RET/RAS/BRAF基因驅(qū)動(dòng)甲狀腺乳頭狀癌共表達(dá)關(guān)鍵基因的生物信息學(xué)分析

仇以利，陳一峰，楊金玲，張宏圖

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是甲狀腺最常見的惡性腫瘤，部分地區(qū)的發(fā)病率10年增長(zhǎng)了近10倍[1]，胞外信號(hào)→RET/RAS/BRAF→MAPK轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是PTC最常見的致癌機(jī)制，RET/RAS/BRAF這三個(gè)分子事件間互相排斥。當(dāng)前腫瘤分子演進(jìn)機(jī)制探索已從單基因單通路發(fā)展到多基因多通路。本實(shí)驗(yàn)利用生物信息學(xué)方法分析RET/RAS/BRAF驅(qū)動(dòng)PTC的共表達(dá)基因，從中尋找關(guān)鍵基因，旨在獲得更多PTC發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)分子標(biāo)志物，為PTC的精準(zhǔn)危險(xiǎn)度分層進(jìn)一步拓寬有關(guān)基因變異，有利于針對(duì)放射性碘難治性或手術(shù)不能切除的PTC患者靶向藥物的研發(fā)、篩選及預(yù)期效果的評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集及樣本收集在基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus database, GEO)的網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索“papillary thyroid carcinoma AND normal AND Homo sapiens”，根據(jù)目的選取數(shù)據(jù)集GSE58545，芯片源于GPL96[HG-U133A] Affymetrix Human Genome U133A Array，其包括正常甲狀腺組織18例，PTC組織27例，后者包含BRAF基因突變者(BRAF+)18例、RET基因突變者(RET+)8例、RAS基因突變者(RAS+)1例。

1.2 差異表達(dá)基因篩選在GEO網(wǎng)站運(yùn)用GEO2R對(duì)話框搜索所有樣品后，設(shè)定分組，包括BRAF+對(duì)比正常甲狀腺組織、RET+對(duì)比正常甲狀腺組織、RAS+對(duì)比正常甲狀腺組織三組，然后借助R及Limma包進(jìn)行線上基因表達(dá)差異分析，導(dǎo)出所有結(jié)果。將2為底數(shù)取值差異倍數(shù)(fold change, FC)，以校正后的P值<0.01，|log2FC|≥2為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因，把3組篩選所得基因名稱導(dǎo)入Draw Venn Diagrams在線工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，交集三組的共同表達(dá)基因。

1.3 基因本體(Gene Ontology, GO)功能分析和通路富集分析打開Metascape主頁(yè)(http://metascape.org)，在對(duì)話框提交所篩選的交集基因，在物種選項(xiàng)欄中選擇H.sapiens，點(diǎn)擊custom analysis進(jìn)行自定義分析，包含GO功能、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)信號(hào)通路、反應(yīng)組學(xué)基因集(Reactome gene sets)和經(jīng)典通路(Canonical Pathways)等富集分析，把Min Overlap、P Value Cutoff、Min Enrichment值分別設(shè)置為3、0.01、1.5，系統(tǒng)隨之劃分基因類別、構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。

1.4 Cytoscape軟件和STRING網(wǎng)絡(luò)分析關(guān)鍵基因打開STRING(http：//www.string-db.org/)官方網(wǎng)站，在“SEARCH”對(duì)話框輸入所篩選的基因名稱，數(shù)據(jù)庫(kù)(Version 11.0)將可視化輸出富集網(wǎng)絡(luò)圖，保存TSV格式的結(jié)果文件。同時(shí)下載Cytoscape軟件及Cytohubba插件，把TSV文件導(dǎo)入軟件中，挖掘關(guān)鍵基因。

1.5 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析關(guān)鍵基因的表達(dá)登陸Oncomine(www.oncomine.org)網(wǎng)站，在“search”對(duì)話框中輸入關(guān)鍵基因名稱，在“Primary Filters”目錄下根據(jù)需要依次點(diǎn)擊選擇具體類別，設(shè)置分析參數(shù)為：P-value<0.05，F(xiàn)old change≥2，gene rank=top 10%，分別檢索上述每個(gè)基因在單個(gè)或多個(gè)PTC數(shù)據(jù)集的整合表達(dá)。

