)《臨床技術操作規(guī)范(病理學分冊)》切片質(zhì)量標準結(jié)合染色滿意度、切片完整無刀痕等指標進行盲評打分。73張切片評分達90分，為甲級片。7張切片未達到甲級標準。兩組HE染色效果見圖2、3，兩組甲級片符合率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。

圖2 常規(guī)組HE染色 圖3 實驗組HE染色

表1 兩組HE、PCR檢測結(jié)果

2.2 DNA濃度結(jié)果80個標本均成功提取DNA，依次使用賽默飛Qubit4.0熒光定量儀進行DNA濃度測定，所得結(jié)果中有6個標本濃度低于50 ng/μL，兩組結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表2)。

表2 兩組DNA濃度

2.3 PCR檢測結(jié)果兩組標本各40例使用羅氏CobasZ480 PCR分析儀進行檢測，根據(jù)PCR反應圖(圖4、5)可以看出兩組中內(nèi)部質(zhì)控曲線在FAM和VIC兩種熒光素下信號均有明顯增長，有典型的S曲線，且Ct值<35.00表現(xiàn)出良好一致性。兩組結(jié)果根據(jù)標準判讀，其陽性檢出率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。

圖4 兩組PCR反應圖FAM通道

圖5 兩組PCR反應圖VIC通道

3 討論

組織標本前固定在整個病理流程中至關重要，是常規(guī)診斷及后續(xù)免疫組化和分子檢測的前提。這就必須保證取材前固定時間充足[5]，因此兩組標本均是在鉗取組織后立即固定于10%中性福爾馬林。每組標本所用處理程序保持不變，對試劑濃度進行嚴格監(jiān)測，確保標本處理質(zhì)量。本組特選取同一病例、多塊組織的標本作為分析對象，排除組織異質(zhì)性對實驗結(jié)果的干擾[6]。兩組HE染色共有7例未達甲級片標準，分析原因是由于取材部位不佳標本量少，導致切片染色不佳；兩組各有3例DNA濃度低于50 ng/μL，其原因是標本體積過小，組織處理后效果較差DNA含量較低。兩組方法從取材到PCR檢測均同一人員按相同標準流程操作，保證了實驗過程的一致性。綜上，通過比較分析可以發(fā)現(xiàn)胃鏡標本使用兩種不同的組織處理儀，其HE染色表現(xiàn)、PCR反應曲線情況以及CT值各指標均無明顯差異，與熊克美等[7]的報道相符。此項技術的應用可以較大程度彌補傳統(tǒng)組織處理儀的缺點，能有效解決病理科常規(guī)工作中門診報告及時性的問題。為將來HP的精準治療個體化用藥檢測提供了相關經(jīng)驗，有了快速發(fā)出報告的基礎條件，通常1～2天就能出具常規(guī)和分子檢測報告[8]。在病理科實驗室建設的大環(huán)境下，該方法能解決工作所需，可滿足患者迫切取報告的需求，有較好的經(jīng)濟效益和社會效益，值得推廣應用。