1.6 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中驗(yàn)證關(guān)鍵基因在PTC中的表達(dá)趨勢(shì)及與臨床病理的聯(lián)系登陸Ualcan TCGA analysis網(wǎng)頁(yè)(http：//ualcan. path. uab. edu/)，訪問甲狀腺癌基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，其中包括正常甲狀腺組織59例，PTC 505例(經(jīng)典型358例、高細(xì)胞亞型36例、濾泡亞型102例、其他亞型9例)，進(jìn)一步驗(yàn)證關(guān)鍵基因在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)PTC中的差異表達(dá)情況，獲取關(guān)鍵基因表達(dá)的臨床病理因素。

1.7 HPA數(shù)據(jù)庫(kù)分析PTC中關(guān)鍵基因編碼蛋白的表達(dá)登陸HPA網(wǎng)站(https//www.proteinatlas.org/)，在搜索框中輸入關(guān)鍵基因的名稱，點(diǎn)擊腫瘤欄，查看在PTC中的免疫組化酶標(biāo)表達(dá)情況，亦可顯示在細(xì)胞系的定位。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果應(yīng)用GEO2R工具，點(diǎn)擊value distribution，先確認(rèn)芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，共有45例樣本，再以預(yù)先設(shè)定的閾值，BRAF+組18例、RET+組8例、RAS+組1例對(duì)比正常甲狀腺組織18例，分別篩選出差異表達(dá)基因310、824、280個(gè)，通過韋恩圖交集得出共表達(dá)基因34個(gè)(圖1)：KCNJ2、GDF15、MET、SOX4、COL1A1、DPP4、MUC1、RYR1、CITED1、TENM1、RUNX1、TYMS、GALNT7、PTP4A3、SCEL、NELL2、HMGA2、PDZK1IP1、RXRG、TUSC3、MDK、SPINT1、BHLHE40、TGFA、PHLDA2、ENTPD1、NRCAM、TBC1D2、RAB27A、LRP4、CLDN1、TESC、SCG5、PSD3。

圖1 差異表達(dá)基因交集的韋恩圖

2.2 差異表達(dá)基因的富集分析結(jié)果應(yīng)用Metascape對(duì)34個(gè)共表達(dá)差異基因進(jìn)行功能及通路分析，發(fā)現(xiàn)被顯著富集的相關(guān)基因與16條GO通路、1條KEGG通路、1條Reactome通路和1條Canonical通路相關(guān)，其中GO通路涉及生物過程調(diào)控功能14項(xiàng)、分子功能2項(xiàng)，按照P值從小到大，生物過程依次包含從皮膚的發(fā)育到細(xì)胞對(duì)非生物刺激的反應(yīng)(圖2)。分子功能包含肝素及鈣離子的結(jié)合功能。KEGG、Canonical、Reactome通路分析分別顯示共表達(dá)基因參與PTC的基因轉(zhuǎn)錄失調(diào)、p53蛋白誘導(dǎo)死亡結(jié)構(gòu)域的下游通路和MET信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

圖2 生物過程GO富集通路熱圖：顏色越深富集越顯著，P值越小

2.3 關(guān)鍵基因的篩選應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)出共表達(dá)基因編碼蛋白質(zhì)間的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)，應(yīng)用Cytoscape軟件、Cytohubba插件，采用MCC算法，篩選出10個(gè)關(guān)鍵基因，按節(jié)點(diǎn)排名分為三組：第一組為MET；第二集團(tuán)為DPP4、ENTPD1、MUC1、SPINT1；第三集團(tuán)為BHLHE40、CLDN1、GALNT7、TGFA、TYMS(圖4)。

圖3 共表達(dá)基因編碼蛋白質(zhì)互作圖

圖4 關(guān)鍵基因排序及蛋白質(zhì)互作圖：紅色為第一組基因；磚紅色為第二集團(tuán)基因；黃色為第三集團(tuán)基因

2.4 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析關(guān)鍵基因的表達(dá)應(yīng)用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)依次對(duì)10個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行多數(shù)據(jù)集整合檢索，庫(kù)中所有包含PTC的5個(gè)數(shù)據(jù)集均被納入研究，得出每個(gè)基因的中位秩及P值，這10個(gè)基因在PTC中的表達(dá)均顯著高于正常甲狀腺組織(P<0.01)。

2.5 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證PTC中關(guān)鍵基因的表達(dá)應(yīng)用Ualcan網(wǎng)站挖掘10個(gè)關(guān)鍵基因在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中PTC中的差異表達(dá)情況，相比于正常組織，PTC中MET、DPP4、ENTPD1、MUC1、SPINT1、BHLHE40、CLDN1、GALNT7、TGFA、TYMS基因的mRAN表達(dá)顯著增加(P<0.01)。除了ENTPD1、TGFA、TYMS基因，其他關(guān)鍵基因mRNA的表達(dá)與PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.01)。

2.6 HPA數(shù)據(jù)庫(kù)分析PTC中關(guān)鍵基因編碼蛋白的表達(dá)從HPA網(wǎng)站(www.proteinatlas.org)瀏覽10個(gè)關(guān)鍵基因編碼蛋白在正常甲狀腺組織和PTC癌細(xì)胞中的表達(dá)圖像，MET、DPP4、ENTPD1、MUC1、SPINT1蛋白在PTC中呈陽(yáng)性，表達(dá)于PTC細(xì)胞質(zhì)/膜；BHLHE40、CLDN1、GALNT7、TGFA、TYMS蛋白在PTC中呈陽(yáng)性，其中BHLHE40在癌細(xì)胞核中弱至中等強(qiáng)度表達(dá)，余蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)/膜；而在正常甲狀腺組織中均未見陽(yáng)性染色。

3 討論

近30年來(lái)全球甲狀腺癌的發(fā)病率增加了3倍[2]，在長(zhǎng)期隨訪中發(fā)現(xiàn)超過25%的PTC患者發(fā)生復(fù)發(fā)[3]，RET、RAS和BRAF三者是PTC最常見的驅(qū)動(dòng)基因[4]，cBioPortal數(shù)據(jù)顯示高達(dá)83%的PTC檢測(cè)出MAPK通路的異?；罨鼈儽舜碎g幾乎不發(fā)生重疊突變[5]。近70%PTC發(fā)生BRAF、RAS或RET基因突變：36%～83%PTC發(fā)生BRAF突變[5]；13%～25% PTC發(fā)生RET基因重排[6]，近年其發(fā)生率逐步降低，低至5%[7]；約13%PTC發(fā)生RAS基因突變[5]，近幾年其突變發(fā)生率增長(zhǎng)較快，尤其在濾泡型PTC中的突變率達(dá)25%[8]。進(jìn)入二十一世紀(jì)以來(lái)腫瘤基因和蛋白質(zhì)分子數(shù)據(jù)的爆發(fā)性增長(zhǎng)和相應(yīng)臨床病理資料采集的規(guī)?；?、集約化，隨著生物信息技術(shù)在解析醫(yī)學(xué)大數(shù)據(jù)的交融和滲透，為進(jìn)一步拓展RET/RAS/BRAF基因驅(qū)動(dòng)PTC的上下游相關(guān)分子，本組以包含18例正常甲狀腺組織、18例BRAF+、8例RET+、1例RAS+PTC組織的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集芯片為研究對(duì)象[9]，篩選出共表達(dá)基因34個(gè)：KCNJ2、GDF15、MET、SOX4、COL1A1、DPP4、MUC1、RYR1、CITED1、TENM1、RUNX1、TYMS、GALNT7、PTP4A3、SCEL、NELL2、HMGA2、PDZK1IP1、RXRG、TUSC3、MDK、SPINT1、BHLHE40、TGFA、PHLDA2、ENTPD1、NRCAM、TBC1D2、RAB27A、LRP4、CLDN1、TESC、SCG5、PSD3?；贛etascape大數(shù)據(jù)全面分析和解釋組學(xué)研究結(jié)果[10]，其中GO分析工具標(biāo)準(zhǔn)化展現(xiàn)了這些歸集基因參與皮膚的發(fā)育、骨骼系統(tǒng)的發(fā)育、對(duì)類固醇激素的反應(yīng)、整合素介導(dǎo)細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)、對(duì)酸性化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)、發(fā)育性生長(zhǎng)、細(xì)胞周期阻滯的正向調(diào)控、體液水平的調(diào)節(jié)、進(jìn)入宿主細(xì)胞、解剖結(jié)構(gòu)的成熟、蛋白質(zhì)的糖基化、激素分泌的調(diào)節(jié)、衰老、細(xì)胞對(duì)非生物刺激的反應(yīng)共14項(xiàng)生物過程調(diào)控功能，還涉及肝素與鈣離子的結(jié)合功能兩項(xiàng)分子功能調(diào)控。而KEGG、Canonical、Reactome通路分析顯示它們分別與轉(zhuǎn)錄失調(diào)、p53蛋白調(diào)控免疫球蛋白死亡結(jié)構(gòu)域、MET信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件有關(guān)。STRING v11.0是目前在線分析蛋白質(zhì)間相互作用的最新版本[11]，在STRING互作網(wǎng)絡(luò)中共發(fā)現(xiàn)2個(gè)關(guān)鍵基因模塊，分別包含8個(gè)、2個(gè)基因，進(jìn)一步應(yīng)用Cytoscape軟件、Cytohubba插件，把這10個(gè)關(guān)鍵基因按節(jié)點(diǎn)排名分為三組：第一組為MET；第二集團(tuán)為DPP4、ENTPD1、MUC1、SPINT1；第三集團(tuán)為BHLHE40、CLDN1、GALNT7、TGFA、TYMS，從Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)可視化的直觀結(jié)果可以看出10個(gè)關(guān)鍵基因在PTC中的表達(dá)均顯著高于正常甲狀腺組織。

MET編碼產(chǎn)物通過PI3K-AKT-mTOR和RAS-RAF-MEK-ERK途徑參與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等過程[12-13]，作為本組篩出的首選關(guān)鍵基因，在其他的研究也證實(shí)MET基因mRNA及編碼蛋白在PTC中的表達(dá)均明顯高于良性病變組[14]。DPP4蛋白又稱CD26，是一種細(xì)胞表面的絲氨酸蛋白酶，其在PTC組織中高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和浸潤(rùn)，PTC患者血液中可溶性CD26水平顯著高于甲狀腺良性病變者及健康對(duì)照者[15]。MUC1基因編碼的黏蛋白主要表達(dá)于正常上皮細(xì)胞近官腔或腺腔面，而在PTC細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)異常表達(dá)[16]，MUC1蛋白高表達(dá)與淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移、甲狀腺外侵行為的發(fā)生密切相關(guān)[17]。CLDN1基因編碼產(chǎn)物是一種細(xì)胞間緊密連接跨膜蛋白，TGFA基因編碼的生長(zhǎng)因子，作為表皮生長(zhǎng)因子受體的配體，它們均可參與PTC的遷移與侵襲性生長(zhǎng)[18-19]。據(jù)報(bào)道61%～68%PTC高表達(dá)SPINT1，其實(shí)SPINT1能調(diào)節(jié)細(xì)胞去適應(yīng)活性基質(zhì)金屬酶的溶解作用，而且還能誘導(dǎo)缺氧條件下的細(xì)胞遷移、侵襲[20]。這充分說(shuō)明了本組挖掘的MET、DPP4、MUC1、CLDN1、TGFA、SPINT1基因在PTC中的表達(dá)及其機(jī)制得到了相應(yīng)研究報(bào)道的佐證。除此之外，本文發(fā)現(xiàn)ENTPD1、BHLHE40、GALNT7、TYMS與PTC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，目前尚無(wú)類似的研究報(bào)道。從Ualcan網(wǎng)站挖掘這10個(gè)基因在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)PTC中的差異表達(dá)情況，也得出同樣的結(jié)果；在HPA數(shù)據(jù)庫(kù)檢索上述10個(gè)基因編碼蛋白在PTC中均呈高表達(dá)。此外本組發(fā)現(xiàn)除了ENTPD1、TGFA、TYMS基因，其他7個(gè)基因mRNA表達(dá)與PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用GEO、Metascape、Cytoscape、STRING、Oncomine、Ualcan及HPA公共數(shù)據(jù)庫(kù)綜合分析RET/RAS/BRAF基因驅(qū)動(dòng)PTC的10個(gè)共表達(dá)關(guān)鍵基因，結(jié)果表明它們相對(duì)應(yīng)的mRNA及蛋白在PTC組織中的表達(dá)均顯著高于正常甲狀腺組織，且是PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵基因。經(jīng)檢索Pubmed、萬(wàn)方數(shù)據(jù)知識(shí)平臺(tái)等，目前在PTC的研究中尚未見ENTPD1、BHLHE40、GALNT7和TYMS分子的報(bào)道，這將為參與RET/RAS/BRAF基因驅(qū)動(dòng)PTC的分子家庭注入新成員，它們有望成為難治性PTC患者的潛在分子靶點(diǎn)。